Informacija

Tehnike za prikaz interakcije proteina heterodimer-DNA

Tehnike za prikaz interakcije proteina heterodimer-DNA


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Poznato je da c-Jun i fos dimeriziraju da tvore AP1 faktor koji se veže za sekvencu na DNA koja sadrži PyPuGACGTCNNNNGAGGTCPyPU. U staničnim linijama raka jednjaka nema ekspresije gena fos. Međutim, još uvijek vidimo ekspresiju gena reguliranu faktorom AP1. Jedna od mogućnosti je da se u tim stanicama izrazi još jedna izoforma fos (npr. Fra1).

  1. Kako ćete provjeriti je li fra1 izražen ili ne u tim ćelijama.
  2. Kako ćete provjeriti sadrži li heterodimer vezan za datu DNK fra-1 zajedno s c-jun.


Moje mišljenje o gornjim pitanjima

Za prvo pitanje možemo napraviti imunofluorescentni test ili test afiniteta prema DNA u kojem kemijski sintetiziramo sekvencu DNA i vežemo je na kolonu gela agaroze, prolazeći kroz nju proteinski ekstrakt stanica raka jednjaka i naš fra-1 protein ako se izražava u staničnoj liniji će se vezati za DNK. kasnije možemo eluirati kompleks proteinske DNA, a antitijelom protiv fra1 možemo provjeriti je li eksprimiran. No, nedostatak obje ove tehnike je što bismo trebali poznavati epitop fra-1.

Za drugo pitanje-možemo izvesti ChIP pomoću antitijela označenog protiv c-jun, a zatim eluirati DNK vezanu za c-jun. Tada možemo istovremeno označiti kompleks s anti fra-1 u jednom uzorku i anti fos u drugom uzorku. Možemo provjeriti rezultate. Ako se dobije fluorescencija u uzorku fra-1, to znači da su i c-jun i fra vezani za sondu, a ne za fos.


Kako ćete provjeriti je li fra1 izražen ili ne u tim ćelijama.

RT-PCR je brza i laka metoda za provjeru ekspresije. Međutim, govori vam samo o ekspresiji razine RNA i morali biste raditi s pretpostavkom da je koncentracija RNA izravno proporcionalna koncentraciji proteina.

S obzirom na to da nemate antitijela za fra1, možete ići na masenu spektrometrijsku kvantifikaciju proteina. Dobar je za analizu velike propusnosti i općenito je rasipan kada samo želite proučiti jedan protein. Međutim, ljudi provode ciljanu proteomiku kako bi proučili nekoliko proteina.

Alternativno, uz određeni napor možete zapravo razviti antitijelo za fra1.

Kako ćete provjeriti sadrži li heterodimer vezan za datu DNK fra-1 zajedno s c-jun.

Prikazivanje trostrukih kompleksa (fra-jun-DNA) pomalo je teško. Relativno je jednostavno prikazati parove. Možete pokazati da dva proteina tvore kompleks in vivo izvođenjem koimunoprecipitacije nakon čega slijedi detekcija bilo Western blotom bilo masenom spektrometrijom.

Također možete pokazati interakciju biofizičkim tehnikama koje uključuju FRET i SPR, ali one se ne mogu izvesti in vivo (barem SPR. FRET se može učiniti, ali postoje ograničenja).

Možete pokazati interakciju DNK-protein pomoću ChIP-seq-a kao što ste spomenuli u svom pitanju.

Prikazivanje sve tri zajedno pomalo je zeznuto.

To možete učiniti pomoću in vitro testovi koji koriste fluorescentno obilježene (jedan GFP i drugi RFP; ili FRET parovi)/prilagođeni epitop označen (na primjer, jedan FLAG, a drugi HA označen) proteine ​​i poznatu sekvencu DNA generiranu PCR/DNK sintezom. Možete upotrijebiti EMSA zajedno s otkrivanjem protutijela/fluorescencije za prikaz trostrukog kompleksa.

Možete neizravno zaključiti o prisutnosti trostrukog kompleksa kada ChIP-seq koji koristi antitijela za oba proteina pokazuje istu DNK sekvencu u očitanjima. Također možete izraziti protein označen zastavicom (ili bilo koju drugu oznaku), ako u slučaju da nemate antitijela za proteine.


