Informacija

Kako je genska terapija uspjela izliječiti bolesti transformacijom stanica koje se aktivno dijele?

Kako je genska terapija uspjela izliječiti bolesti transformacijom stanica koje se aktivno dijele?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mislio sam da genska terapija, kada se provodi na ciljnim stanicama koje se neprestano regeneriraju, može biti učinkovita samo ograničeno vrijeme. Tj., Učinak postupno nestaje nakon nekog vremena, ovisno o tome koliko brzo se ciljne stanice obnavljaju. Drugim riječima, pacijent mora svako toliko nastaviti primati gensku terapiju kako bi postigao željeni učinak.

S druge strane, kada ciljaju stanice koje se ne dijele/obnavljaju, poput oka, genska terapija može i zapravo je izliječila sljepoću jednom zauvijek, pa pacijentu više nisu potrebne injekcije genske terapije.

Što je s ostalim bolestima koje je genska terapija navodno izliječila? Mislim da uključuju poremećaje krvi poput hemofilije i neke ozbiljne poremećaje imunološkog sustava? Mislio sam da uglavnom uključuju stanice koje se regeneriraju, poput koštane srži i jetre?


Kratak odgovor
Stanice koje se dijele i ne dijele se mogu trajno modificirati genskom terapijom pomoću vektora koji svoj korisni teret ugrađuju u kromosomsku DNA domaćina

Pozadina
Genska terapija zasnovana na vektorima može se primijeniti pomoću vektora, poput modificiranih retrovirusa ili adenovirusa, koji svoj korisni teret ugrađuju u kromosom domaćina.

Bez obzira na to da li se transformirane stanice repliciraju da ili ne, roditelj, kao i sve moguće stanice kćeri, nosit će novu DNA. Na primjer, imunodeficijencija se uspješno liječila genskom terapijom, ali prva su ispitivanja rezultirala karcinomom kostiju krvi, jer su se matične stanice počele nekontrolirano razmnožavati, pa se stanice koje se dijele definitivno mogu trajno transformirati. Zapravo, kada se stanice zametne linije transformiraju na ovaj način, čak će i potomci domaćina to naslijediti.

Izvori
- Američko liječničko udruženje
- Naučite genetiku
- Sveučilište Utah


Genska terapija

Genska terapija je brzo rastuće područje medicine u kojem se geni unose u tijelo za liječenje bolesti. Geni kontroliraju nasljednost i pružaju osnovni biološki kod za određivanje specifičnih funkcija stanice. Genska terapija nastoji osigurati gene koji ispravljaju ili istiskuju funkcije za kontrolu bolesti stanica koje u biti ne rade svoj posao. Somatska genska terapija uvodi terapijske gene na tkivnoj ili staničnoj razini za liječenje određene osobe. Genska terapija zametnom linijom ubacuje gene u reproduktivne stanice ili eventualno u embrije kako bi ispravila genetske nedostatke koji bi se mogli prenijeti na buduće generacije. U početku zamišljen kao pristup liječenju nasljednih bolesti, poput cistična fibroza i Huntingtonove bolesti, opseg potencijalnih genskih terapija narastao je tako da uključuje tretmane za karcinom, artritis i zarazne bolesti. Iako je testiranje genske terapije na ljudima brzo napredovalo, mnoga pitanja okružuju njegovu upotrebu. Na primjer, neki su znanstvenici zabrinuti da sami terapijski geni mogu uzrokovati bolest. Drugi strahuju da bi se genska terapija zametnom linijom mogla koristiti za kontrolu ljudskog razvoja na načine koji nisu povezani s bolestima, poput inteligencije ili izgleda.


Genska terapija korak bliže masovnoj proizvodnji

EUREKA projekt E! 3371 Agenti za prijenos gena napravili su veliki napredak u razvoju novih nevirusnih nosača koji mogu unijeti genetski materijal u ciljne stanice. Ovi novi agensi, derivati ​​kationskog amfifilnog 1,4-dihidropiridina (1,4-DHP), izbjegavaju probleme imunološkog sustava primatelja koji reagira na prijenosnika virusa.

Partneri na projektu razvili su metode za njihovu proizvodnju u velikim količinama, što rješava još jedan od problema s isporukom virusa. No najveća je prednost to što su novi spojevi znatno učinkovitiji u isporuci DNK u stanične jezgre od ostalih standardnih sintetičkih nosača što povećava šanse da DNK uspješno kontrolira neispravne gene i bolest.

Genska terapija uključuje umetanje DNA u ljudske stanice u tijelu za liječenje bolesti. Tehnika je još uvijek u povojima, a uspješno se pokazala tek u posljednjem desetljeću. Većina istraživanja se bavila mogućnostima liječenja nasljednih bolesti povezanih s genetskim defektom, a tehnika također ima potencijalnu primjenu u liječenju ranih stadija raka, te u kardiovaskularnim i neurodegenerativnim bolestima.

Genska terapija suočava se s mnogim poteškoćama kao praktična metoda, a posljednja od njih je ta da je DNK velika i komplicirana struktura koju je potrebno isporučiti i pričvrstiti na ispravan dio primateljevog skupa DNK. Brojne metode se koriste ili se istražuju za uvođenje DNK u stanice (proces poznat kao transfekcija) - pomoću virusa, kemijskih sredstava ili fizičkim ubrizgavanjem.

Virusi ili kemijski prijenosnici

Uz prijenosnike virusa, DNA koja se unosi ubrizgava se u virus, koji ga prenosi u stanicu putem vezikula koji oko stanične stjenke stvara virusna čestica. Kad uđe u stanicu, vezikula se razbije i virus ubrizgava DNK u jezgru stanice. Virusni put ipak ima velike nedostatke. Imunološki sustav osobe koja se liječi često ometa virusnu aktivnost i virusi mogu imati nepredvidive mutagene nuspojave. Također je velika proizvodnja virusnih vektora problematična.

Već je poznato da širok raspon kemijskih sredstava može sa DNK formirati kompleks 1,4-DHP i isporučiti ga u stanice primatelja. Ta se sredstva mnogo lakše proizvode u velikim količinama od virusa i obično ne uzrokuju imunološki odgovor. Međutim, oni nisu toliko učinkoviti u uvođenju DNA kao prijenosnici virusa.

Tražeći najbolje od oba svijeta

Izazov s kojim se suočavaju partneri u projektu EUREKA bio je kombinirati učinkovitost virusnih vektora s proizvodnim prednostima i nedostatkom imunološkog odgovora koji pokazuju kemijski agensi. Znanstvenici s latvijskog Instituta za organsku sintezu i sveučilišta Kuopio u Finskoj otkrili su nove skupine mogućih agenasa za prijenos DNA: derivate 1,4-DHP. Utvrđeno je da su ti spojevi učinkovitiji u prijenosu gena od dva široko korištena standardna sredstva za isporuku gena (poznati kao DOTAP i PEI 25), a otkriće je pokriveno patentom. Ovo otkriće nudi uzbudljivu mogućnost bolje učinkovitosti od nevirusnog nositelja.

Profesor Arto Urtti sa Sveučilišta Helsinki (ranije s Kuopija) objašnjava: "Kad su ti spojevi u otopini i dodana im se DNA, oni se vežu zajedno. Velika, labava molekula DNA kolabira i nastaju sitne čestice promjera oko 10-50 nm DNA i nosača. Kada to predstavite stanicama, nanočestice se vežu za staničnu površinu, koja se presavija prema unutra i tvori mjehurić unutar stanice. Čestice zatim bježe iz mjehurića oslobađajući DNK.

Istraživači sa Sveučilišta Helsinki otkrili su da su od svih testiranih spojeva najučinkovitiji oni koji su uspjeli prenijeti DNK u jezgru. Mehanizam kojim DNK ulazi u jezgru još nije jasno shvaćen, ali je poznato da je prijenos gena učinkovitiji u stanicama koje se aktivno dijele, na pr. stanice raka.

Aiva Plotniece, dr. Arkadijs Sobolevs i njihovi kolege s Latvijskog instituta tada su krenuli u sintezu desetaka različitih spojeva derivata DHP -a. Dr Plotniece komentira: "Velika prednost ovih spojeva je biološki aktivan fragment 1,4-DHP, koji uz odgovarajuću zamjenu može pokazati određena biološka i fizikalno-kemijska svojstva. Tijekom projekta osmislili smo različite 1,4-DHP, što nam je omogućilo uspostavu odnosa strukture i aktivnosti ".

Treći projektni partner, neovisni latvijski proizvođač kemikalija Bapeks, dao je svoje iskustvo u sintezi većih razmjera i savjetovao istraživače Latvijskog instituta kako najbolje proširiti metodologiju sinteze. Spojevi su zatim distribuirani nizu drugih kolega istraživača u Latviji, Finskoj i Litvi radi daljnjih studija. Trenutno, partneri na projektu smatraju da će se glavna uporaba koristiti u laboratorijskim pokusima, a potrebno je mnogo daljnjih istraživanja prije nego što se mogu koristiti za prijenos gena u ljudskom tijelu.

Partneri u projektu EUREKA vjeruju da je projekt, iako je potrebno još istraživanja, bio vrlo uspješan. "To je bio prvi veliki i važan projekt za nas", kaže dr. Sobolevs. "Značajno smo proširili potencijalnu uporabu samo-sastavljajućih derivata 1,4-dihidropiridina u nanomedicinu, isporuku gena, pa čak i u sustave za isporuku lijekova." Projektni tim otkrio je da je podrška EUREKE uvelike pomogla u pripremi, upravljanju i izvještavanju o projektu. Također su putem EUREKA -e ostali partneri upoznati s Bapeksom.

Izvor priče:

Materijali osigurani od EUREKA. Napomena: Sadržaj se može uređivati ​​prema stilu i duljini.


Retrovirusi u genskoj terapiji

Retrovirusi su fantastičan alat za gensku terapiju. Genska terapija je način liječenja genetskih bolesti. To je slučaj kada netko ima mutaciju u genu koja dovodi do toga da protein u tijelu slabo funkcionira. Ako je to važan protein, to može dovesti do bolesti. To možete liječiti na različite načine, ali zaista dobar način liječenja te bolesti je otklanjanje genske greške u stanicama koje trebaju taj protein.

Druga uporaba genske terapije koja postaje sve učinkovitija je rak. Dakle, stanice raka rade različite stvari s vašim normalnim tijelom, stanice u vašem tijelu, dijele se vrlo brzo. Oni usisavaju mnogo metabolita, tumor bi mogao rasti krvne žile i slične stvari. Dakle, možete primijeniti gensku terapiju za promjenu imunologije tumora, tako da vaš imunološki sustav može ponovno vidjeti tumor, gdje je tumor isključio svoju sposobnost da ga vidi imunološki sustav. To možete popraviti genskom terapijom.

Genska terapija u osnovi uključuje sposobnost zaraze ciljnih stanica virusom, a taj virus mora sadržavati gen koji želite staviti unutra kako biste ih ili popravili ili učinili tumor vidljivim imunološkom sustavu, na primjer. Za gensku terapiju možete koristiti retroviruse, jer prvo možete napraviti virusne čestice s genomima koji sadrže samo vaš omiljeni gen, a zatim možete zaraziti svoje ciljne stanice. Te zaražene stanice bit će izmijenjene samo umetanjem vašeg ciljnog gena u njihov kromatin. To je sjajno. A retrovirusi su u tome osobito dobri jer ga ubacuju u kromatin. Dakle, kad gen postoji, on je stabilan.

Uz svu gensku terapiju, korak koji ograničava brzinu je jednostavno sposobnost da se gen stavi u prave stanice. Genske terapije koje najbolje djeluju često su one u kojima možete ili ubrizgati virus izravno u mjesto (tako, na primjer, u tumor), ili u slučaju da možete izvaditi stanice iz nečijeg tijela (na primjer , njihove krvne stanice ili stanice koštane srži), modificirati ih inficiranjem virusnim vektorom, a zatim ih vratiti u tijelo. Na taj način postoji relativno jednostavan način za modificiranje ljudskih stanica vektorom genske terapije koji potječe od retrovirusa.

U prvim danima provedena je genska terapija miševim gama retrovirusima. To je bilo uzimanje virusa miša, vađenje gena virusa miša, stavljanje vašeg gena i njegovo korištenje za isporuku gena. To ’ je radilo jako dobro. I još uvijek postoje ispitivanja genske terapije koja koriste virus miša. Problem s mišjim retrovirusom je: on će zaraziti samo stanice koje se aktivno dijele, a postoje mnoge stanice koje želite zaraziti koje se ne dijele posebno (matične stanice se ne dijele jako dobro i raznolikost drugih krvnih stanica da se ne & zaista zarazite gama-retrovirusima).

Povijest genske terapije doista je prošla od razvoja vektora do sofisticiranijih, sigurnijih i zaraznijih. Drugi problem je presađivanje. Dakle, morate biti u mogućnosti vratiti modificirane stanice natrag u tijelo osobe i ne dopustiti da te stanice odmah umru. Testiranje različitih načina provođenja infekcije, kako se vrlo pažljivo brinete o stanicama nakon što ste ih izvadili iz tijela osobe, koliko dugo ih držite izvan tijela, u kojim medijima ih uzgajate i slično. To je velika industrija s ljudima koji pokušavaju pronaći najbolji način da izvade stanice i vrate ih bez ikakvog oštećenja.

Jedna od onih uzbudljivih genskih terapija koje se trenutno odvijaju je ono što se naziva CAR ili receptor himernog antigena. To se temelji na ideji da kad dobijete rak – mislim da se svi slažu da je rak nešto protiv čega se vaš imunološki sustav zaista bori. Tijekom vašeg života karcinom se stvara na pojedinačnoj staničnoj bazi, ali se ubija. Dakle, stanice čine čudne stvari, a vaš imunološki sustav prepoznaje da se događa nešto smiješno i ubija ih. Da bi tumor opstao u vašem tijelu i rastao, mora se promijeniti na takav način da vaš imunološki sustav to ne može vidjeti. To su loše vijesti. Ako vaš imunološki sustav to ne vidi, tumor može rasti.

Ideja CAR terapije je da možete izvaditi stanice iz nečijeg tijela, njihove T-stanice, koje su stanice koje bi mogle ubiti tumorske stanice, a vi možete izmijeniti njihovu specifičnost tako da mogu ponovno vidjeti tumor . To čine čineći takozvani receptor himernog antigena. U biti, receptor T-stanica, koji se nalazi na površini stanice, pliva uokolo tražeći stvari za ubiti. Mijenjate tu molekulu za antitijelo koje specifično prepoznaje rak i spajate to antitijelo s drugom polovicom receptora T-stanica, dijelom koji se nalazi unutar stanice. Kad antitijelo na površini T-stanice veže CAR, receptor himernog antigena, tada aktivira T-stanicu kako bi ubio tumor. A to je fantastično učinkovita terapija kad djeluje. Postoje ljudi koji su se liječili u razdoblju 2015.-2016., Djeca s leukemijama koje se ne bi mogle liječiti na bilo koji drugi način, a ipak im terapija CAR-om može učinkovito dati lijek. Dakle, to je zaista uzbudljivo područje genske terapije koje se trenutno razvija. Zaista počinje raditi.

Budući da je genska terapija način liječenja genetske lezije, ponekad je to jedini način liječenja određene bolesti. Možda ne postoji druga strategija za to. Dakle, jedna od stvarnih vrijednosti genske terapije, mislim da je ona donosi cijeli novi niz mogućnosti liječenja. Nažalost, kako se razvija, vrlo je skupo i vrlo je prilagođeno. Dakle, često otkrijete da možete liječiti samo mali broj pacijenata godišnje, a možda ćete morati tu osobu staviti u bolnicu, možda ćete morati izvaditi stanice iz njezina tijela, možda ćete morati napraviti tretman koji je zaista specifične za njihovu bolest. Dakle, u ovom trenutku genska terapija nije nešto što može biti mainstream, što se može koristiti za liječenje tisuća pacijenata na način na koji to mogu operacija ili drugi tretmani. Mislim da je to jedan od njegovih velikih nedostataka. No kako razvijamo gensku terapiju, sva je prilika da ona može postati glavna terapija.

Mislim da je genska terapija zaista budućnost mnogih stvari, a ne samo genetskih bolesti. Na primjer, postoje načini da se infekcija HIV -om pokuša liječiti genskom terapijom. Ideja bi bila da biste mogli pokušati, pa biste mogli uzeti stanice iz nečijeg imunološkog sustava iz tijela, a zatim ih učiniti neosjetljivima na HIV infekciju, na primjer, zaustavivši ih u stvaranju receptora za HIV CCR5, ili antivirusni gen koji je dio vašeg urođenog imunološkog sustava. Modificirani urođeni imunološki faktor – stavio je da se unutar T-stanica osobe vrate te T-stanice u tijelo, a zatim te t-stanice, te modificirane stanice neće biti zaražene virusom u tijelu . Dakle, te se stanice mogu boriti protiv stanica zaraženih virusom. Teoretski je moguće da bi to mogao biti lijek za jedno liječenje, ali daleko smo od toga. Radi se o poboljšanju naše sposobnosti isporuke gena, o odabiru odgovarajućih gena za liječenje svakog pojedinog poremećaja, a o poboljšanju stvarne isporuke ovih gena radi poboljšanja učinkovitosti isporuke i učinkovitosti cijepljenje, pa se pacijentu učinkovito vraća najveći broj stanica.

Postoje neki rizici s genskom terapijom, a postoje i slučajevi u kojima su ljudi koji su bili inficirani gama-retrovirusima koji kodiraju terapijski gen završili rakom. Nije potpuno jasno zašto je to tako. Mislim da je to kombinacija između činjenice da je gen, terapijski gen, imao određena svojstva i gama-retrovirusa imao određena svojstva, i kada se ta svojstva spoje, što značajno povećava rizik od dobivanja raka.

Te studije koje su otkrile rak i djecu koja su liječena od sindroma imunološkog nedostatka, te su studije bile vrlo zabrinjavajuće, jer su ljudi mislili da bi to moglo ubiti gensku terapiju, možda bismo sada mogli biti u situaciji u kojoj bi rizici i dalje mogli biti preveliki. Dakle, vrlo je važno napraviti gensku terapiju na drugačiji način, na način koji neće uzrokovati rak. Mislim da se to postiže korištenjem malo drugačijeg terapijskog gena i korištenjem drugog vektora. Prelazak na korištenje vektora temeljenih na HIV-u djelomično je uzrokovan činjenicom da je manja vjerojatnost da će uzrokovati rak, jer HIV obično ne uzrokuje rak.

Jedan od rizika u prvim danima bio je da ako se osoba koja se liječi genskom terapijom pomoću vektora HIV -a, što ako se zarazi HIV -om normalnim spolnim prijenosom. To može dovesti do situacije u kojoj virus koji u svom tijelu sadrži mješavinu genoma, genome virusa koji ih je inficirao, plus genom genoma genske terapije. Tada bi mogli zaraziti drugu osobu i taj im se modificirani genom mogao prenijeti. Dakle, ljudi su smislili način da to spriječe. Postoje dijelovi virusa koje možete izrezati, a virus će i dalje djelovati, ali novi virus koji se pojavi ne može to upakirati u virusne čestice. Nazivaju se samoaktivirajućim mutantima i vrlo su sigurni.

Dakle, jedan od problema provođenja genske terapije s retrovirusima, osobito s HIV -om, jest taj što moramo svaki put kad to učinimo transficirati stanice da bismo stvorili vektor. To znači da moramo nabaviti staničnu liniju u laboratoriju, moramo je staviti u bočice i svaki put moramo unijeti virusnu DNA u bočice svježe.To ga čini jako skupim i svaki put kad to učinite morate provjeriti je li ta priprema sigurna i morate napraviti puno regulatornih testova na njoj, što troši neke pripreme i morate je prepravljati svaki put želite liječiti pacijenta.

Ono što bismo htjeli učiniti je razviti staničnu liniju koja sadrži vektor genske terapije i stalno ga proizvodi. Tada bi se virus koji izlazi iz tih stanica mogao koristiti kao lijek, a te stanice možete uzgajati neko vrijeme i stalno stvarati svježi virus. To zahtijeva razvoj stanične linije koja dosljedno proizvodi velike količine retrovirusnog vektora. To je jedan od svetih gralova polja genske terapije za razvoj ove vrste reagensa koji će neprestano osiguravati dosljedan i siguran izvor retrovirusnih vektora unesenih u tijela ljudi. Mislim da je to jedan od velikih izazova.

Drugi veliki izazov je razvoj svakog slučaja genske terapije. Svaka će bolest zahtijevati novi gen, pa morate smisliti koji gen želite koristiti, koju strategiju želite koristiti za liječenje pacijenta. Morate biti u mogućnosti zaraziti desnu stanicu. Mnogo se radi na razvoju novih načina korištenja utvrđenih tehnika genske terapije za liječenje novih bolesti. Mislim da je, kao što sam ranije rekao, jedna od najuzbudljivijih značajki tog rada upotreba vektora genske terapije za liječenje raka.


Vektorsko ciljanje

Ciljanje agenasa genske terapije osobito je važno za kronične autoimune upalne bolesti, budući da je većina njih usredotočena na jednu vrstu tkiva (dok imaju sekundarne sistemske učinke u teškim bolestima). Normalno funkcioniranje imunološkog sustava izvan zahvaćenog organa ili tkiva od vitalnog je značaja za uspješan oporavak pacijenta. Postoji nekoliko načina za postizanje tkivnog specifičnog ciljanja genske terapije. Najjednostavnija je lokalna dostava pretvarača ili ex vivo transducirane stanice. Ostali pristupi uključuju: korištenje tkivno specifičnog navođenja ex vivo transducirane stanice, na primjer, T stanice, 79,132 uvođenje tkivnih specifičnih promotora i pojačivača i na kraju, modifikacija tropizma virusnih čestica, tako da se transduciraju samo stanice koje izražavaju određene površinske markere. Od ovih strategija, samo se posljednje dvije bave izravno samim vektorima i ovdje ćemo ih razmotriti.

Ciljanje s tkivno specifičnim promotorima osigurava da se terapijska ekspresija gena javlja samo u stanicama koje izražavaju transkripcijske faktore koji se vežu na ta specifična mjesta promotora DNA. Neki tkivno specifični promotori koji ciljaju tkiva uključena u autoimune bolesti ili su selektivni za imunološke stanice prikazani su u Tablici 2. Proširenje genomske baze podataka i otkrivanje funkcije gena dovest će do identifikacije drugih tkivno-specifičnih promotorskih elemenata za upotrebu u genu terapiji autoimunih bolesti.

Ciljanje modifikacijom površinskih proteina virusnih vektora pokazalo se mnogo problematičnijim nego što se u početku predviđalo. To je uglavnom bilo zbog činjenice da su se vezivanje virusnih čestica za stanicu i naknadna fuzija lipidnih membrana pokazala kao dva različita procesa, a samo vezivanje nije dovoljno za uspješnu infekciju. U skladu s tim, najperspektivniji eksperimenti s pseudotipiziranjem virusnih vektora doveli su do širenja virusnog tropizma, čak do određene mjere nespecifične transdukcije, kao u slučaju VSV-G, a ne ciljane isporuke transgena u određeni tip stanice.

Za retroviruse i lentiviruse obje faze infekcije olakšava Env protein, a sprezanje između njih uključuje složene interakcije i translokacije različitih domena glikoproteina ovojnice. 133 Izravno ciljanje, odnosno prebacivanje virusnog tropizma na stanični tip potpuno drugačiji od roditeljskog virusa samo je djelomično postignuto uvođenjem dugih razmaka između egzogene domene vezanja i ostatka proteina. 134 Ista je skupina kasnije uvela mjesto cijepanja matriks metaloproteinaze (MMP) u ovaj razmaknik, tako da se može cijepati nakon vezanja, izlažući funkcionalni retrovirusni Env protein. 135 Međutim, ovo nije izravno ciljanje, već ograničenje raspona domaćina, jer zahtijeva prisutnost normalnog retrovirusnog receptora na površini stanice.

Slični rezultati postignuti su uvođenjem motiva vezanja na površinu viriona na mjestima koja ne utječu na vezanje i fuziju posredovanu prirodnim receptorom. Na primjer, prijenos gena u T stanice uvelike je poboljšan uvođenjem na površinu viriona domena antitijela posebno odabranih prikazom faga. 136 Druga strategija, inverzno ciljanje, temeljila se na nalazu da stvaranje nekih parova ligand-receptor sprječava interakciju između proteina Env i retrovirusnog receptora. Epidermalni faktor rasta (EGF) i receptor EGF -a najvažniji su takav par. Dakle, ako se EGF prikaže na retrovirusnoj površini, stanice koje eksprimiraju EGF receptor otporne su na takvu infekciju, dok se ostale stanice još uvijek mogu lako transducirati. Taj se otpor može preokrenuti dodavanjem topljivog EGF -a u sustav. 137 Nedavno su izvedeni slični pokusi s lentivirusima in vivo. Za razliku od neciljanih lentivirusa, koji transduciraju uglavnom stanice jetre bogate receptorima EGF, vektor koji prikazuje EGF inokulira i.v. inficirani uglavnom splenocitima. 138

Strategije za promjenu tropizma Ad vektora usredotočene su na izmjene komponente vlakana virusne kapside kako bi se omogućio CAR-neovisan prijenos tkiva specifičan za gene. Prije svega, ispitivani su proteini vlakana različitih serotipova za pseudotipiziranje vektora Ad. Ovaj pristup je isproban na CD34+ stanicama, 139 DC -a, 140 i HSC -a. 141 Inače, ciljani ligandi uvedeni su u petlje gumba proteina vlakana. Od njih je najperspektivniji bio motiv RGD-a koji se veže za integrin i koji je ciljao adenovirusnu transdukciju prvenstveno prema, između ostalih tipova stanica, DC-ima. 142 Do sada je, međutim, umetanjem ciljanih liganda u domenu gumba postignuta ekspanzija virusnog tropizma, ali ne nužno i ablacija CAR vezanja. Ta je činjenica dovela do radikalnijeg pristupa ciljanja oglasa potpunom zamjenom vlakana ili gumba. 143 Ovom metodom dobiveni su samo preliminarni dokazi o glavnim rezultatima, a ostaje razjasniti hoće li stabilnost vektora ili učinkovitost prijenosa gena biti ugrožena.

Jasno je da postoje značajne prepreke koje je potrebno prijeći prije nego što se virusi mogu učinkovito usmjeriti na selektivne stanične populacije. Tek tada će odabir ciljane molekule biti od najveće važnosti, a to može biti arena u kojoj bi se tehnologija prikaza faga mogla učinkovito iskoristiti za odabir peptida koji isključivo ciljaju stanice uključene u procese autoimunih bolesti. Snaga ovog pristupa nedavno je pokazana u studiji u kojoj su okarakterizirani peptidi koji se vežu za sinovijalni endotel in vivo izbor. 144


PROIZVODNJA AAV VEKTORA – Izazovi & Mogućnosti u proizvodnji AAV vektora koji se koriste u isporuci tretmana genske terapije

Postignut je značajan napredak u specifičnom ciljanju vektora za isporuku i povećana terapijska učinkovitost takvih vektora za isporuku gena, stimulirajući veliki interes za razvoj i komercijalizaciju terapijskih proizvoda usmjerenih na indikacije genske terapije. U posljednjih nekoliko godina postojao je veliki broj pozitivnih kliničkih rezultata za proizvode temeljene na genskoj terapiji koji obuhvaćaju široka terapijska područja, uključujući imunoterapiju T-stanica CAR, onkologiju i regenerativnu medicinu temeljenu na monogenetskim bolestima. Što se tiče isporuke gena, virusni vektori su se pojavili kao preferirani nositelji izbora, korišteni u 48% od 483 trenutna ispitivanja genske terapije. 1

Od proizvoda za gensku terapiju u razvoju, vektori na bazi rekombinantnog adeno-pridruženog virusa (AAV) trenutno su najrašireniji i pokazuju najveći potencijal za isporuku u indikacijama genske terapije. 1-3 Prvo kliničko ispitivanje temeljeno na vektorima rAAV provedeno je prije 20 godina, faza I. studija koja je dostavila CTFR transgen putem Raav vektora odraslim pacijentima s cističnom fibrozom sa srednjom plućnom bolešću. 4 U 2015. prijavljeno je 103 proizvoda na bazi vektora zasnovanih na rAAV-u, a očekuje se da će se taj broj dodatno povećati u sljedećih nekoliko godina. 1 Poželjna upotreba vektorskih sustava rAAV djelomično je posljedica nedostatka bolesti povezane s virusom divljeg tipa, sposobnosti AAV-a da transducira nepodijeljene, kao i diobene stanice, te rezultirajući dugotrajni robusni transgen izraz primijećen u nekoliko ispitivanja faze I/II. 5 Nadalje, različiti serotipovi vektora rAAV, prirodno prisutni ili hibridni/sintetski izvedeni, mogu se iskoristiti za specifično ciljanje na različita tkiva, organe i stanice i pomoći izbjeći bilo koji već postojeći imunitet na vektor, čime se proširuje terapeutska primjena i potencijal genskih terapija temeljenih na AAV-u. 6

Dok je većina (74%) terapeutskih proizvoda na bazi AAV-a u ranoj do srednjoj fazi kliničkog razvoja, brojni obećavajući klinički rezultati pomogli su napredovanju u razvoju mogućih proizvoda na bazi AAV-a. Godine 2012. nizozemska tvrtka UniQure dobila je odobrenje za stavljanje u promet lijeka u Europi za Glybera ®, gensku terapiju zasnovanu na AAV1 za liječenje odraslih pacijenata s dijagnosticiranim obiteljskim nedostatkom lipoprotein lipaze (LPLD). Nedavni klinički uspjesi AAV- i drugih genskih terapija temeljenih na virusnim vektorima potaknuli su značajna ulaganja u sektor kao takav, postoji sve veća potražnja za proizvodnim rješenjima dobre proizvođačke prakse (GMP) za ove proizvode virusnih vektora.