PPIevo: predviđanje interakcije protein-protein iz evolucijskih informacija temeljenih na PSSM-u

Interakcije protein-protein reguliraju različite stanične procese. Postoji velika potreba za računalnim metodama kao nadopunom eksperimentalnim metodama pomoću kojih se mogu predvidjeti proteinske interakcije zbog postojanja mnogih ograničenja uključenih u eksperimentalne tehnike. Ovdje predstavljamo novi algoritam ekstrakcije značajki temeljen na evoluciji za predviđanje interakcije protein-protein (PPI). Algoritam se naziva PPIevo i ekstrahira evolucijsko obilježje iz Matrice bodovanja specifične za poziciju (PSSM) proteina poznate sekvence. Algoritam ne ovisi o bilješkama proteina, a značajke se temelje na evolucijskoj povijesti proteina. To omogućuje algoritmu veću moć predviđanja interakcije protein-protein od mnogih algoritama temeljenih na slijedu. Rezultati u bazi podataka HPRD -a pokazuju bolje performanse i robusnost predložene metode. Također otkrivaju da bi negativan odabir skupa podataka mogao dovesti do akutnog precjenjivanja performansi, što je glavni nedostatak dostupnih metoda.

Ključne riječi: Računalna inteligencija Strojno učenje Matrica bodovanja specifična za poziciju Mreže interakcija proteina Mapa interakcije protein-protein.


Pregled interakcija proteina i nukleinske kiseline

Proteini stupaju u interakciju s DNA i RNA kroz slične fizičke sile, koje uključuju elektrostatičke interakcije (slani mostovi), dipolarne interakcije (vodikove veze, H-veze), entropijske učinke (hidrofobne interakcije) i disperzijske sile (slaganje baza). Ove sile u različitom stupnju doprinose vezanju proteina na način koji je specifičan za sekvencu (tijesan) ili koji nije specifičan za sekvencu (labav). Na primjer, specifične interakcije protein-DNA obično su posredovane motivom α-spirale u proteinu koji se ubacuje u glavni utor DNA, prepoznajući i stupajući u interakciju sa specifičnom sekvencom baze kroz H-veze i mostove soli. Osim toga, afinitet i specifičnost određene interakcije protein-nukleinska kiselina mogu se povećati oligomerizacijom proteina ili stvaranjem kompleksa više proteina (npr. GCN4, receptor glukokortikoida, kompleksi za iniciranje transkripcije, kompleksi za spajanje mRNA, RISC itd.). Sekundarna i tercijarna struktura koju tvore sekvence nukleinskih kiselina (osobito u RNA) pruža važan dodatni mehanizam po kojem proteini prepoznaju i vežu određene sekvence nukleinske kiseline.

Bilješka o prijavi: Analiza androgeno ovisne i neovisne regulacije transkripcijske aktivnosti

Ova bilješka o prijavi opisuje uporabu testa imunoprecipitacije kromatina (ChIP) za praćenje interakcije između receptora androgena (AR) i elemenata odgovora na androgene (ARE) u DNA. Linijska stanična linija raka prostate LNcaP bila je izložena testosteronu, a Thermo Scientific Pierce Magnetic ChIP Kit je upotrijebljen s anti-AR antitijelom nakon čega slijedi qPCR. Na slici lijevo prikazane su promjene u vezivanju AR-a za poznate ARE (PSA, CDKN1A, FKBP5, TMPRSS2 i IGF-1), s 300-kratnom promjenom na FKBP5 ARE 30 minuta nakon tretmana. Ovaj komplet omogućuje učinkovitu izolaciju DNK vezane na kromatin imunoprecipitacijom za oko 8 sati sa samo 10 000 stanica.

Naš tehnički priručnik o interakciji proteina na 72 stranice sadrži protokole i tehničke podatke i podatke o proizvodima koji pomažu u postizanju maksimalnih rezultata za studije interakcija proteina. Priručnik nudi pozadinu, korisne savjete i savjete za rješavanje problema za imunoprecipitacijske i ko-imunoprecipitacijske testove, pull-down testove, daleko-zapadno brisanje i umrežavanje. Priručnik također sadrži prošireni odjeljak o metodama za proučavanje interakcija proteina i nukleinske kiseline, uključujući ChIP, EMSA i RNA EMSA. Priručnik je bitan izvor za svaki laboratorij koji proučava interakcije proteina.

Sadržaj uključuje: Uvod u proteinske interakcije, Co-imunoprecipitacijske testove, Pull-down testove, Far-Western blotting, Mapiranje interakcije proteina, Dva hibridna reporterska testa kvasca, Elektroforetske promjene mobilnosti [EMSA], Imunoprecipitacijske testove na kromatinu (ChIP), Proteine –Konjugati nukleinske kiseline i drugo.