PRIRODA IZAZOVA

Razvoj proizvodnih procesa za nove bioterapeutike dugotrajan je i skup. Proizvodnja rekombinantnih virusnih vektora smatra se složenom, pri čemu se povećanje proizvodnje smatra tehničkim velikim izazovom i velikom preprekom za komercijalizaciju.

Prijavljene kliničke doze za virusne vektore na bazi AAV kreću se od 1011 do 1014 genomskih čestica (vektorski genomi vg) po pacijentu, ovisno o terapijskom području. 1,3,6 Sa šire perspektive razvoja genske terapije, trenutni pristupi opsežnog smanjivanja nedostaju u opskrbi potrebnim brojem doza da bi se omogućilo napredovanje kasnijih faza (II/III), čime se usporava razvoj proizvoda genske terapije. Tome u prilog govori i činjenica da je većina kliničkih studija bila vrlo mala, provedena na <100 pacijenata (a u nekim slučajevima i <10), koristeći postupke adhezivne transfekcije stanica koje stvaraju vrlo skromne količine proizvoda. Kada se predviđene količine virusa potrebne za razvoj u kasnijoj fazi usporede s trenutnom proizvodnošću (otprilike 5x 1011 vg iz jednofazne tvornice stanica sa 10 slojeva), postoji realna zabrinutost da će ovaj pristup umanjiti materijalne zahtjeve za kasnu fazu i na tržištu potrebe čak i za ultra-siroče bolesti, koje imaju velike doze i male skupine pacijenata, a kamoli više „standardnih“ indikacija genske terapije.

U slučaju AAV -a, postoji niz proizvodnih strategija za generiranje virusnih vektora jer su sa svim različitim strategijama uz svaku povezane brojne prednosti i nedostaci.

STABILNE ĆELIČNE LINIJE ZA PROIZVODNJU

Generiranje stabilnih projektiranih staničnih linija, uvođenjem regulatornih (Rep) i strukturnih kapsidnih (Cap) gena i/ili genoma rAAV, dovodi do pakiranja odnosno proizvodnih staničnih linija. AAV virusni vektori proizvode se iz staničnih linija pakiranja nakon transfekcije AAV konstrukta i koinfekcije virusom pomoćnika, poput adenovirusa (Ad) ili virusa herpes simpleksa (HSV), ili putem jedne infekcije rekombinantnim pomoćnim virusnim vektorom koji sadrži genom rAAV. Za proizvođačke stanične linije, AAV se generira nakon jednostupanjske infekcije virusom Ad ili HSV pomoćnikom. Prijavljeno je da stabilne stanične linije proizvode relativno visoke čestice genoma AAV vektora (vg) po stanici (do 10.000 vg po stanici koja proizvodi). Stanične linije za pakiranje i proizvodnju generirane su pomoću staničnih linija sposobnih i za adhezivno i za rast suspenzije, što omogućuje razvoj procesa koji koriste tradicionalne sustave kulture tkiva za male razmjere, u kombinaciji s većom proizvodnjom u suspenzijskim bioreaktorima. Ovaj skalabilan pristup korišten je u proizvodnji proizvoda AAV1 za zatajenje srca. Ovdje je virusni vektor generiran na skali od 2000 L iz stanične linije proizvođača HeLaS3, nakon koinfekcije virusima pomoćnicima. 7

Unatoč prijavljenom relativno visokom prinosu i skalabilnosti, brojni nedostaci ograničili su uporabu proizvođačkih i ambalažnih staničnih linija u kliničkom razvoju. Generiranje stabilnih linija tehnički je zahtjevno, izuzetno dugotrajno i potrebno ga je izvesti za svaku kombinaciju vektora i AAV serotipa. Klonska karakterizacija i stabilnost stanične linije vrlo su dugotrajni i skupi, a nadalje nose potencijalni rizik temeljen na povijesti prolaska stanica i odnosu između kinetike rasta i proizvodnje vektora. Velika briga je upotreba pomoćnih Ad i hibridnih varijanti u tim sustavima. Proizvodnja virusa pomoćnika sama po sebi može biti izuzetno skupa i dugotrajna, sa potrebom da se pažljivo procijeni kvaliteta ovog kritičnog polaznog materijala prije upotrebe u proizvodnji AAV -a. Nadalje, uspostavljanje učinkovitih postupaka uklanjanja i uklanjanja kako bi se virus pomoćnik odvojio od AAV vektorskog proizvoda nije trivijalno, što rezultira složenim i skupim razvojem procesa i potencijalno visokim troškovima robe.

BACULOVIRUS PROIZVODNI SUSTAV

Proizvodnja AAV vektora pomoću ekspresijskog sustava Baculovirus (BV) pojavila se kao posljedica sposobnosti BV sustava da proizvodi složene glikozilirane rekombinantne proteine ​​na visokim razinama u stanicama insekata SF9 pri velikoj gustoći stanica. Nadovezujući se na proizvodnju AAV-a putem stabilnog sustava stanične linije, BV sustav razvijen je za proizvodnju virusnog vektora bez potrebe za istovremenom infekcijom s virusom humanog pomagača. AAV2 je proizveden u stanicama insekata Sf9 nakon koinfekcije s tri rekombinantna BV vektora, kodirajući transgene za Rep, Cap i rAAV genom. Od tada je BV sustav izmijenjen i poboljšan, a sada su razvijeni sustavi koji koriste dvovektorski pristup, smanjujući složenost procesa. Također su korištena skalabilna rješenja. Jedan pristup je koristio krioprezervirane BV-inficirane stanice insekata koje odvojeno nose potrebne komponente AAV (gen gena rAAV, geni Rep i Cap). Zaražene stanice korištene su za inokulaciju bioreaktora u mjerilu 200 L koji sadrži nemodificirane stanice insekata, te su oslobađale zarazne rBV (rAAV, rCAP, rRep) na kontinuiran način koji je kasnije inficirao neinficirane stanice, čime je potaknuta faza produžene proizvodnje. 8

Trenutačno se lijek Glybera na bazi AAV1 proizvodi pomoću BV sustava, međutim nekoliko je nedostataka ograničilo uporabu BV sustava za proizvodnju AAV vektora u kliničkom okruženju. Prevladavanje aspekata biologije molekularnih stanica potrebnih za proizvodnju virusnog vektora sisavaca u staničnom sustavu insekata pomoću virusa insekata ima velike izazove, prijavljena je nestabilnost AAV gena unutar BV, zajedno s nemogućnošću sastavljanja AAV čestica s ispravnom stehiometrijom kapsidnih proteina, utječući na infektivnost proizvedenog AAV virusnog vektora. Slično sustavima za proizvodnju stabilnih staničnih linija, postoje izazovi u čišćenju i uklanjanju početnog i propagiranog BV iz AAV virusnih vektora tijekom operacije pročišćavanja nizvodno. Međutim, nekoliko biofarmaceutskih tvrtki trenutno koristi varijacije BV platforme i aktivno radi na poboljšanjima za ublažavanje ograničenja BV sustava, prelazeći na veliku kliničku proizvodnju rAAV-a.

PRIJELAZNA TRANSFEKCIJA BEZ POMOĆNIKA

Prolazna transfekcija plazmidne DNA u stanice sisavaca za proizvodnju AAV virusnih vektora strategija je koja se najčešće koristi u kliničkoj proizvodnji ovih virusnih vektora. vektori rAAV obično se proizvode u 293 stanicama humanog embrionalnog bubrega (HEK293) ili varijantama stanica HEK293 nakon uvođenja (transfekcije) tipično tri DNA plazmida koji nose regulatorne (Rep) i strukturne kapsidne (Cap) gene, rAAV transgen i specifične geni koji pružaju pomoćnu funkciju oglasa. Ako se sva tri plazmida uspješno transficiraju u stanicu, stanica će proizvesti vektor rAAV bez potrebe za koinfekcijom s virusom pomoćnika divljeg tipa. Pristup transfekcije je prilično brz i svestran i korišten je za proizvodnju različitih serotipova rAAV -a, budući da se samo genetski niz Cap gena mora promijeniti za proizvodnju različitih serotipova. Nadalje, modifikacija transgenskog plazmida omogućuje generiranje jedno- i dvolančanih (samokomplementarnih) oblika vektora.

Ponovno, glavni izazov ovom pristupu je inherentni nedostatak skalabilnosti zbog upotrebe adhezivnih HEK293 stanica. Kao takvi, adhezivni stanični sustavi zahtijevaju pristup razmjera koji se temelji na linearnom proširenju 2D površine, a ne volumetrijski pristup 3D skali koji se obično koristi u proizvodnji biofarmaceutika. Kako bi se proizveo i pročistio potreban broj čestica vektorskog genoma (vg) & gt1 � vg za podršku kliničkim ispitivanjima u srednjoj ili kasnijoj fazi, preko 500 Hyperstacks ™ (Hyperstack ima 36 slojeva i ukupnu površinu od 18.000 cm 2) bilo bi potrebno. Iako je moguće, ovaj pristup nije održiva opcija za većinu proizvodnih pogona zbog ograničenja prostora, troškova i radne snage. U tijeku je rad na razvoju doista skalabilnih proizvodnih rješenja usklađenih s propisima za generiranje vektora rAAV. HEK293 stanice prilagođene su rastu suspenzije u medijskim sustavima životinjskih komponenti, bez seruma i bez antibiotika, s optimizacijom uvjeta transfekcije koji se procjenjuju u sustavima bioreaktora s tresanjem i ljuljanju.

PROČIŠĆAVANJE VIRALNIH VEKTORA DOWNSTREAMA

Bez obzira na procese proizvodnje i razmjere vektora, krajnji cilj proizvodnje vektora AAV je imati robusno pročišćavanje nizvodno koje stvara konačni klinički materijal visokog titra, visokog potencijala i visoke čistoće. Zbog narastajućeg polja virusnog vektora, većina nizvodnih pristupa temelji se na tradicionalnim laboratorijskim procesima koji nisu skalabilni ili prikladni za proizvodnju kliničkog stupnja. Ograničenja postoje u cijelom pročišćavanju virusnih vektora nizvodno, uključujući: prikupljanje stanica proizvođača, postupke lize stanica radi oslobađanja AAV vektora, bistrenje i uklanjanje staničnih nečistoća, odvajanje i pročišćavanje vektora, te formulaciju vektora i sterilnu filtraciju.

Izazov se može ilustrirati načinom na koji su vektorske čestice koje sadrže genom tradicionalno odvojene od praznih čestica pomoću gradijentnog ultra-centrifugiranja.Iako je rezultirajući materijal dobiven takvim korakom visoke čistoće i visokog učinka, dugotrajna priroda i složenost povećanja značajno ograničavaju uporabu ultra-centrifugiranja u nizvodnom procesu. Za terapijske indikacije, osim onih usmjerenih na ultra-siročadne bolesti koje zahtijevaju pročišćavanje malih količina materijala, potreba za obradom velikih količina zahtijeva alternativnu metodu pročišćavanja. Kao takvi, pristupi temeljeni na kromatografiji razvijaju se korištenjem koraka vezivanja za afinitet i/ili ionske izmjene koji pružaju učinkovitost, fleksibilnost i skalabilnost pročišćavanju AAV vektora. Budući da se vektori visoke čistoće i visokog potencijala mogu generirati pomoću pristupa ultracentrifugiranja, izazov za pristup kromatografskom pročišćavanju je generiranje vektora s istim stupnjem čistoće i jačine. Stoga se mora uzeti u obzir regulatorno razmatranje svake promjene procesa tijekom programa kliničkog razvoja. Također, zbog kemijskih i bioloških razlika uočenih između različitih AAV serotipova, razvoj jedinstvene nizvodne platforme za sve AAV vektore može biti malo vjerojatan, već će se vjerojatno koristiti brojna potencijalna rješenja.

ANALITIČKI SUSTAVI ZA KARAKTERIZACIJU PROIZVODA & PROCESA

U tijeku je razvoj radi poboljšanja kliničkih proizvodnih procesa i prelaska u skalabilne i kontrolirane sustave proizvodnje i pročišćavanja. Međutim, oni su spriječeni nedostatkom znanja o obradi kritičnih parametara u svim fazama proizvodnog procesa, zbog nedostatka odgovarajućih analitičkih sustava koji bi podržali razvojne studije, te ispitivali i kontrolirali proizvodne procese, kao i karakterizirali finalne materijale. 9 Uz proizvodni izazov povezan je regulatorni zahtjev za identifikaciju, karakterizaciju i šaržnu kontrolu nečistoća u procesu i proizvodu prisutnih u visoko pročišćenom materijalu. Posebno su izazovne nečistoće povezane s vektorskim proizvodima AAV, koje jako nalikuju samom vektoru.

AAV vektorske čestice mogu zajedno upakirati nespecifični plazmidni materijal u kapsid. Prijavljeno je da između 1% i 8% pročišćenih AAV čestica sadrži pogrešnu sekvencu nukleinske kiseline. 7 Budući da prijavljeni rasponi kliničkih doza variraju od 1011 do 1014 genomskih čestica, moglo bi biti čak 109 zajedno zapakiranih nečistoća po dozi. Ove nečistoće povezane s procesom zahtijevaju detaljnu karakterizaciju, zajedno s procjenom mogućnosti da pogrešno zapakirana DNA bude aktivna u transduciranim stanicama. 10

Zanimljivo je da većina plazmida koji se trenutno koriste za prolaznu transfekciju nose gen za rezistenciju na antibiotike koji omogućuje odabir i održavanje plazmida tijekom vlastite proizvodnje. Stoga bi uklanjanje gena rezistencije na antibiotike bilo poželjno za proizvodnju AAV-a u sustavima bez pomagača. Postoji tehnologija, kao što je Cobrin patentirani sustav održavanja plazmida Operator Repressor Titration (ORT ™) za stvaranje plazmidne DNA kojoj nedostaju geni za rezistenciju na antibiotike. 11 Ovi sustavi uklanjaju mogućnost ko-pakiranja funkcionalnog gena otpornosti na antibiotike u virusnu kapsidu, čime se povećava sigurnost proizvoda i smanjuje teret karakterizacije nečistoća povezanih s AAV-om.