Domene vezanja nukleinske kiseline

Funkcija vezanja proteina za DNA ili RNA lokalizirana je u diskretnim konzerviranim domenama unutar njegove tercijarne strukture. Pojedinačni protein može imati više ponavljanja iste domene vezanja nukleinske kiseline ili može imati nekoliko različitih domena unutar svoje strukture. Identitet pojedinih domena i njihov relativni raspored funkcionalno su važni unutar proteina. Nekoliko uobičajenih domena vezanja DNK uključuju prste cinka, helix-turn-helix, helix-loop-helix, krilatu spiralu i leucine zatvarač. Specifičnost i funkcija vezanja za RNA sastavljene su od domena cinka, KH, S1, PAZ, PUF, PIWI i RRM (motiv za prepoznavanje RNA). Više domena za vezanje nukleinskih kiselina s jednim proteinom može povećati specifičnost i afinitet proteina za određene sekvence ciljne nukleinske kiseline, posredovati u promjeni topologije ciljane nukleinske kiseline, pravilno postaviti druge sekvence nukleinskih kiselina radi prepoznavanja ili regulirati aktivnost enzimskih domene unutar vezivnog proteina.

Složene interakcije

Proteini se mogu vezati izravno na nukleinsku kiselinu ili neizravno putem drugih vezanih proteina, učinkovito stvarajući hijerarhiju interakcija. Snaga ovih interakcija utječe na to koji su testovi ili pristupi najbolji za proučavanje složenih sklopova. Neke od ovih interakcija su prolazne i zahtijevaju stabilizaciju kemijskim umrežavanjem prije izolacije kompleksa. Razumijevanje interakcije proteina s nukleinskim kiselinama, određivanje proteina prisutnih u ovim kompleksima protein-nukleinska kiselina i identificiranje sekvence/strukture nukleinske kiseline potrebne za sastavljanje ovih kompleksa od vitalnog su značaja za razumijevanje uloge ovih kompleksa u regulaciji staničnih procesa.

Saznajte više

Odaberite proizvode

Uobičajene domene koje se vežu za DNA, helix-turn-helix i domete cinkovih prstiju ugrađene su u brojne proteine ​​koji se vežu za DNA izražene u stanici. Specifičnost je izvedena iz interakcija višeg reda koje uključuju nukleoproteinske komplekse. Ovi proteinski kompleksi koji vežu DNK pronalaze svoj cilj "klizanjem" duž genomske DNA dok se ne otkrije njihovo specifično mjesto za spajanje DNA. Vezivanje proteina za DNA kontrolira strukturu genomske DNA (kromatin), transkripciju RNA i mehanizme popravka DNA. Sljedeći primjer ilustrira kako se magnetske kuglice Invitrogen Dynabeads mogu koristiti za oporavak proteina koji se vežu za nukleinske kiseline.

Izoliranje proteina koji vežu DNA i RNA. Proteini koji vežu DNA i RNA mogu se izolirati pomoću Invitrogen Dynabeads M-280 Streptavidina. Prvo, biotinski obilježena DNA/RNA ciljna sekvenca imobilizirana je na kuglice streptavidina. Zatim se inkubiraju s ekstraktom proteina, a vezani proteini izoliraju magnetskom separacijom. Protein se tada može eluirati radi karakterizacije. Ove kuglice imaju nisko nespecifično vezanje proteina i idealne su za izolaciju proteina koji vežu RNA i DNA.

Kromosomi

Glavna funkcija interakcija protein -DNA je upravljanje velikom duljinom genetskog materijala sadržanog u svakoj stanici. Kromosomi su evoluirali kako bi zapakirali, pohranili i premjestili DNK kroz stanicu, ali također imaju ulogu u regulaciji transkripcije. Preoblikovanje kromosoma omogućuje otkrivanje selektivnih dijelova kromosoma tako da je DNK dostupna za transkripciju gena ili da ostane čvrsto zapakirano tako da se transkripcija kodiranih gena potpuno utiša.

Transkripcijska regulacija

Jednom otkrivena genomska DNA može se transkribirati, ali ne kodiraju svi proteinski proteini DNK sekvence. Samo se geni transkribiraju za proizvodnju RNA, a sekvence između gena (i unutar njih) služe za regulaciju transkripcije vezanjem na proteine. Ove su sekvence važne za kontrolu transkripcije, a sadrže promotore, pojačivače, izolatore i razmaknice. Enhancer sekvence, koje mogu biti mnogo kilobaza udaljene od početnog mjesta gena, vežu proteine ​​i djeluju kao svjetionici za privlačenje transkripcijskog stroja. Transkripcija gena započinje kada se proteini transkripcijskog faktora vežu na specifične DNA promotorske sekvence koje se nalaze neposredno uz početno mjesto transkripcije gena. Ova interakcija je olakšana kroz domenu (e) vezanja za DNA transkripcijskog faktora. Putem interakcija proteina, trans-aktivacijska domena transkripcijskog faktora olakšava vezanje i lokalizaciju holoenzima RNA polimeraze II za promotor gena kako bi se pokrenula proizvodnja glasničke RNA (mRNA)

Saznajte više

Odaberite proizvode

Proteini stupaju u interakciju s RNA kako bi spojili, zaštitili, preveli ili degradirali poruku. Prva interakcija događa se neposredno nakon transkripcijske inicijacije, kada se komplement promotorske sekvence odcijepi od mRNA, a mehanizam za zatvaranje uključuje "GpppN" kapu na 5 'kraju mRNA. To rezultira angažiranjem faktora produljenja koji reguliraju poništavanje transkripcije mRNA. Nakon produženja slijedi obrada i spajanje na 3'-kraju, što rezultira zrelim RNA transkriptom koji se izvozi u citoplazmu radi prevođenja. Svi ti procesi zahtijevaju značajne interakcije proteina i RNK te su vrlo regulirani i složeni. Mnogi regulatorni elementi ovog procesa nalaze se u nekodiranim 3 'i 5' neprevedenim regijama (UTR) mRNA. Međutim, regulatorne mikroRNA (miRNA) također se pojavljuju u kodirajućim regijama introna, kao i u egzonima, nekodirajućim genima i elementima koji se ponavljaju. Posljednjih godina sve je veći naglasak stavljen na važnost ovih nekodiranih RNK ​​sekvenci i njihovu ulogu u staničnoj regulaciji i bolesnim stanjima. Međutim, alati za proučavanje kritičnih interakcija protein -RNA bili su ograničeni. Podaci prikazani u ovom primjeru generirani su pomoću eksperimenta spuštanja RNA-protein koristeći Thermo Scientific Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit.

Pokus spuštanja RNA-proteina. Vezanje 3’-UTR RNA divljeg tipa i mutiranog receptora androgena na proteine ​​HuR i Poly (C) BP ispitivano je pomoću Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit. Uzorci su normalizirani po volumenu. L = opterećenje lizatom, FT = protok, E = eluat. Ovaj komplet pruža robusnu metodu za obogaćivanje interakcija protein -RNA.

5 'i 3' UTR

UTR regije mRNA sadrže elemente sekvence koji regrutiraju proteine ​​koji vežu RNA za post-transkripcijsku regulaciju i translaciju proteina. Osim toga, ti elementi potiču stabilnost ili degradaciju transkripta i mogu usmjeriti subcelularnu lokalizaciju RNA. Ovi regulatorni elementi RNA razlikuju se po duljini, ali se za vezanje na proteine ​​oslanjaju i na primarnu i na sekundarnu strukturu. Na primjer, regulacija željeza u stanici strogo je reguliran proces gdje je interakcija protein -RNA ključna za održavanje homeostaze željeza. Ciljani geni, poput feritina za skladištenje željeza, feritina ili receptora transferina, sadrže malu količinu (

28 nukleotida) konsenzusni element osjetljiv na željezo (IRE) u svojim odgovarajućim 5 'ili 3' UTR. Protein koji reagira na željezo (IRP) reagira na stanični status željeza vežući IRE element. U uvjetima izgladnjelog željeza, IRP ostaje vezan za IRE element kako bi potisnuo translaciju proteina za skladištenje željeza. U uvjetima bogatim željezom, aktivnost vezanja IRP-a za IRP se gubi i proteini za skladištenje željeza se prevode. Mnogi od ovih elemenata konsenzusa o RNK identificirani su i razvrstani u različite obitelji na temelju slijeda i funkcije. 3 'UTR također sadrži elemente za prepoznavanje miRNA, koji su odgovorni za potiskivanje proteinske translacije kodirajuće mRNA.

MikroRNK

MikroRNA (miRNA) su velika i sveprisutna klasa nekodirajućih RNA koje reguliraju post-transkripcijsko utišavanje ciljane mRNA. U ljudskom genomu je identificirano više od 700 miRNA. MikroRNA imaju vezne sekvence prepoznavanja u 57,8% ljudskih mRNA, pri čemu 72% sadrži te mRNA s više mjesta prepoznavanja miRNA. MiRNA počinje kao transkribirana RNA (pre-miRNA) sa 70-100 nukleotida koja sadrži područje sjemena 6-8 nukleotida na kraju 5 'za vezanje na mRNA. MiRNA se zatim cijepa pomoću DROSHA -e, nuklearne endoribonukleaze III. Pre-miRNA se zatim povezuje s dvolančanim proteinima koji vežu RNA i aktivno se izvozi u citoplazmu, ovisno o Exportin 5 i Ran GTPazi. Pre-miRNA se zatim dalje obrađuje u kompleksu ribonukleoproteina (RNP) koji se sastoji od proteina Argonaute i Dicer-a (endoribonukleaza III), koji cijepa pre-miRNA u zrelu 19-22 nukleotidnu miRNA. Kompleks miRNA-Argonaute tada se veže za ciljane gene i regrutira dodatne neidentificirane proteine ​​za regulaciju ciljnih gena.