VIZIJA ZA MERILNU PROIZVODNJU PLATFORMU NA ZNANJU

Ostaje jasna potreba za poboljšanom produktivnošću procesa i potreba za razvojem proizvodnih procesa koji se mogu primijeniti na veliki broj kandidata za terapiju virusnih vektora temeljenih na AAV-u. Pojednostavljeno, AAV vektor je sredstvo za isporuku terapijskog gena, a proizvodni proces nije povezan s tim genom. Logika stoga nalaže da bi trebalo biti moguće generirati procese platforme specifične za AAV serotipove, pa čak i moguće generirati procese koji se mogu primijeniti na više serotipova. Ovaj pristup nije bez presedana. Razvoj razvojnih i proizvodnih procesa temeljenih na platformi koji odvaja proizvodnju od specifičnih proizvoda imao je ogroman utjecaj u drugim biološkim područjima (npr., Monoklonska protutijela), smanjujući troškove razvoja, rokove i cijenu robe, te je također je omogućilo proizvođačima lijekova da značajno prošire kliničke kanale u više terapijskih područja.

Da bi se to postiglo za AAV vektore, potrebno je generirati i optimizirati temeljno znanstveno znanje o kritičnim radnim parametrima u proizvodnom procesu, zajedno s nizom standardnih analitičkih metoda. Svaka razvijena platforma morat će biti dovoljno fleksibilna da prilagodi više vrsta vektora AAV. Takav razvoj će imati dugoročne koristi za stvaranje materijala za prve studije, a nadalje za kasne kliničke studije i na kraju ponudu na tržištu.

1. Tržište genske terapije 2015.-2025., Izvješće o analizi korijena (2015.).
2. Ginn SL, Alexander IE, Edelstein ML, Abedi MR, Wixon J. Klinička ispitivanja genske terapije u svijetu do 2012. - ažuriranje. J Gene Med. 201315: 65-77.
3. Okada. Potencijalna primjena genske terapije, alata i pojačala. 2013C17.
4. Flotte i sur. Hum Gene Ther. 19967: 1145-1159.
5. Okada i sur. Metode Enzymol. 2002346: 378-393.
6. Wu i sur. Molekularna terapija. 200614: 316-327.
7. Hajjar i dr. J Card Fail. 200814: 355-367.
8. Cecchini i sur. Hum Gene Ther 201122: 1021-1030.
9. Wright JF. Biomedicine. 20142: 80-97.
10. Kvalitetna, neklinička i klinička pitanja vezana za razvoj rec. AAV vektori 24. lipnja 2010., EMEA/CHMP/GTWP/587488/2007.
11. Cranenburgh. Et al. Nukleinske kiseline Res. 200129: e26.

Da biste pogledali ovaj problem i sve prethodne probleme na mreži, posjetite www.drug-dev.com.

Dr. Daniel C. Smith je glavni znanstveni direktor Cobra Biologics, odgovoran za razvoj najviše razine znanstvene izvrsnosti u cijeloj Grupi i poboljšanje platforme za istraživanje i razvoj proteina DNK, virusa, mikroorganizama i sisavaca. Prije nego što se pridružio Cobri, proveo je 4 godine s timom bioProcessUK -a u HealthTech & amp Medicines Knowledge Transfer Network (KTN), vodeći inovacijski plan biološke obrade bioloških proizvoda u Velikoj Britaniji kao menadžer prijenosa znanja. Doktor Smith stekao je svoje industrijsko iskustvo u Cobri u raznim ulogama koje su napredovale od višeg znanstvenika do voditelja komercijalnog znanstvenog razvoja, odgovornog za razvoj strategije za klijentove projekte, uz održavanje znanstvenog nadzora nad Cobrinim projektima istraživanja i razvoja. Diplomirao je biokemiju i doktorirao biologiju molekularnih stanica. On ima više od 20 istraživačkih publikacija za koje je zaslužan da je surađivao s brojnim akademskim skupinama u Velikoj Britaniji, Europi i SAD -u te ima veliko akademsko istraživačko iskustvo u staničnoj biologiji, molekularnoj biologiji, imunologiji i biokemiji proteina, sa posebnom stručnošću u toksinima na bazi proteina i vektorima stanične dostave.


5. Glavni izvori matičnih stanica odraslih

5.1. Matične stanice dobivene koštanom srži (BMSCS)

Koštana srž bila je primarni izvor mezenhimalnih matičnih stanica, međutim, prikupljanje koštane srži je invazivno, a izolacija MSC -a neučinkovita (π.05%) [86,87]. BMSC su sposobni proći staničnu fuziju, prirodni proces miješanja genetskog materijala koji mijenja obrasce ekspresije gena [88]. Fuzija stanica uključena je u regeneraciju, normalan razvoj, imunološki odgovor i stvaranje tkiva te igra istaknutu ulogu u plastičnosti matičnih stanica [89]. Doista, stanična fuzija može izmijeniti genski program i upravljati staničnom sudbinom, pretvarajući stanicu u nezrelije stanje kako bi se postigla regenerativna funkcija [90].

Transplantacija krvotvornih matičnih stanica prva je i najrasprostranjenija terapija matičnim stanicama [91]. hMSC -ovi izvedeni iz koštane srži mogu se diferencirati u epitelne stanice jetre, pluća, gastrointestinalnog trakta i kože [92].

Autologni kultivirani hMSC-i dobiveni iz koštane srži primijenjeni su na rane, koristeći specijalizirani sustav raspršivanja s fibrinom. Ovaj se pristup trenutno provodi i trebao bi biti siguran i valjan za lokalnu primjenu u stanicama, iako nema čvrstih podataka koji bi potvrdili njegovu valjanost [93].

5.2. Matične stanice dobivene iz masnog tkiva (ADSCS)

Matične/stromalne stanice dobivene iz masnog tkiva (ADSC) su multipotentne somatske matične stanice koje se mogu razlikovati u nekoliko loza, uključujući masne stanice, kondrocite, osteoblaste, endotelne stanice, epitel, kardiomiocite i neuronske stanice [94]. Postojanje matičnih stanica unutar masnog tkiva prvi je put prijavljeno 2001. [95]. Često se opisuju kao obrađene lipoaspiratne stanice (PLA), preadipociti ili masne matične stanice, iako međunarodno društvo za primijenjenu tehnologiju masti preporučuje izraz �SCs ” [6]. ADSC izražavaju markere specifične za mezenhimalne stanice i molekularne markere tipične za fenotip embrionalnih matičnih stanica: OCT4, Nanog i Sox2 [96,97]. ADSC su heterogene, razlikuju se ovisno o svojim anatomskim regijama i ovisno o vrsti (bijele ili smeđe) [98].

Trenutna istraživanja sugeriraju da bi oni zapravo mogli biti pluripotentni i tvoriti tipove stanica sva tri zametna sloja [99]. ADSC predstavljaju obećavajući izvor odraslih mezenhimskih matičnih stanica, uglavnom zato što je izolacija manje invazivna i učinkovitija [6,71]. Aspirirana masnoća ima u izobilju u mnogim postupcima plastične kirurgije, primjerice, liposukciji i liposkulpturi te#prekursorske stanice mogu se pročistiti kako bi se dobila ADSC-bogata stromalna vaskularna frakcija (SVF) [100]. SVF je heterogena smjesa koja sadrži endotelne stanice, preadipocite, fibroblaste, vaskularne stanice, makrofage i brojne mezenhimalne matične stanice [6], a sada se proučava kao nadopuna slobodnom prijenosu masti kako bi se povećao prinos [101]. Proširenje ADSC populacije u kulturi može dati 100 do 1000 puta više stanica -praroditelja od izolacije iz koštane srži [102].

Osim što je jedno od najbogatijih izvora ASC-a u ljudskom tijelu, masno tkivo je i endokrini organ koji luči brojne hormone, faktore rasta i citokine, koji podržavaju zacjeljivanje rana i druge funkcije kao što su leptin, epidermalni faktor rasta, faktor nekroze tumora- α, osnovni faktor rasta fibroblasta, faktor rasta keratinocita, faktor rasta transformacije-㬡 (TGF-㬡), faktor rasta vaskularnog endotela, faktor rasta hepatocita, interleukin (IL) -6, IL-7, IL- 8, IL-11, IL-12, faktor stimulacije kolonije makrofaga, faktor rasta izveden iz trombocita, neurotrofni faktor izveden iz mozga, faktor stimulacije kolonije granulocita i faktor inhibicije leukemije [6,102]. Ovi parakrini utjecaji od velike su važnosti u mnogim terapijama matičnim stanicama, stvarajući povoljno okruženje za razvoj funkcionalnijih stanica i popravak tkiva, kroz promicanje neovaskularizacije, mehanizme popravljanja endogena i regulaciju imunoloških odgovora [77,103].

ADSC -ovi predstavljaju visoko učinkovit izvor iPSC -ova [104]. Mogu se koristiti za ispitivanje toksičnosti lijekova, smanjujući potrebu za životinjama. Oni također mogu ponuditi važan alat za staničnu gensku terapiju u području zacjeljivanja rana, jer se ADSC-i mogu učinkovito (iznad 60%) transducirati vektorima [12,105].

Razna klinička ispitivanja pokazala su regenerativnu sposobnost matičnih stanica dobivenih od masnoće u podspecijalnostima medicinskih područja kao što su plastična kirurgija (za rekonstrukciju dojke i estetsko lipofiliranje), opća kirurgija (za liječenje kroničnih fistula u Crohnovoj bolesti), ortopedska kirurgija, oralna i maksilofacijalna kirurgija kirurgija (za poticanje obnavljanja kostiju u defektima kalvarije) i kardiologija (ishemijska bolest srca i akutni infarkt miokarda) [77,106,107]. Međutim, uz rizik od transformacije malignosti i heterogenosti, još uvijek nema dovoljno dokaza koji bi potaknuli široku i sigurnu uporabu ADSC-a te su potrebna daljnja istraživanja [108-110]. Buduće studije za optimizaciju diferencijacije ADSC -a u stanice s deficitom mogu otključati njihov terapijski potencijal u regenerativnoj medicini.

Sve u svemu, ADSC-i obećavaju veliku uporabu u popravljanju i regeneraciji tkiva, zbog svoje dostupnosti, proangiogenog lučenja anti-apoptotičkog faktora, imunomodulacijskih učinaka i višerodne diferencijacije, postajući jednom od najpopularnijih matičnih stanica odraslih osoba koje se trenutno istražuju [6 , 77,100,103,111].

5.3. Matične stanice izvedene iz pupkovine (krv)

Matične stanice dobivene iz pupkovine (UC) i krvi iz pupkovine ostaju najveći svjetski potencijalni izvor matičnih stanica, s obzirom na globalnu stopu nataliteta od oko 135 milijuna godišnje [86]. Pupčana vrpca predstavlja dobro poznati izvor endotelnih matičnih stanica [112]. Krv iz pupkovine sadrži hematopoetske i nehematopoetske matične stanice, koje se također nazivaju CBE (matične stanice slične embrionima iz pupkovine) [113,114]. Pokazalo se da se CBE diferenciraju u neuronske, hepatobiliarne, prethodnike slične gušterači i potencijalno druge [115,116].

Ljudska krv iz pupkovine bogat je izvor hemopoetskih matičnih stanica za kliničku primjenu i može biti jedan od najvećih izvora matičnih stanica s naivnim imunološkim statusom [12,101].

Od unutarnjeg do vanjskog sloja, slojevi unutar UC-a uključuju žile, Whartonov mliječ ili matriks, te amnionsku membranu ili sluznicu obloge, epitel ili subamnion [86]. Whartonov mliječ dovodi do nastanka MSC -a i ima manju gustoću stanica, ali nam omogućuje brzu izolaciju mnogih stanica [117]. Jedan komad 5 � mm 3 Whartonovog mliječa ima potencijal proizvesti do 1 milijardu MSC -a u 30 dana imajući u vidu da prosječni UC mjeri 50 cm [15], nesumnjivo predstavlja bogat izvor SC -a. Perivaskularne stanice ljudske pupčane vrpce gotovo su identične MSC -ima s Whartonovom želeom [118] (slika 2).

Anatomija pupčane vrpce. Reproducirano iz [10] s dopuštenjem Rightslink -a.

Pupčana vrpca sadrži žile (dvije arterije i jednu venu), Whartonov mliječ i vanjsku membranu.

Amnionska membrana i sluznica žice ponekad su zamjenjive riječi koje se odnose na UC membranu općenito ili se odnose na različite tipove stanica. Vanjska membrana UC -a iznimno je bogat izvor matičnih stanica za obnavljanje opeklina [12]. Obloga vrpce stvara multipotentne epitelne matične stanice (CL-epitelne matične stanice) [86].

Sluznica-mezenhimalne matične stanice (CL-MSC) izražavaju CD23, CD14 i male količine CD34 i CD35 ne izražavaju endotelni marker CD31 i imaju veće in vitro proširenje od Whartonovih MSC-a dobivenih iz želea [119]. CD14 inhibira T stanice. MSC -i dobiveni iz Whartonovog želea ne eksprimiraju CD14 ili CD23. Unatoč tim opisima, o staničnim markerima MSC-a dobivenih iz pupkovine vodi se velika rasprava [86,120] (slika 3).

Fotomikrografije stanica sluznice epitela (A) i stanica sluznice mezenhima (B). Reproducirano iz [12] uz dopuštenje tvrtke Righstlink.

Općenito, MSC-i dobiveni iz pupkovine mogu se razlikovati u kosti, kožu, endotel, hepatocite, živčane loze i druge. MSC iz amnionske membrane posebno se mogu razlikovati u kosti, hrskavicu i masnoću [12,121].

Što se tiče hematoloških bolesti, nezrelost stanica krvi iz pupkovine (UCB) povezana je s niskom imunogenošću, što smanjuje njihovu reaktivnost transplantata protiv domaćina u usporedbi s transplantatima koštane srži odrasle osobe [122]. S druge strane, krv iz pupkovine opskrbljuje multipotentne matične stanice brzinom 30% nižom od one postignute iz koštane srži odraslih [101]. Krv iz pupkovine uvedena je kao alternativni izvor alogenih HSC nakon uspjeha transplantacije pupkovine u djeteta s Fanconijevom anemijom. I transplantacije krvi iz pupkovine i podudarne nepovezane transplantacije koštane srži dijele slično preživljavanje bez bolesti i mortalitet povezan s transplantacijom [91]. Daljnja istraživanja morat će razjasniti kada je alogena transplantacija krvi iz pupkovine najbolja za indikaciju [124].