Regulacija mRNA

U većini slučajeva, regulacija mRNA rezultira potiskivanjem translacije razgradnjom mRNA, mrtvenom depilacijom ili pohranom u tijelima za obradu citoplazmatske mRNA (P-tijela), ali translacija mRNA također može biti regulirana prema gore. Predloženo je nekoliko modela potiskivanja i razgradnje mRNA, ali još uvijek nije usvojen jedan prihvaćeni model. Istraživanje mikroRNA brzo se širi i istražuju se ključne interakcije protein -RNA kako bi se dodatno razumjela uloga miRNA u staničnom rastu, diferencijaciji i karcinogenezi.


Predviđanje interakcija proteina i bjelančevina iz aminokiselinskih sekvenci na temelju značajki kontinuirane i diskretne valovite transformacije

Interakcije protein-protein (PPI) imaju važnu ulogu u različitim aspektima strukturne i funkcionalne organizacije stanica pa je otkrivanje PPI-a jedno od najvažnijih pitanja u suvremenoj molekularnoj biologiji. Iako je veliki trud uložen u korištenje visokopropusnih tehnika za identifikaciju interakcija protein-protein, eksperimentalne metode dugotrajne su i skupe. Osim toga, daju visoku stopu lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata. Osim toga, većina predloženih računalnih metoda ograničena je informacijama o homologiji proteina ili oznakama interakcije proteinskih partnera. U ovom radu izvješćujemo o računalnoj metodi samo koristeći podatke iz proteinskih sekvenci. Glavna poboljšanja proizlaze iz novog predstavljanja proteinske sekvence češljanjem kontinuiranih i diskretnih valnih transformacija i usvajanjem ponderiranog klasifikatora koji se temelji na rijetkoj reprezentaciji (WSRC). Predložena metoda korištena je za predviđanje PPI iz tri različita skupa podataka: kvasca, čovjeka i H. pylori. Osim toga, upotrijebili smo model predviđanja obučen na skupu podataka o PPI -ju kvasca za predviđanje PPI -a za šest skupova podataka drugih vrsta. Kako bismo dodatno procijenili izvedbu modela predviđanja, usporedili smo WSRC s najsuvremenijim klasifikatorom vektorskih strojeva za podršku. Prilikom predviđanja PPI -ja kvasca, ljudi i H. pylori skup podataka, dobili smo visoku prosječnu točnost predviđanja od 97,38%, 98,92% i 93,93% respektivno. U eksperimentima s više vrsta većina je točnosti predviđanja preko 94%. Ovi obećavajući rezultati pokazuju da je predložena metoda doista sposobna postići bolje performanse u otkrivanju PPI.

Ključne riječi: proteinska sekvenca proteinsko-proteinska interakcija ponderirana rijetka zastupljenost.

Izjava o sukobu interesa

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Figure

ROC liječi peterostruko ...

ROC lijekovi postignuti peterostrukom unakrsnom validacijom: ( a ) ROC iz predloženog ...


In silico screening interakcija proteina i proteina sa sveobuhvatnim krutim spajanjem i grupiranjem: primjena za analizu puta

Predlažemo računalni sustav probira interakcija protein-protein pomoću podataka tercijarne strukture. Naš sustav kombinira sveukupno spajanje proteina i grupiranje kako bi pronašao međusobno povezane proteinske parove. Naš smo sustav predviđanja primijenili primjenom različitih parametara i algoritama grupiranja te smo uspjeli nadmašiti prethodne metode. Ova metoda je također primijenjena na problem procjene biološkog puta kako bi pokazala njezinu uporabu u analizi razine mreže. Strukturni podaci prikupljeni su iz Banke podataka o proteinima, PDB. Zatim je sveobuhvatno spajanje među ciljnim proteinskim strukturama provedeno pomoću konvencionalnog programskog paketa za spajanje proteina i proteina, ZDOCK. Najviše rangiranih 2000 mamaca grupirano je na temelju strukturne sličnosti među predviđenim oblicima pristajanja. Značajke generiranih klastera analizirane su kako bi se procijenila biološka važnost interakcija protein-protein. Naš sustav postiže najbolju vrijednost F-mjere od 0,43 kada se primijeni na podskup općih referentnih podataka za spajanje proteina i proteina. Isti sustav primijenjen je na podatke o proteinima na putu bakterijske kemotaksije, koristeći u osnovi isti skup parametara kao i referentni podaci. Dobili smo 0,45 za vrijednost F-mjere. Predloženi pristup računalnom otkrivanju PPI -a obećavajuća je metodologija za posredovanje između strukturnih studija i biologije sustava korištenjem kumulativnih podataka o strukturi proteina za analizu puta.