S obzirom na opekline i zacjeljivanje rana na koži, pupčana vrpca i plodna opna mogu se pojaviti kao novi obećavajući izvori “off-the-police ” ćelijski oblikovane kože [86]. Štoviše, istodobna primjena nekoliko vrsta matičnih stanica može izazvati sinergijske koristi [77], što upućuje na uporabu i epitelnih i mezenhimskih matičnih stanica.

5.4. Matične stanice folikula dlake

Folikuli dlake obećavajući su izvor lako dostupnih višestrukih (ili više) moćnih matičnih stanica koje nisu onkogene i ne nose etičke probleme, za razliku od embrionalnih matičnih stanica ili induciranih pluripotentnih matičnih stanica. Zapravo, mnogi istraživači smatraju folikule dlake najperspektivnijim izvorom multipotentnih matičnih stanica [19,124].

Pluripotentne matične stanice vlasišta folikula dlake pozitivne su na nestin i transkripcijske faktore embrionalnih matičnih stanica Nanog i Oct4. Te se stanice mogu diferencirati u neurone, stanice glatkih mišića i melanocite [125]. Područje ispupčenja folikula dlake sadrži nestin-negativne, K15-pozitivne stanice koje se mogu diferencirati u keratinocite, neurone, glijalne stanice i stanice glatkih mišića [126].

Matične stanice folikula ljudske kose potiču popravak živaca ili funkcionalni oporavak ozlijeđenog perifernog živca i leđne moždine [127].

Matične stanice ispupčene iz folikula dlake stvaraju i stanice folikula dlake i stanice epiderme. Matične stanice folikula dlake stvaraju epidermalne matične stanice samo kada je epiderma ozlijeđena ili pod stresom [128]. Izbočene matične stanice brzo reagiraju na epidermalno ranjavanje stvaranjem kratkotrajnih TA stanica odgovornih za akutni popravak rana [129] (slika 4). Intenzivna istraživanja posvećena su ovom obećavajućem izvoru terapije matičnim stanicama za poboljšanje zacjeljivanja rana.

Izbočene folikule dlake i multipotentne matične stanice. Reproducirano iz [19] uz dopuštenje Wolters Kluwera.

Shematski prikaz kožnog epitela i stanične loze izvedene iz višepotentnih matičnih stanica u ispupčenju folikula dlake. U stacionarnim uvjetima, matične stanice su u stanju mirovanja. Na početku ciklusa dlake, kada se donji folikul i matriks regeneriraju, matične stanice u izbočini se razmnožavaju stvarajući nove keratinocite folikula dlake. U uvjetima ranjavanja, matične stanice proizvode stanice kćeri koje migriraju iz niše kako bi ponovno naselile bazalni sloj epidermisa i žlijezdu lojnicu.


Adenovirus je ključni vektor: prednosti i čimbenici rizika

Oglasi su izolirani iz velikog broja različitih vrsta, 100 serotipova, 57 u ljudi [4]. Ad je vrlo učinkovit u genskoj terapiji zbog svoje sposobnosti da učinkovito transducira stanice koje se dijele i ne dijele [6]. Vektori oglasa također imaju kapacitet zadržavanja velikih segmenata DNA (7,5 kbps), njima se lako manipulira tehnikama rekombinantne DNA i imaju sposobnost stvaranja visokih titra [6]. Za većinu serotipova u Ad infekcija je posredovana vezanjem regije vlaknastih gumba za receptor ciljne stanice, poznate kao receptor za koksaki-ad (CAR). Vezanje CAR -a najčešće se opaža u serotipu 5 kod ljudi, Ad5 [7].


Ulazak i internalizacija virusa posreduje se interakcijom između penton-baze Arg-Gly-Asp (RGD) i staničnih αv integrina, što dovodi do endocitoze virusa kroz jame obložene klatrinom [8].Αv integrini potiču polimerizaciju aktina što rezultira ulaskom virusa u endosom. Endosom se tada zakiseljuje, uzrokujući razdvajanje kapsidnih proteina. Virus se rastavlja u endosomu i virusna DNA se transportira u jezgru, što rezultira ekspresijom virusnih gena ili transgena [7]. Ad virusna DNA nije integrirana u genom domaćina pa je rizik od mutacije iznimno nizak, međutim, ostaje u epizomnom stanju [8].


Prijavljene su i sekundarne interakcije receptora koje uključuju heparan sulfatne proteoglikane (HSPG) [7]. Ekspresija CAR-a je faktor koji ograničava brzinu infektivnosti Ad, budući da je ekspresija vrlo promjenjiva u primarnim stanicama humanog tumora [8]. Smanjenje ekspresije CAR -a korelira s progresijom malignih tumora i njihovim stanjem ili agresivnošću [7]. CAR je lokaliziran unutar uskih spojeva, također igrajući ulogu u adheziji stanica [8].

Životni ciklus Ad je odvojen procesom replikacije DNK u dvije različite faze: ranoj i kasnoj [2]. Rani geni odgovorni su za regulatorne proteine ​​ili proteine ​​koji mijenjaju gene domaćina za sintezu DNA, aktiviraju druge virusne proteine ​​i izbjegavaju preranu smrt zaraženih stanica imunološkom obranom domaćina [2]. Rani geni mogu ovjekovječiti druge stanice, na primjer, E1A, koji se veže na supresor tumora retinoblastoma, ovjekovječuje primarne stanice in vitro dopuštajući E1B, koji se veže na p53 tumorski supresor, da pomogne u stvaranju tumorskih stanica [2].

Vektorska infekcija uključuje širok spektar imunoloških odgovora, humoralnih i staničnih. Odgovori su posljedica vektora Ad i već zaraženih stanica [8]. Prezentacija oglasa aktivira imunološki sustav i uključuje prirodan odgovor na borbu protiv tumorskih antigena [8]. Međutim, korištenje Ad kao vektora rizično je jer će previsoka doza rezultirati akutnom toksičnošću i autoimunitetom [8]. Do danas su nuspojave bile blage u terapiji Ad, ali se neciljane nuspojave dosljedno prate, kako dugoročni tako i kratkoročni učinci u bolesnika, osobito u jetri [8].

Istraživači trenutno pokušavaju povećati vektore transfera gena Ad kako bi ciljali tumorske stanice i smanjiti svako ciljanje na jetru. Trenutno se traže brojne metode, uključujući: pseudotipiziranje oglasnih vlakana ili "modifikacija tropizma" zamjenom receptorskih veznih proteina s onima drugih serotipova [9], na primjer, zamjenom Ad serotipa 5 (Ad5) s gumbom iz Ad serotipa 3 (Ad3) [9]. Eksperimentalni podaci s himerama Ad5/3 pokazali su povećanu infektivnost u izoliranim stanicama raka bez povećanja isporuke gena i toksičnosti za mišju jetru [9].


Genska mutacija koja bi mogla izliječiti HIV ima kariranu prošlost

Da biste ponovo vidjeli ovaj članak, posjetite Moj profil, a zatim Pogledajte spremljene priče.

"Londonski pacijent" bio je slobodan i čist od HIV -a 18 mjeseci. To je još prerano da bi se to nazvalo lijekom — istraživači radije kažu da je u dugotrajnoj remisiji##8212 ali čini se da je to tek druga osoba koja je ikada izvijestila da se riješila virusa ovom metodom. Izvor znanosti

Da biste ponovo vidjeli ovaj članak, posjetite Moj profil, a zatim Pogledajte spremljene priče.

U tri i pol desetljeća od otkrivanja HIV/AIDS -a, smrtonosna bolest ubila je 35 milijuna ljudi. Dok lijekovi sada pacijentima omogućuju dug život s virusom, vjeruje se da je izliječen samo jedan čovjek, Amerikanac po imenu Timothy Ray Brown, inače poznat kao "berlinski pacijent". Sada se čini da više nije sam.

Ovaj tjedan, tim britanskih znanstvenika sa Sveučilišta Cambridge tvrdio je da je uspješno liječio HIV pozitivnog muškarca iz Londona istom tehnikom matičnih stanica koju su Brownovi liječnici koristili prije deset godina. Uključivalo je presađivanje pacijenta s koštanom srži od donatora koji je imao prirodnu mutaciju u genu zvanom CCR5. HIV koristi protein CCR5 za invaziju na određene imunološke stanice. Bez toga, virus je zaključan.

To je ista mutacija koju je kineski istraživač po imenu He Jiankui prošle godine pokušao replicirati pomoću Crispr tehnike na najmanje dvije ljudske bebe. Iako je međunarodna znanstvena zajednica osudila Njegov eksperiment zbog mnoštva kršenja etike, korištenje Crispr-a i drugih alata za uređivanje gena za ponovno stvaranje zaštitnih učinaka mutacije CCR5 moglo bi dovesti do tako široko dostupnih tretmana da ne moramo pacijente nazivati London ovo ili Berlin ono više. Oni će samo dobiti ... tretmane.

Znanstvenici izvještavaju da je njihov "londonski pacijent" 18 mjeseci bio slobodan i čist od virusa. To je još prerano da bi se to nazvalo lijekom-istraživači radije kažu da je u dugoročnoj remisiji-ali čini se da je to tek druga osoba koja je ikada izvijestila da se riješila virusa ovom metodom. Rezultati su opisani u radu objavljenom u utorak u časopisu Priroda.

Dok neki stručnjaci aplaudiraju vijestima kao dokaz da berlinski pacijent nije bio samo slučajnost, drugi su manje uvjereni da ova metoda ima veliku važnost za većinu pacijenata s HIV -om/AIDS -om. Transplantacija matičnih stanica su bolni, rizični postupci, koji se često predlažu samo najbolesnijim pacijentima. Jedini razlog zašto su pokušani u slučaju berlinskog, a sada londonskog pacijenta je taj što su u oba slučaja muškarci imali i rak opasan po život. Dosta je teško pronaći davatelje koji odgovaraju tkivima za mnoge ljude, a kamoli pronaći one koji također ima rijetku mutaciju CCR5, koja se javlja u samo 1 posto europske populacije. Blizu je najboljeg boutique tretmana kojeg se možete sjetiti. Kako je rekao Anthony Fauci, ravnatelj Nacionalnog instituta za alergije i zarazne bolesti The New York Times: „To je učinjeno s Timothyjem Rayom Brownom, a evo još jednog slučaja - u redu, pa što sad? Gdje ćemo sada s tim? "

Jedna primamljiva mogućnost koja je već predmet velikih ulaganja jest korištenje genetskog inženjeringa za ponovno stvaranje istih uvjeta kao i transplantacija bez tolikog rizika i nelagode.

"Postoji lijep izbor stvari koje bismo sada mogli učiniti", kaže Paula Cannon, molekularna mikrobiologinja koja proučava HIV na Medicinskom fakultetu Sveučilišta Južna Kalifornija. Ona kaže da najnoviji podaci, u kombinaciji s Brownovom sada već 10-godišnjom remisijom, sugeriraju da svaki put do lijeka za HIV/AIDS ide ravno kroz CCR5. "Ova dva pacijenta su nam pokazala da napad na rezervoar inficiranih stanica, a istovremeno osiguravanje sjajnih, novih imunoloških stanica otpornih na HIV, može rezultirati izlječenjem." To je neka vrsta strategije push-and-pull jedan dio obrane, jedan dio napad.

Istraživači i farmaceutske tvrtke već aktivno slijede ovaj pristup, ponajviše Sangamo iz Kalifornije, koji trenutno testira dvije terapije genima HIV-a u ispitivanjima na ljudima. Prije više od desetljeća, tvrtka je počela koristiti stariji alat za uređivanje gena pod nazivom nukleaza s cinkovim prstima kako bi izbacila gen CCR5 na imunološke stanice pacijenta. Bez toga, HIV ne može zaraziti te stanice i moći će ubiti samo one koje nisu projektirane. Na neki način, virus zapravo bira za vlastitu propast, sagorijevajući kroz ranjive stanice i ostavljajući samo one koje se mogu boriti. Znanstvenici u SAD -u i Kini također su istraživali slične tretmane koristeći Crispr, ali do sada samo na miševima i ljudskim staničnim linijama. Jedna od potencijalnih prednosti Crispr -a je ta što je lakše izvršiti više uređivanja. Dakle, osim što biste izbacili CCR5, mogli biste i nabiti te imunološke stanice kako biste mogli bolje pronaći i uništiti virus. Neki od najperspektivnijih novih načina liječenja raka danas se oslanjaju upravo na taj pristup.


P53 Genska terapija za suzbijanje tumora za rak

Genska terapija ima potencijal pružiti lijekove za liječenje raka na temelju novih mehanizama djelovanja s potencijalno niskim toksičnostima. Ova terapija može pružiti učinkovitiju kontrolu lokoregionalnog recidiva u bolestima poput karcinoma pluća bez malih stanica (NSCLC), kao i sustavnu kontrolu mikrometastaza. Unatoč trenutnim ograničenjima, retrovirusni i adenovirusni vektori mogu, u određenim okolnostima, pružiti učinkovito sredstvo za isporuku terapijskih gena tumorskim stanicama. Iako je u karcinogenezu uključeno više gena, mutacije gena p53 najčešća su abnormalnost identificirana u ljudskim tumorima. Pretklinička istraživanja i in vitro i in vivo pokazala su da obnavljanje funkcije p53 može izazvati apoptozu u stanicama raka. Visoke razine ekspresije p53 i agenasa koji oštećuju DNA poput cisplatina (Platinol) i ionizirajućeg zračenja djeluju sinergistički kako bi izazvali apoptozu u stanicama raka. Klinička ispitivanja prve faze sada pokazuju da je nadomjesna terapija genom p53 koja koristi i retrovirusne i adenovirusne vektore izvediva i sigurna. Nadalje, nadomjesna terapija genom p53 izaziva regresiju tumora u pacijenata s uznapredovalim NSCLC -om i u onih s ponavljajućim rakom glave i vrata. Ovaj članak opisuje različite strategije genske terapije koje se istražuju, pregledava pretkliničke podatke koji daju obrazloženje za pristup zamjene gena, te raspravlja o podacima dostupnim u kliničkim ispitivanjima. [ONKOLOGIJA 13 (Dodatak 5): 148-154, 1999.]