Fizička interakcija između morfogenetskih proteina omotača SpoVID i CotE neophodna je za zatvaranje spora u Bacillus subtilis

Nastanak endospore Bacillus subtilis složen je i dinamičan proces. Jedan od glavnih izazova sporulacije je sastavljanje zaštitne, višeslojne, bjelančevinske spore koja se sastoji od najmanje 70 različitih proteina. Formiranje spora može se podijeliti u dvije različite faze. Prvi je regrutiranje proteina na površinu spora, ovisno o morfogenetskom proteinu SpoIVA. Drugi korak, poznat kao zatvaranje, uključuje migraciju proteina omotača po obodu spore u uzastopnim valovima, proces koji ovisi o morfogenetskom proteinu SpoVID i transkripcijskoj regulaciji pojedinačnih gena omotača. Pružamo genetske i biokemijske dokaze koji podupiru hipotezu da SpoVID potiče zatvaranje spore uspostavljanjem izravnih interakcija protein-protein s drugim morfogenetskim proteinima omotača. Ranije je pokazano da SpoVID izravno stupa u interakciju sa SpoIVA -om i morfogenetskim proteinom unutarnje ovojnice, SafA. Ovdje smo pomoću dvo-hibridnih i pulldown testova kvasca pokazali da SpoVID također izravno stupa u interakciju s morfogenetskim proteinom vanjskog omotača, CotE. Nadalje, mutacijskom analizom identificirali smo specifičan ostatak u N-terminalnoj domeni SpoVID-a koji je bitan za interakciju s CotE, ali je neophodan za interakciju sa SafA. Predlažemo ažurirani model sastavljanja omotača i omotača spora koji uključuje nekoliko fizičkih interakcija između glavnih morfogenetskih proteina omotača.

Figure

Leucin 131 u N-terminalu ...

Leucin 131 u N-terminalnoj domeni SpoVID-a potreban je za zatvaranje. Stanice…

CotE interakcija s N-terminalom…

CotE interakcija s N-terminalnom domenom SpoVID-a u dvo-hibridnim testovima kvasca. Saccharomyces…

SpoVID fizički stupa u interakciju s CotE…

SpoVID fizički stupa u interakciju s CotE -om in vitro . Rezultati padajuće oznake…

Specifični ostaci u N-terminalu…

Specifični ostaci u N-terminalnoj domeni SpoVID-a bitni su za interakciju s ...

Ostatak L131 se ne može iskoristiti za ...

Ostatak L131 nije neophodan za izravnu interakciju sa SafA. Spoj…

Model za zatvaranje spora ...

Model za zatvaranje spora posredovao SpoVID. (A) Proteini u podrumu ...


Venkatesan, K. i sur. Empirijski okvir za binarno preslikavanje interaktoma. Nat. Metode 6, 83–90 (2009).

Berggård, T., Linse, S. i amp James, P. Metode za otkrivanje i analizu interakcija protein-protein. Proteomika 7, 2833–2842 (2007).

Rual, J. F. i sur. Prema karti proteomske razmjere mreže interakcija ljudski protein-protein. Priroda 437, 1173–1178 (2005).

Miller, K. E., Kim, Y., Huh, W. K. & amp Park, H. O. Analiza komplementacije bimolekularne fluorescencije (BiFC): napredak i najnovije aplikacije za studije interakcije na čitavom genomu. J. Mol. Biol. 427, 2039–2055 (2015).

Barrios-Rodiles, M. i sur. Kartiranje velike propusnosti dinamičke signalne mreže u stanicama sisavaca. Znanost 307, 1621–1625 (2005).

Trepte, P. i sur. DULIP: Dvojni ko-imunoprecipitacijski test zasnovan na dvostrukoj luminiscenciji za mapiranje interaktoma u stanicama sisavaca. J. Mol.Biol. 427, 3355–3388 (2015).

Buntru, A. i sur. Suvremeni pristupi kvantitativnom mapiranju interaktoma. Ispred. Genet. 7, 1–9 (2016).

Luo, S., Jiang, Y., Liang, Z. & amp Wu, J. Kvantitativno otkrivanje in vivo fizičke interakcije protein-protein temeljene na prepoznavanju DNK sekvence. J. Mol. Stanica. Bio. 7, 383–386 (2015).

Connolly, A. R. & amp Trau, M. Brza detekcija DNA pojačanjem detekcije uz pomoć beacon-a. Nat. Protoc. 6, 772–778 (2011).

Schymkowitz, J. i sur. FoldX web poslužitelj: mrežno polje sile. Nukleinske kiseline Res. 33, W382 – W388 (2005).

Zuker, M. Mfold web poslužitelj za nabiranje nukleinske kiseline i predviđanje hibridizacije. Nukleinske kiseline Res 31, 3406–3415 (2003).

Capra, E. J. & amp Laub, M. T. Evolucija dvokomponentnih sustava za prijenos signala. Annu. Rev. Microbiol. 66, 325–347 (2012).

Kentner, D. & amp Sourjik, V. Dinamička karta interakcija proteina na putu kemotaksije Escherichia coli. Mol. Syst. Biol. 5, 238–247 (2009).

Feng, X., Oropeza, R., Walthers, D. & amp Kenny, L. J. OmpR fosforilacija i njezina uloga u signalizaciji i patogenezi. ASM vijesti 69, 390–395 (2003).

Kholodenko, B. N. i sur. Rastavljanje žica: Strategija praćenja funkcionalnih interakcija u signalnoj i genskoj mreži. Proc. Natl. Akad. Sci. 99, 12841–12846 (2002).

Siversmith, R. E. Visoka pokretljivost karboksilnog područja bakterijske kemotaksis fosfataze CheZ smanjuje se vezanjem dvovalentnog kationa ili supstrata CheY-P. Biokemija 44, 7768–7776 (2005).

Sanna, M. G. & amp Simon, M. I. Izolacija i in vitro karakterizacija CheZ potiskivača za E coli mutant regulatora kemotaktičkog odgovora CheYN23D. J. Biol. Chem. 271, 7357–7361 (1996).

Luo, D. & amp Saltzman, W. M. Sustavi za isporuku sintetičke DNA. Nat. Biotehnol. 18, 33–37 (2000).

Cashin, P., Goldsack, L., Hall, D. & amp O’Toole, R. Kontrastni mehanizmi transdukcije signala u transkripciji gena bakterija i eukariota. FEMS. Mikrobiol. Lett. 261, 155–164 (2006).

Kott, L., Braswell, H. E., Shrout, L. A. & amp Weis, M. R. Interakcije podjedinica distribucije u CheA doprinose stabilnosti dimera: studija ravnoteže sedimentacije. Biochimica et Biophysica Acta 1696, 131–140 (2004).

O’Connor, C., Matsumura, P. & amp Campos, A. Vezivno sučelje CheZ-a za CheAS nalazi se u α-spirali E. J. Bacteriol. 191, 5845–5848 (2009).

Thakor, H. i sur. Identifikacija sidrenog ostatka za CheA-CheY interakcije u sustavu kemotaksije Escherichia coli . J. Bacteriol. 193, 5845–5848 (2009).

Li, J., Swanson, R. V., Simon, M. I. & amp Weis, R. M. Regulatori odziva CheB i CheY pokazuju kompetitivno vezivanje za kinazu CheA. Biokemija 34, 14626–14636 (1995).

Boesch, K. C., Siversmith, R. E. & amp Bourret, R. B. Izolacija i karakterizacija nehemotaktičnih CheZ mutanata Escherichia coli . J. Bacteriol. 182, 3544–3552 (2000).

Bourret, R. B., Hess, J. F. & amp Simon, I. M. Konzervirani aspartatni ostaci i fosforilacija u transdukciji signala proteinom kemotaksije CheY. Proc. Natl. Akad. Sci. 87, 41–45 (1990).

Li, M. & amp Hazelbauer, G. L. Stanična stehiometrija komponenti signalnog kompleksa kemotaksije. J. Bacteriol. 186, 3687–3694 (2004).


Rasprava

Naša struktura pokazuje da domene koje vežu E2F i DP DNA imaju isti ukupni nabor, uključujući područja u kojima nemaju značajnu homologiju. Ovaj nabor povezan je s motivom vezanja DNK s krilatom spiralom, osim što E2F4 i DP2 nemaju karboksi terminalnu regiju krila prisutnu u drugim proteinima krilate spirale poput HNF-3γ (Clark i sur. 1993.). Postoji nekoliko strukturnih razlika između E2F4 i DP2. E2F4 sadrži amino-terminalni spiralni nastavak motiva krilate spirale koji nedostaje u DP2 i HNF-3γ, a također ima i malo drugačiji raspored svojih heliksa u usporedbi s DP2 i HNF-3γ. U tom pogledu, domena krilate spirale E2F4 divergentnija je od domene DP2. S druge strane, DP2 sadrži umetak između svojih spirala α2 i α3 što rezultira produženjem ove dvije spirale za otprilike dva zavoja u usporedbi s onima E2F4 i HNF-3γ.