SAŽETAK: Genska terapija ima potencijal pružiti lijekove za liječenje raka na temelju novih mehanizama djelovanja s potencijalno niskim toksičnostima. Ova terapija može pružiti učinkovitiju kontrolu lokoregionalnog recidiva u bolestima kao što je ne-mali karcinom pluća (NSCLC), kao i sustavnu kontrolu mikrometastaza. Unatoč trenutnim ograničenjima, retrovirusni i adenovirusni vektori mogu, u određenim okolnostima, pružiti učinkovito sredstvo za isporuku terapijskih gena tumorskim stanicama. Iako je u karcinogenezu uključeno više gena, mutacije gena p53 najčešća su abnormalnost identificirana u ljudskim tumorima. Pretklinička istraživanja i in vitro i in vivo pokazala su da obnavljanje funkcije p53 može izazvati apoptozu u stanicama raka. Visoke razine ekspresije p53 i agenasa koji oštećuju DNA poput cisplatina (Platinol) i ionizirajućeg zračenja djeluju sinergistički kako bi izazvali apoptozu u stanicama raka. Klinička ispitivanja prve faze sada pokazuju da je nadomjesna terapija genom p53 koja koristi i retrovirusne i adenovirusne vektore izvediva i sigurna. Nadalje, nadomjesna terapija genom p53 izaziva regresiju tumora u pacijenata s uznapredovalim NSCLC -om i u onih s ponavljajućim rakom glave i vrata. Ovaj članak opisuje različite strategije genske terapije koje se istražuju, pregledava pretkliničke podatke koji daju obrazloženje za pristup zamjene gena, te raspravlja o podacima dostupnim u kliničkim ispitivanjima. [ONKOLOGIJA 13 (Dodatak 5): 148-154, 1999.]

Uvod

Koncept genske terapije za liječenje ljudskih bolesti izvorno se razvio kao potencijalni tretman za nasljedne monogene poremećaje. [1,2] U teoriji, bolest uzrokovana odsutnošću ili mutacijom jednog gena, poput cistične fibroze ili Gaucherove bolesti, mogla bi biti liječeni i potencijalno izliječeni umetanjem normalne kopije mutiranog ili izbrisanog gena u obnovljivu populaciju stanica domaćina, poput matičnih stanica koštane srži. Iako je konceptualno jednostavna, ova strategija zamjenske genske terapije pokazuje da ima praktične složenosti koje otežavaju njezinu kliničku provedbu nego što se očekivalo. Trenutno dostupni vektori nisu mogli održati dovoljno visoke razine ekspresije gena tijekom dovoljno dugog vremenskog razdoblja.

Glavni fokus u genskoj terapiji bio je liječenje raka. Pristupi uključuju prijenos gena citokina za poticanje antitumorskog imunološkog odgovora, isporuku gena koji eksprimiraju prolijekove u tumore i prijenos gena za zaštitu matičnih stanica tijekom kemoterapije visokim dozama. Ovaj će se pregled usredotočiti na obnavljanje funkcije gena za suzbijanje tumora. U kontekstu raka, prolazna ekspresija gena koja izaziva smrt stanica raka može biti dovoljna da posreduje u terapijskom učinku. Ekspresija transgena u samo jednom dijelu tumorskih stanica također ne može biti ograničavajuća jer te stanice mogu promijeniti rast susjednih stanica. [3]

Genetska osnova karcinogeneze

Obitelji gena uključene u karcinogenezu uključuju dominantne onkogene ras i geni za suzbijanje tumora poput p53. [4-6] Proto-onkogeni (normalni parovi onkogena) obično sudjeluju u takvim funkcijama kao što su transdukcija signala (prijenos informacija iz vanjske stanične membrane do jezgre) i transkripcija gena. Nenormalnost (točkasta mutacija, amplifikacija, translokacija ili preslagivanje) samo u jednom od dva alela proto-onkogena dovoljna je da se pretvori u aktivni onkogen, odnosno da se poremeti njegova funkcija i dovede do zloćudne transformacije.

Nasuprot tome, jedan normalni gen supresor tumora u stanici tipično je dovoljan za obavljanje normalne funkcije gena, ali gubitak funkcije oba alela, mutacijom ili delecijom ili njihovom kombinacijom, dovodi do disregulacije staničnog rasta. Osim toga, neke mutacije gena supresorima tumora - na primjer, neke mutacije p53 - djeluju na "dominantno negativan" način, odnosno mutacija u jednom alelu može dovesti do proizvodnje mutiranog proteina p53 koji se veže na, pa se time inaktivira, strukturno normalan protein kodiran suprotnim alelom. Virusni proteini također mogu vezati i funkcionalno inaktivirati p53. [7]

Obrazloženje za obnavljanje funkcije p53 u stanici raka

Smatra se da svi tumori sadrže više abnormalnosti u raznim genima koji kontroliraju različite aspekte staničnog rasta i razvoja. Stoga bi se ispravljanje svih genetskih abnormalnosti u stanici raka moglo činiti nužnim za poništavanje malignog procesa. Ispravljanje svih genetskih abnormalnosti bio bi nemoguć zadatak, osobito budući da neke od ovih abnormalnosti još nisu identificirane. Štoviše, trebalo bi procijeniti pojedinačne obrasce izražavanja - za svaki gen u svakog pacijenta. Srećom, ispravljanje jedne genetske abnormalnosti dovoljno je u nekim slučajevima da izazove smrt tumorskih stanica apoptozom. [8-10]

Brojne in vitro studije koje su koristile uzgojene stanične linije raka pokazale su da uklanjanje ekspresije jednog dominantnog onkogena (ras) ili dodavanjem normalne kopije gena za suzbijanje tumora (p53 ili gena retinoblastoma [Rb]) stanicama koje su izbrisale ili mutirale kopije ovih gena smanjile su ili čak ukinule kritične aspekte malignog fenotipa, poput tumorigenosti kod životinja ili sidrišta -neovisan rast. [10-12] Zbog toga se problem istodobnog ispravljanja više funkcionalnih genetskih defekata u stanici raka nije činio zastrašujućim.

Također se smatralo da je u neko vrijeme potrebno vratiti normalnu funkciju gena svakoj stanici raka, što nadilazi mogućnosti vektora koji su trenutno dostupni za upotrebu u genskoj terapiji. Međutim, sada je prepoznato da transducirane stanice koje izražavaju toksični transgen mijenjaju rast susjednih netransduciranih stanica. To je nazvano učinkom promatrača. [3]

Iako više gena nudi potencijalne mete za gensku terapiju u nekoliko uobičajenih zloćudnih bolesti, naša se skupina usredotočila na cilj zamjene normalne funkcije p53. Mnogi identificirani geni supresori tumora i proto-onkogeni kodiraju proteine ​​koji su komponente mreže koja konvergira na protein kodiran genom Rb. [13,14] Fosforilacija proteina Rb povećava transkripciju drugih gena i sintezu proteina, što dovodi do na rast stanica. Fosforilaciju Rb kontrolira multimolekularni kompleks proteina, koji sadrži cikline i ciklin ovisne kinaze, kao i snažan inhibitor većine kinaza ovisnih o ciklinima, nazvan p21. [15,16] S druge strane, jedna od mnogih funkcija p53 protein regulira funkciju p21. [17,18] Dakle, p53 ima središnju ulogu u regulaciji staničnog ciklusa jer neizravno regulira funkciju Rb. Kad je funkcija p53 normalna, ovaj je put strogo reguliran, međutim, kada p53 mutira ili ga nema, nekontrolirani rast stanica odražava izgubljenu kontrolu nad putem.

Štoviše, p53 ima središnju ulogu u drugim metaboličkim putevima, uključujući, što je važno, kontrolu apoptoze. [19] Kao odgovor na različite toksične uvrede za stanice, poput izlaganja ionizirajućem zračenju ili kemoterapije, normalne stanice ili zastaju u staničnom ciklusu dovoljno dugo da poprave oštećenje DNA ili, u drugim slučajevima, podvrgnu se popravljanju apoptoze, a programirana stanična smrt spriječi oštećenu DNK od prenošenja do potomstva stanice. Međutim, kada nema normalne funkcije p53, veća je vjerojatnost da će se oštećena DNA prenijeti zajedno. [20]

Odabir modela tumora

Rak pluća bez malih stanica logična je meta za nove terapijske strategije iz nekoliko razloga. To je vodeći uzrok smrti od raka u Sjedinjenim Državama, a medijan preživljenja pacijenata koji imaju III ili IV stadij bolesti, kao i većina pacijenata, mjeri se mjesecima. Za većinu pacijenata koji se kirurški ne mogu izliječiti, druge standardne terapije relativno su neučinkovite. Radioterapija, koja nudi najbolje šanse za lokoregionalnu kontrolu bolesti u pacijenata s kirurški neresektabilnom bolešću, uspješna je u samo 20% slučajeva, a lokalni primarni neuspjeh ili recidiv mogu biti jedino mjesto neuspjeha u do jedne trećine pacijenata. [ 21]

Mutacija ili inaktivacija p53 javlja se u velikom udjelu gotovo svih uobičajenih karcinoma ljudi, uključujući i karcinom pluća bez malih stanica. [21-23] S obzirom na ključnu ulogu p53 u regulaciji staničnog ciklusa i apoptozi te ulogu neispravna funkcija p53 u karcinogenezi, pokušaj zamjene p53 predstavlja logičnu strategiju zamjene gena. Moje kolege i ja stoga smo proučavali ovaj pristup kod pacijenata s nedrobnoćelijskim karcinomom pluća. Naš početni pristup temeljio se na ubrizgavanju primarnog tumora s vektorom koji eksprimira p53 divljeg tipa, s ciljem poboljšanja lokoregionalne kontrole nedrobnostaničnog raka pluća.

Odabir učinkovitog vektora

Većina raspoloživih vektora bila je neučinkovita u transdukciji gena u stanice raka. Stoga je sljedeći eksperimentalni cilj bio razviti učinkovit vektor za isporuku terapijskog gena u stanice raka. Studije modela humanih tumora in vitro i golih (imunokompetentnih) miševa pokazale su da je preuzimanje retrovirusnih vektora koji su sadržavali p53 ili antisens divljeg tipa ras bili dovoljno učinkoviti da posreduju u terapijskom učinku. Nasuprot tome, kontrolni vektori koji nose mutacije p53 povezane s rakom nisu potisnuli rast stanica, što ukazuje na to da je terapeutski učinak bio izravan rezultat normalne ekspresije p53, a ne nespecifičan učinak uzrokovan transdukcijom vektora ili sekvenci p53. [24]

Ovi eksperimenti i mnoge druge rane studije, uključujući naše prvo kliničko ispitivanje nadomjesne terapije p53 genom, koristile su retrovirusni vektor koji je sadržavao p53 cDNA divljeg tipa povezanu s promotorom b-aktina. Dok retrovirusni vektori daju razine ekspresije gena dovoljne za dokazivanje biološkog učinka, vektori izvedeni iz adenovirusa mogu postići mnogo veće razine ekspresije gena, što bi trebalo ponuditi veći terapijski potencijal.Nadalje, adenovirusni vektori imaju prednost inficiranja i diobenih i nepodijeljenih stanica, za razliku od retrovirusnih vektora, koji inficiraju samo stanice koje se aktivno dijele. Adenovirusni vektori se ne integriraju u genom, pa je ekspresija prolazna. To međutim nije nužno nedostatak kod pacijenata s rakom, budući da produljena ekspresija nije potrebna ili čak nužno poželjna nakon ubijanja tumorske stanice.

S obzirom na te teorijske prednosti adenovirusnih vektora, odabrali smo adenoviruse prve generacije u kojima su neesencijalni geni izbrisani i zamijenjeni p53 divljeg tipa koji pokreće promotor citomegalovirusa (tj. Adenovirus p53 [Ad-p53]). U studijama na životinjama, naknadni tretman s Ad-p53 uvelike je inhibirao tumorigenost intratrahealno inokuliranih stanica raka pluća. [25]

Pretklinička istraživanja genske terapije p53

Demonstracija antitumorskog učinka za normalni p53 transduciran u stanice raka koje rastu u kulturi, bile smo zabrinute da će se samo dio tumorskih stanica transducirati in vivo, ograničavajući terapijsku učinkovitost. Stoga je otkriće da virusni vektori mogu lako prodrijeti u trodimenzionalne matrice stanica raka, što ukazuje na to da će se proširiti izvan mjesta intratumoralne injekcije, bilo je ohrabrujuće. [26] Nadalje, adenovirus koji sadrži p53 divljeg tipa nije toksičan za normalne epitelne stanice bronha u kulturi, a minimalno je toksičan za miševe, čak i na vrlo visokim razinama, što ukazuje na vrlo povoljan sigurnosni profil za klinička ispitivanja. [27] Uz rad prijavljen s nedrobnostaničnim karcinomom pluća, studije na modelima golih miševa karcinoma pločastih stanica glave i vrata pokazale su značajan terapeutski učinak na adenovirus p53, potvrđujući indukciju značajne apoptoze. [28]

Unatoč visokoj učinkovitosti transdukcije stanica raka postignutom virusnim vektorima i širenju ubrizganih vektora izvan mjesta intratumoralne injekcije, malo je vjerojatno da će svaka tumorska stanica biti transducirana. In vivo studije intratumoralnih injekcija Ad-p53 u potkožne tumore kod miševa pokazale su stupanj regresije veći od onog predviđenog učinkovitošću transdukcije vektora, što ukazuje na učinke promatrača. Ovaj fenomen, koji je kritičan za postizanje široko rasprostranjenog antitumorskog učinka, prvi je put zabilježen in vivo u stanicama tumora mozga transduciranim genom timidin kinaze herpes simpleksa, a zatim izložen gancikloviru (Cytovene). Ganciklovir je netoksičan za normalne stanice, ali transducirana virusna timidin kinaza pretvara lijek u citotoksične ganciklovir trifosfate, što dovodi do smrti transduciranih tumorskih stanica. [3]

U razmišljanju o nadomjesnoj genskoj terapiji s p53 ili drugim genima za suzbijanje tumora, pokazalo se da je učinak promatrača sličan onom koji je primijećen kod gena za timidin kinazu također bio prisutan u slučaju p53. Koristeći in vivo pokuse miješanja, istraživači su pokazali da bi retrovirusne p53-transducirane stanice divljeg tipa mogle smanjiti brzinu rasta netransduciranih stanica raka pluća čovjeka, što ukazuje na operativni učinak promatrača u ovom sustavu. [29] Nekoliko mehanizama može posredovati učincima promatrača, koji se mogu razlikovati ovisno o transduciranom genu i specifičnoj vrsti tumorske stanice. Ti mehanizmi uključuju prijenos toksičnih metaboličkih produkata kroz presjeke, fagocitozu apoptotskih vezikula mrtvih tumorskih stanica živim tumorskim stanicama koje posreduju u apoptozi, indukciju imunološkog odgovora na tumor i inhibiciju angiogeneze.