Unatoč tim razlikama, E2F4 i DP2 ostvaruju vrlo slične kontakte s bazama u glavnom utoru DNA, prepoznajući središnji CGCGCG slijed na bitno simetričan način. Asimetrija na proširenom mjestu vezanja TTTCGCGCG povezana je s amino-terminalnim proširenjem vezanja E2F4 u blizini sekvence TTT. Ova asimetrija u kontaktima mogla bi pomoći u orijentaciji E2F -DP heterodimera na promotoru. Svi ostaci E2F4 i DP2 koji dodiruju baze i većina ostataka koji dodiruju fosfodiestersku okosnicu DNK su invarijantni u svojim obiteljima. To sugerira da bi druge kombinacije E2F i DP krilatnih spirala domena imale vrlo slične kontakte s veznim mjestom od 9 bp. Moguće je, međutim, zamisliti da se specifičnost sekvence netaknutih E2F-DP heterodimera može modulirati ostacima izvan domena krilate spirale ili drugim proteinima vezanim za kompleks E2F-DP koji ostvaruju kontakte s bazama periferno od mjesta vezanja jezgre .

Domene krilate spirale E2F4 i DP2 ne uključuju ponavljanje hidrofobne heptade, što je neophodno za homo i heterodimerizaciju u odsutnosti DNA (Helin et al. 1993b). Ipak, oni pokazuju sklonost koja se vidi kod intaktnih proteina za vezanje DNA kao heterodimera umjesto homodimera (Bandara i sur. 1993 Helin i sur. 1993b). Struktura pokazuje da domene krilate spirale E2F4 i DP2 tvore opsežno sučelje protein-protein. Raspored strukturnih elemenata E2F4 i DP2 i njihove interakcije na ovom sučelju imaju značajnu asimetriju, što bi pridonijelo sklonosti vezivanju DNA kao heterodimera.


Formati za otkrivanje proteina za Duolink ® PLA proizvode

Duolink ® PLA proizvodi dostupni su za fluorescenciju i svijetlo polje. Fluorescentni Duolink ® PLA reagensi trenutno se mogu koristiti i u aplikacijama za mikroskopiranje i protočnu citometriju.

Fluorescentna mikroskopija je najčešće korišteni format aplikacije za Duolink ® PLA eksperimente. Većina protokola je ista kada se koriste fluorescentni Duolink ® PLA reagensi kao tradicionalna imunofluorescentna (IF), međutim, Duolink ® PLA tehnologija pokazuje veću specifičnost i svestranost od IF. Dodatni korak pojačanja uključen u postupak Duolink ® PLA pruža veću osjetljivost.

Kao i kod tradicionalne imunohistokemije (IHC), Brightfield Duolink ® PLA se pretežno koristi na presjecima tkiva fiksiranim formalinom, parafinom, ali je kompatibilan s drugim vrstama uzoraka. Brightfield Duolink ® reagensi za otkrivanje PLA sadrže oligonukleotide označene peroksidazom hrena (HRP) koji u prisutnosti HRP supstrata tvore enzim: talog supstrata vidljiv svjetlosnim mikroskopom.

Duolink ® Flow PLA Kit je brz, moćan alat za statističku analizu. Ovaj komplet identificira interakcije protein-protein ili subcelularnu lokalizaciju. Kombinacija Duolink ® PLA s protočnom citometrijom omogućuje prikupljanje kvantitativnih podataka na način velike propusnosti.


Dodatne datoteke

Dopunska datoteka 1

(A) bZIP sekvence. (B) DNK biblioteka i početnici. (C) DNK stabilizirani bZIP dimeri. (D) Oligonukleotidne sekvence za EMSA. (E) ROC-AUC. (Ž) Ekspresija bZIP gena. (G) ATF3 dimeri u vrhovima ChIP-seq. (H) GREAT GO bilješke. (Ja) Predviđanja promjene nabora SNP-a.

Dopunska datoteka 2

MEME motivi i pejzaži specifičnosti slijeda i energije (SEL) za humane bZIP homodimere i heterodimere.


Gledaj video: Tema ishrane 1 - Proteini (Svibanj 2022).