Takozvani receptor smrti, Fas, također može posredovati protutumorskom učinku promatrača nakon transdukcije vektora ekspresije p53. Na primjer, stanice raka pluća H358 izražavaju obilni Fas ligand, ali ne i Fas protein potreban za apoptozu. P53 divljeg tipa regulira ekspresiju proteina Fas u tim stanicama, a budući da se protein oslobađa u topljivom obliku, može se prometiti do drugih stanica, što dovodi do učinka promatrača. [30]

Ekspresija gena p53 divljeg tipa također može smanjiti regulaciju ekspresije vaskularnog endotelnog faktora rasta, koji je jedan od najčešćih čimbenika koji potiču angiogenezu u karcinoma ljudi. Ova regulacija smanjuje stvaranje krvnih žila u tumorskim stanicama, čime se vjerojatno inhibira kontinuirani rast raka.

U drugoj studiji, rast raka pluća proučavan je pomoću ortotopskog eksperimentalnog modela u kojem su stanice raka pluća čovjeka rasle kao tumori ksenografta u nu/nu miševa. Izravno davanje retrovirusnog vektora ekspresije p53 divljeg tipa u tumorske stanice in vivo potisnulo je rast tumora. [31] Nakon toga smo upotrijebili ekspresijski vektor adenovirusa za isporuku ljudske p53 cDNA divljeg tipa u tumorske stanice. Ovaj ekspresijski vektor p53 inducirao je apoptozu u stanicama raka koje nose mutirani ili izbrisani p53, ali je imao mali učinak na rast stanica koje sadrže p53 divljeg tipa. Slični konstrukti vektora p53-adenovirusa također su inhibirali rast glioma štakora, raka glave i vrata čovjeka te raka debelog crijeva kod golih miševa i mogu posredovati u ekspresiji gena p53 u raku mjehura i jetre. [32] Utvrđeno je da proizvodi drugih gena za suzbijanje tumora, poput p16 i krnjeg gena Rb, potiskuju rast tumora na životinjskim modelima. [32]

Sinergijski učinak transduciranog p53 s drugim terapijama

Osim antitumorskog učinka transduciranih gena za suzbijanje tumora koji se koriste kao pojedinačni načini u različitim eksperimentalnim sustavima, pretkliničke studije pokazale su sinergiju između nadomjesne terapije p53 i kemoterapeutskih sredstava koja oštećuju DNA, a koja su korisna protiv nedrobnoćelijskog raka pluća, poput cisplatina i etopozid (VePesid). [33] Kemoterapija pojačava ekspresiju transduciranih gena, bez obzira koriste li se virusni ili nevirusni vektori, s nizom promotora. U jednom modelu, dodavanje cisplatina prije transfekcije p53 povećalo je apoptozu i suzbijanje rasta tumora. [34] Mehanizam koji je u osnovi ovog učinka još nije poznat. Pretkliničke studije također su pokazale da genska terapija može povećati osjetljivost na zračenje.

Testirali smo da li adenovirusno posredovana ekspresija gena p53 divljeg tipa senzibilizira stanice kolorektalnog karcinoma na ionizirajuće zračenje. [35] Prijenos gena p53 divljeg tipa u staničnu liniju kolorektalnog karcinoma SW620 izveden je pomoću Ad-p53 za procjenu učinka ekspresije p53 divljeg tipa na osjetljivost na zračenje. Na temelju činjenice da je preživljenje pri 2 Gy smanjeno s 55% na 23% (slika 1), rezultati su pokazali da je ovaj vektor senzibilizirao stanice. Citometrijska analiza protočnom citometrijskom analizom stanica označenih dUNK-biotin nick end označavanjem (TUNEL) posredovanim terminalnim deoksinukleotidil transferazom i TUNEL obojenjem tumora ksenografta pokazala je povećanje broja obilježenih stanica nakon kombiniranog liječenja. U usporedbi samo s genskom terapijom p53, ova kombinirana strategija značajno je poboljšala suzbijanje rasta tumora na životinjskom modelu potkožnog tumora. Odgoda ponovnog rasta za kontrolu veličine tumora od 1.000 mm³ bila je 2 dana za 5 Gy, 15 dana za Ad-p53 i 37 dana za Ad-p53 plus 5 Gy, što ukazuje na sinergijske interakcije. Ovi podaci ukazuju da isporuka p53 divljeg tipa u stanice s p53 mutacijama povećava njihovu osjetljivost na zračenje i da se ta isporuka može postići adenovirusno posredovanom genskom terapijom.

Provedeni su dodatni pokusi kako bi se ustanovilo hoće li Ad-p53 vektor također osjetiti ne-ćelijske stanice raka pluća na zračenje. Ispitane su dvije različite linije karcinoma pluća koje nisu male stanice, H358 i H1299. Obje ove stanične linije imaju homozigotne delecije gena p53. Linija H358 ispitana je in vitro. U ovom slučaju, stanice koje rastu u kulturi inficirane su s Ad-p53 pri višestrukoj infekciji (broj zaraznih virusnih čestica po tumorskoj stanici) od 70, a stanice su ozračene 48 sati nakon infekcije. Senzibilizacija je procijenjena pomoću in vitro klonogenskog testa. Preživljavanje pri 2 Gy smanjeno je sa 70% za stanice koje su primale samo 2 Gy na 50% za stanice koje su primale oba tretmana. Stanice H1299 ubrizgane su u stražnje noge golih miševa. Kad su tumori dosegli promjer od 6 do 8 mm, ubrizgani su im 1,5 × 10 10 virusnih čestica. Dva dana kasnije, tumori ksenografta dobili su jednu dozu zračenja od 5 Gy. Slično rezultatima s kolorektalnim ksenograftom, tumori ne-malih stanica raka pluća imali su dramatičan odgovor na kombinirano liječenje (slika 2). Odgoda ponovnog rasta na kontrolnu veličinu tumora od 1.000 mm³ iznosila je 1 dan samo za dozu 5-Gy, 14 dana samo za Ad-p53 i 36 dana za kombinaciju tretmana Ad-p53 plus 5-Gy. Stoga se činilo da rezultati kombinacije virusa i zračenja ukazuju na sinergističku interakciju i potvrđuju upotrebu ove strategije genske terapije za liječenje nedrobnostaničnog raka pluća.

Na temelju rezultata nedavno završenih pretkliničkih studija, Ad-p53 u kombinaciji s zračenjem također može biti korisna strategija za liječenje tumora mozga. Da bi se utvrdili učinci adenovirusno posredovane isporuke p53 divljeg tipa na radioaktivnost tumorskih stanica glioma, provedeni su in vitro eksperimenti. [36] Uspoređeni su odgovori dviju staničnih linija humanog glioma: U87MG, koji ima p53 divljeg tipa, i U251MG, koji ima mutirani alel p53. Monoslojne kulture ovih staničnih linija inficirane su Ad-p53, kontrolnim vektorom dl312 ili medijem za kulturu. Kulture su ozračene 2 dana kasnije i utvrđena je učinkovitost stvaranja kolonija.

Transfekcija s p53 imala je samo manji učinak na učinkovitost oblaganja neozračenih U87MG stanica, ali je značajno povećala radioosjetljivost ovih stanica. Preživjela frakcija pri 2 Gy smanjena je s 0,61 u kontrolama na 0,38 u p53-transficiranim stanicama U87MG (slika 3). Kontrolni vektor, dl312, nije utjecao na radioosjetljivost. Vektor Ad-p53 bio je toksičan za staničnu liniju U251MG pa se stoga nije mogao utvrditi njegov utjecaj na radioosjetljivost. Protočna citometrijska analiza stanica obojenih TUNEL-om pokazala je da je Ad-p53 vektor senzibilizirao U87MG stanice na apoptozu izazvanu zračenjem, postotak TUNEL-pozitivnih stanica povećan je nakon 9 Gy sa oko 3% u kontrolama na 19% u Ad -p53 plus 9-Gy-tretirane stanice. Ovi podaci ukazuju na to da p53 posredovani adenovirusom može pojačati radio-odgovor stanica tumora mozga s p53 divljeg tipa i da ta radiosenzibilizacija može barem djelomično uključiti obnavljanje sklonosti apoptozi. Dodatna potpora ovom konceptu izvedena je iz studije koja pokazuje da zračenje poboljšava učinkovitost neposredne transdukcije i trajanje ekspresije transgena iz adenovirusnog vektora. [37]

Kliničke studije

U našoj početnoj studiji na ljudima, devet pacijenata s nedrobnostaničnim karcinomom pluća primilo je retrovirusni vektor koji je sadržavao gen p53 divljeg tipa pod kontrolom promotora b-aktina. [38] Ostali tretmani bili su neuspješni kod ovih pacijenata, čiji su svi tumori dokumentirani s mutacijom p53. Budući da je bilo poznato da transdukcija putem retrovirusa daje niske titre transduciranog gena, vektor je ubrizgan u tumor 5 uzastopnih dana, pomoću bronhoskopa ili, u slučaju lezija stijenke prsnog koša, perkutane igle.

Regresija ubrizgane lezije opažena je kod tri pacijenta, dok se bolest stabilizirala kod tri druga. Jedan pacijent koji je umro od progresivne bubrežne metastaze nije pokazao dokaze o održivom tumoru na liječenom mjestu na obdukciji 4 mjeseca nakon injekcije. Primarna bolest jednog pacijenta je napredovala, a dva pacijenta su bila neprocjenjiva (jedan nije mogao podnijeti opću anesteziju pa nije završio liječenje, a drugi je umro u roku od 3 tjedna od liječenja). Studije lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili in situ hibridizacije biopsija nakon tretmana osmorice pacijenata prije procjene učinaka liječenja pokazale su da su tumorske stanice doista imale integrirane vektorske DNA sekvence u do 20% stanica u određenim područjima tumora. Važan nalaz bio je da je TUNEL bojenje (koje otkriva ubijanje DNK) uzoraka biopsije nakon tretmana pokazalo da se apoptoza povećala nakon tretmana u usporedbi s osnovnom vrijednošću prije liječenja.

Ni u jednog pacijenta nisu se pojavile nuspojave koje se mogu pripisati sekvencama p53-vektora, iako su se u tri pacijenta pojavile komplikacije povezane s bronhoskopijom. Nismo pronašli dokaze o retrovirusnim sekvencama u DNK ekstrahiranim iz limfocita, uzoraka sputuma ili različitih netumorskih tkiva dobivenih obdukcijom na tri pacijenta. Ovi rezultati potvrdili su visoki sigurnosni profil, uspješnu isporuku normalnih sekvenci p53 tumorskim stanicama i biološki učinak transduciranog gena.

Ovi obećavajući rezultati potkrijepljeni su novijom studijom u dvije ruke u kojoj je gen p53 divljeg tipa davan 52 bolesnika s nedrobnostaničnim karcinomom pluća pomoću adenovirusnog vektora. Pacijenti su primali Ad-p53 sami ili mu je prethodio cisplatin, 80 mg/m² tijekom 2 sata, 3 dana prije injekcije p53 (cisplatin je odabran zbog pretkliničkih dokaza o sinergističkom učinku zamjenom gena p53). Davana je jedna intratumoralna injekcija p53, bilo bronhoskopski ili vođena računalnom tomografijom, jednom mjesečno do 6 mjeseci. Većina pacijenata je prethodno primila kemoterapiju, u nekim slučajevima cisplatinom, a svi su imali progresiju tumora tijekom konvencionalne terapije prije ulaska u studiju.

Kao i kod ispitivanja korištenjem retrovirusnog vektora, viđeni su i klinički i laboratorijski dokazi ekspresije p53. Samo je Ad-p53 (26 pacijenata koji se mogu ocijeniti) posredovao u dva djelomična odgovora i stabilizirao bolest u 16 pacijenata. Veća doza Ad-p53 povećala je preživljenje bez progresije bolesti. Ad-p53 plus cisplatin (23 pacijenta koji se mogu ocijeniti) posredovao je djelomičnim odgovorom kod dva pacijenta koji su prethodno bili liječeni cisplatinom. Jedan dodatni pacijent postigao je djelomičan odgovor, ali nije imao potrebnu prateću dokumentaciju za potvrdu odgovora. Ad-p53 plus cisplatin produljilo je preživljavanje bez progresije u usporedbi sa samim Ad-p53. Većina pacijenata također je imala dokaze o vektorskoj DNK pomoću PCR -a post -tretmanskih biopsija. Iako su antiadenovirusna protutijela otkrivena u svih pacijenata nakon jednog tretmana, nakon anamnestičkog liječenja nije bilo anafilaksije ili drugih toksičnosti osim prolazne groznice. Možda je iznenađujuće, unatoč visokim razinama antiadenovirusnih antitijela u serumu, došlo je do ekspresije p53 transgena u tumorskim stanicama, a klinički odgovori su zadržani.

Iako su ove studije ispravile samo jednu od mnogih genetskih abnormalnosti prisutnih u karcinomu pluća bez malih stanica, dokazi ukazuju na antitumorski učinak koji se temelji izravno na apoptozi posredovanoj p53, kao što je pokazano u retrovirusnom ispitivanju p53. Dva ispitivanja nisu dala dokaze za suprotno mišljenje da je stabilizacija i regresija tumora rezultat nespecifične imunološke reakcije. U studiji Ad-p53, PCR je otkrio vektorsku DNA kod većine pacijenata, ali je manje pacijenata pokazalo dokaze o ekspresiji gena. Detekcija ekspresije gena nakon prijenosa p53 divljeg tipa in vivo je teška jer uspješan prijenos i ekspresija p53 divljeg tipa u tumoru mogu uništiti dokaze o ekspresiji gena ako se inducira apoptoza i stanice umru. Međutim, u onih pacijenata čija se serijska ekspresija gena mogla kvantificirati imunohistokemijom, bilo je jasno da se ekspresija transgena dogodila unatoč prisutnosti visokih titra antiadenovirusnih antitijela. Moguće je da protutijela u serumu imaju mali učinak zbog slabe penetracije čvrstih tumora kao posljedice visokog tlaka intersticijske tekućine. Nije poznato bi li potiskivanje imunološkog odgovora antiadenovirusa dodatno povećalo razinu ekspresije transgena u tumoru, nije poznato. U svakom slučaju, ponovljene intratumoralne injekcije adenovirusnog p53 djeluju sigurno unatoč povećanju antiadenovirusnih antitijela.

Slična strategija zabilježena je za liječenje ponavljajućih karcinoma pločastih stanica glave i vrata. [39] Pacijenti s rakom glave i vrata mogu imati koristi od poboljšane lokalne kontrole, jer je glavni uzrok smrti ovih pacijenata lokoregionalni recidiv. U studiji o povećanju doze faze I, 33 pacijenata dobilo je dozu do 1011 jedinica koje stvaraju plak. Nisu primijećene toksičnost koja ograničava dozu niti ozbiljni nuspojave. Dokumentirana je ekspresija gena u tumorskom tkivu. Dva od 17 pacijenata koji su imali neresektabilnu bolest imali su djelomičan odgovor, a šest je imalo stabilnu bolest do 3,5 mjeseca. Zabilježeno je da je jedan od pacijenata s resektabilnom bolešću imao potpuni patološki odgovor u vrijeme resekcije. Infektivni Ad-p53 otkriven je u ispljuvku i urinu pri najvećim dozama od 1011 zaraznih čestica. Zanimljivo je da se tijek vremena izlučivanja nije promijenio u trajanju ili količini s naknadnim injekcijama unatoč prisutnosti visokih titra antiadenovirusnih antitijela. To izaziva intrigantnu mogućnost da antitijelo ne može ograničiti bioraspoloživost sistemski primijenjenog Ad-p53.

Buduća istraživanja i zaključci

Prvi pacijent liječen retrovirusnim p53 primio je opću anesteziju, no ambulantno se liječenje sada provodi samo lokalnom anestezijom. Injekcija traje oko 20 minuta. Jednostavnost postupka liječenja sugerira da prijenos gena pomoću Ad-p53 može pružiti visoko isplativu terapiju. S obzirom na obećavajuće rezultate ovih studija I. faze, sada su u tijeku ispitivanja II. Faze kod pacijenata s nedrobnoćelijskim karcinomom pluća ili rakom glave i vrata, a također su u tijeku i planovi za proširenje ovih studija na pacijente s lokalno ponavljajućom dojkom , tumori mjehura i jajnika koji bi mogli imati koristi od agresivnijeg liječenja lokoregionalne bolesti. Na temelju obećavajućih pretkliničkih podataka koji ukazuju na to da su Ad-p53 i ionizirajuće zračenje sinergistički u izazivanju apoptoze stanica raka, započeto je ispitivanje faze II u bolesnika s neresektabilnim, neliječenim karcinomom malih stanica bez kombinacije Ad-p53 danog intratumoralnom injekcijom terapijom ionizirajućeg zračenja vanjskim snopom.

Niski titar virusa postignut s retrovirusnim p53 vektorom i njegova inhibicija cirkulirajućim komplementom čine ga neprikladnim za sustavnu (a ne intratumoralnu) primjenu. Ova ograničenja ne vrijede za vektor adenovirusa, ali njegova sistemska uporaba zahtijevala bi pojačanu ekspresiju transgena, nisku toksičnost vektora i, idealno, uklanjanje imunološkog odgovora na vektor. Modifikacija korištenih vektora može smanjiti ekspresiju endogenih adenovirusnih proteina, što dovodi do smanjenja anti-adenovirusnog imunološkog odgovora. [40] Dodavanje sredstava koja pojačavaju ekspresiju transgena može povećati učinkovitost niske razine ekspresije transgena dovoljno da ih učini terapijskim.

Također bi bila korisna metoda usmjeravanja isporuke na tumor. Rani klinički radovi sugeriraju da se neki sistemski učinak javlja iz adenovirusa koji je izbačen s mjesta intratumoralne injekcije, jer su dokazi obdukcije pokazali da je vektorska DNA otkrivena u udaljenim naslagama tumora. Ostala područja sadašnjeg istraživanja uključuju metode povećanja razine ekspresije p53 i suzbijanje imunološkog odgovora istovremenom primjenom niskih doza etopozida. [32]

Zaključno, klinička ispitivanja pokazala su da se ponovljena intratumoralna primjena Ad-p53 dobro podnosi i nije povezana s velikom toksičnošću. Dokazi podržavaju i prijenos gena i ekspresiju gena u većini tumora. Progresivno rastući tumori otporni na konvencionalne tretmane pokazali su objektivne kliničke odgovore na Ad-p53.

U bliskoj budućnosti, potencijalno obećavajuća područja za nadomjesnu gensku terapiju uključuju liječenje lokalno uznapredovale bolesti, adjuvantno i neoadjuvantno liječenje pacijenata s resektabilnim tumorima, uporabu genske terapije za senzibiliziranje tumora na radioterapiju i kemoterapiju te, potencijalno, liječenje lokalizirana premalignost. Genska nadomjesna terapija također može zaokružiti jer temeljna i klinička istraživanja raka također mogu pomoći u rješavanju prepreka koje su spriječile primjenu genske terapije na monogene nasljedne bolesti. S obzirom na brz tempo nedavnog napretka i eksploziju interesa za gensku terapiju, zamišljamo da će u bliskoj budućnosti genska terapija zauzeti svoje mjesto uz kemoterapiju, radioterapiju i kirurgiju kao jedan od rutinski dostupnih alata za liječenje pacijenata s rakom .

Reference:

1. Anderson WF: Ljudska genska terapija. Science 256: 808-813, 1992.

2. Blaese RM, Culver KW, Miller AD, et al: Genska terapija usmjerena na limfocite T za ADA-SCID: Prvi rezultati ispitivanja nakon 4 godine. Science 270: 475-480, 1995. (znanstveni rad).

3. Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, et al: In vivo prijenos gena s retrovirusnim stanicama-proizvođačima vektora za liječenje eksperimentalnih tumora mozga. Science 256: 1550-1552, 1992.

4. Biskup JM: Molekularne teme u onkogenezi. Ćelija 64: 235-248, 1991.

5. Weinberg RA: Geni za suzbijanje tumora. Science 254: 1138-1146, 1991.

6. Weinberg RA: Onkogeni i tumorski supresorski geni. CA Cancer J Clin 44: 160-170, 1994.

7. Werness BA, Levine AJ, Howley PM: Povezanost proteina humanog papiloma virusa 16 i 18 E6 s p53. Science 248: 76-79, 1990. (monografija).

8. Baker SJ, Markowitz S, Fearon ER, et al: Suzbijanje rasta stanica humanog kolorektalnog karcinoma p53 divljeg tipa. Science 249: 912-915, 1990. (monografija).

9. Mukhopadhyay T, Cavender A, Tainsky M, et al: Ekspresija antisense k-ras poruke u staničnoj liniji humanog raka pluća sa spontanim aktiviranim onkogenom k-ras mijenja transformirani fenotip (sažetak 1799). Proc Am Assoc Cancer Res 31: 304-304, 1990.

10. Takahashi T, Carbone D, Takahashi T, et al: Divlji tip, ali ne i mutantni p53 potiskuje rast stanica raka pluća kod ljudi koje nose više genetskih lezija. Cancer Res 52: 2340-2343, 1992.

11. Bookstein R, Shew JY, Chen PL, et al: Suzbijanje tumorigenosti stanica karcinoma prostate kod ljudi zamjenom mutiranog RB gena. Science 247: 712-715, 1990. (monografija).

12. Alemany R, Ruan S, Kataoka M, et al: Inhibitorni učinak rasta anti-K-ras adenovirusa na stanice raka pluća. Cancer Gene Ther 3: 296-301, 1996.

13. Chen PL, Scully P, Shew JY, et al: Fosforilacija proizvoda gena retinoblastoma modulirana je tijekom staničnog ciklusa i stanične diferencijacije. Ćelija 58: 1193-1198, 1989.

14. Kaelin WG Jr, Pallas DC, DeCaprio JA, et al: Identifikacija staničnih proteina koji mogu posebno stupiti u interakciju s regijom vezanja T/E1A produkta gena retinoblastoma. Ćelija 64: 521-532, 1991.

15. Eastham JA, Hall SJ, Sehgal I, et al: In vivo genska terapija s adenovirusom p53 ili p21 za rak prostate. Cancer Res 55: 5151-5155, 1995. godine.

16. Harper JW, Adami GR, Wei N, et al: P21 protein Cipk koji djeluje na Cdk snažan je inhibitor G1 ciklin-ovisnih kinaza. Ćelija 75: 805-816, 1993.

17. el-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, et al: WAF1, potencijalni medijator supresije tumora p53. Ćelija 75: 817-825, 1993.

18. Polyak K, Waldman T, He TC, et al: Genetske determinante p53-inducirane apoptoze i zaustavljanja rasta. Genes Dev 10: 1945-1952, 1996.

19. Yonish-Rouach E, Resnitzky D, Lotem J, et al: p53 divljeg tipa inducira apoptozu mijeloidnih leukemijskih stanica koje inhibira interleukin-6. Nature 352: 345-347, 1991.

20. Harris CC: Gen za supresiju tumora p53 kao meta za nove terapije protiv raka. Adv Oncol 14: 3-10, 1998.

21. Schaake-Koning C, van den Bogaert W, Dalesio O, et al: Učinci istodobnog cisplatina i radioterapije na neoperabilan karcinom pluća bez malih stanica. N Engl J Med 326: 524-530, 1992.

22. Chiba I, Takahashi T, Nau MM, et al: Mutacije u genu p53 česte su u primarnom, reseciranom nedrobnostaničnom karcinomu pluća: Studijska grupa za rak pluća. Onkogen 5: 1603-1610, 1990. godine.

23. Harris CC: Predavanje Waltera Huberta iz 1995.-Molekularna epidemiologija raka kod ljudi: Uvid u mutacijsku analizu gena za supresiju tumora p53. Br J Cancer 73: 261-269, 1996.

24. Cai DW, Mukhopadhyay T, Liu Y, et al: Stabilna ekspresija gena p53 divljeg tipa u stanicama raka pluća čovjeka nakon transfera gena posredovanog retrovirusom. Hum Gene Ther 4: 617-624, 1993.

25. Zhang WW, Fang X, Mazur W, et al: Visokoučinkoviti prijenos gena i ekspresija na visokoj razini p53 divljeg tipa u stanicama raka pluća čovjeka posredovana rekombinantnim adenovirusom. Cancer Gene Ther 1: 5-13, 1994.

26. Fujiwara T, Grimm EA, Mukhopadhyay T, et al: Retrovirusni ekspresijski vektor divljeg tipa p53 prodire u sferoide raka pluća ljudi i inhibira rast induciranjem apoptoze. Cancer Res 53: 4129-4133, 1993.

27. Zhang WW, Alemany R, Wang J, et al: Procjena sigurnosti Ad5CMV-p53 in vitro i in vivo. Hum Gene Ther 6: 155-164, 1995.

28. Clayman GL, Liu TJ, Overholt SM, et al: Genska terapija za rak glave i vrata: Usporedba tumora supresorskog gena p53 i regulatora staničnog ciklusa WAF1/CIP1 (p21). Arch Otolaryngol Head Neck Surg 122: 489-493, 1996.

29. Nishizaki M, Fujiwara T, Tanida T, et al: Rekombinantni adenovirus koji eksprimira p53 divljeg tipa je antiangiogen: predloženi mehanizam za učinke promatrača. Clin Cancer Res 5: 1015-1023, 1999.

30. Owen-Schaub LB, Zhang W, Cusack JC, et al: Ljudski p53 divljeg tipa i mutant osjetljiv na temperaturu induciraju ekspresiju Fas/APO-1. Mol Cell Biol 15: 3032-3040, 1995.

31. Fujiwara T, Cai DW, Georges RN, et al: Terapeutski učinak retrovirusnog ekspresijskog vektora divljeg tipa p53 u ortotopijskom modelu raka pluća. J Natl Cancer Inst 86: 1458-1462, 1994.

32. Roth JA, Cristiano RJ: Genska terapija za rak: Što smo učinili i kamo idemo? J Natl Cancer Inst 89: 21-39, 1997.

33. Fujiwara T, Grimm EA, Mukhopadhyay T, et al: Indukcija kemosenzitivnosti u stanicama raka pluća čovjeka in vivo adenovirusno posredovanim prijenosom gena p53 divljeg tipa. Cancer Res 54: 2287-2291, 1994.

34. Nguyen DM, Spitz FR, Yen N, et al: Genska terapija za rak pluća: Poboljšanje supresije tumora kombinacijom sekvencijalnog sustavnog cisplatinskog i adenovirus-posredovanog transfera gena p53. J Thorac Cardiovasc Surg 112: 1372-1377, 1996.

35. Spitz FR, Nguyen D, Skibber JM, et al: Adenovirusno posredovana ekspresija gena p53 divljeg tipa senzibilizira stanice kolorektalnog karcinoma na ionizirajuće zračenje. Clin Cancer Res 2: 1665-1671, 1996.

36. Lang FF, Yung WK, Raju U, et al: Poboljšanje radioosjetljivosti stanica humanog glioma p53 divljeg tipa dostavljanjem gena p53 posredovanog adenovirusom. J Neurosurg 89: 125-132, 1998.

37. Stevens CW, Zeng M, Cerniglia GJ: Ionizirajuće zračenje uvelike poboljšava učinkovitost prijenosa gena u stanicama sisavaca. Hum Gene Ther 7: 1727-1734, 1996.

38. Roth JA, Nguyen D, Lawrence DD, et al: Retrovirusno posredovani transfer gena p53 divljeg tipa na tumore pacijenata s rakom pluća. Nat Med 2: 985-991, 1996.

39. Clayman GL, el-Naggar AK, Lippman SM, et al: Adenovirus-posredovani transfer gena p53 u pacijenata s uznapredovalim recidivirajućim karcinomom pločastih stanica glave i vrata. J Clin Oncol 16: 2221-2232, 1998.

40. Kovesdi I, Brough DE, Bruder JT, et al: Adenovirusni vektori za prijenos gena. Curr Opin Biotechnol 8: 583-589, 1997.


Gledaj video: Kako GLAZBA djeluje na ZDRAVLJE? (Lipanj 2022).


Komentari:

  1. Aubin

    Koje potrebne riječi...super, izvanredna ideja

  2. Kazirn

    I think, that you are mistaken. Mogu braniti položaj. Pišite mi u PM, razgovarat ćemo.

  3. Dorrin

    Mislim da griješite. Razgovarajmo o tome. Pošaljite mi e -poštu u PM.

  4. Joseph

    The site is super, I will recommend it to all my friends!

  5. Taulabar

    Dopuštate grešku. mogu to dokazati.

  6. Kemen

    Ovaj je post, neusporediv))), sviđa mi se :)

  7. Jovon

    I consider, that you have misled.

  8. Arashisho

    Very curious:)



Napišite poruku