Informacija

Restrikcijski enzimi, kako se određuju sekvence prepoznavanja?

Restrikcijski enzimi, kako se određuju sekvence prepoznavanja?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kakvi su bili nizovi prepoznavanja (npr.GAATTCod EcoRI,GGATCCod BamHI) karakteriziran? U udžbenicima su navedena samo mjesta prepoznavanja, ali nikada metodologije korištene za određivanje sekvenci.


Ovaj rad opisuje jednostavnu metodu određivanja restrikcijskih mjesta, koja je korištena za određivanje restrikcijskog slijeda prethodno nekarakteriziranog enzima iz Haemophilus gallinarum.

Ukratko, poznata sekvenca DNA (iz faga $ phi text {X174} $) djelomično se probavlja restrikcijskim enzimom, a različiti digestirani fragmenti mogu se koristiti za određivanje relativnih udaljenosti između svakog od restrikcijskih mjesta.

Zatim se restrikcijski fragmenti proširuju pomoću T4 polimeraze i sekvenciraju pomoću Sanger sekvenciranja označenog s $^{32} text {P} $.

Nakon što je dovršena restrikcijska karta enzima na poznatom slijedu DNA, pojedinačni fragmenti se tada mogu provjeriti na sličnosti. Na primjer, HgaImam mjesto za prepoznavanje izvan mjesta ograničenja. Stoga, kada se usporede pojedinačna ograničenja, može se vidjeti da sva ona imaju mjesto prepoznavanjaGACGC.


Osnove restrikcijskog enzima

Gdje bi bila moderna istraživanja molekularne biologije bez enzima restrikcije? Ovi laboratorijski radnici stoje iza mnogih napretka u temeljnim biološkim istraživanjima i komercijalnim primjenama više od 40 godina. Restrikcijski enzimi (ili restrikcijske endonukleaze) prvi su put identificirani u bakterijama, ali su kasnije pronađeni u nekim arhejama. Općenito, restrikcijski enzimi cijepaju dvolančanu DNA. Svaki restrikcijski enzim prepoznaje specifične sekvence DNA, a cijepanje se može dogoditi unutar sekvence prepoznavanja ili na određenoj udaljenosti, ovisno o enzimu. Sljedovi prepoznavanja općenito su dugački od 4 do 8 parova baza (bp), a cijepanjem mogu nastati ljepljivi krajevi (5 ′ ili 3 ′ stršeći krajevi) ili tupi krajevi (Slika 1).

Slika 1. Ljepljivi ili izbočeni krajevi (5 ′ ili 3 ′) ili tupi krajevi proizvedeni specifičnim restrikcijskim enzimima.

Danas je okarakterizirano oko 4.000 restrikcijskih enzima, a preko 600 je komercijalno dostupno. REBASE je koristan resurs za pretraživanje za opsežne i ažurirane informacije o restrikcijskim enzimima, uključujući specifičnost, osjetljivost i komercijalne izvore [1].

Na ovoj stranici:


Restrikcijski enzimi tipa I i njihovi srodnici

Restrikcijski enzimi tipa I (REases) su veliki pentamerni proteini s zasebnim podjedinicama restrikcije (R), metilacije (M) i prepoznavanja DNK sekvence (S). Oni su bili prvi REAS -ovi koji su otkriveni i pročišćeni, ali za razliku od iznimno korisnih REAS -a tipa II, oni tek trebaju pronaći mjesto u enzimskoj kutiji alata molekularnih biologa. Enzime tipa I bilo je teško karakterizirati, ali to se mijenja jer analiza genoma otkriva njihove gene, a analiza metiloma otkriva njihove sekvence prepoznavanja. Pojedino je izdanje tipa I detaljno proučeno, a ono što je naučeno o njima privlači veću pozornost. U ovom članku raspravljamo o aspektima biokemije, biologije i regulacije oboljenja tipa I te o mehanizmima koje su bakteriofagi i plazmidi razvili kako bi ih izbjegli. Izdanja tipa I imaju izuzetnu sposobnost promjene specifičnosti sekvenci miješanjem i preuređivanjem domena. Sažimamo klasične pokuse i zapažanja koja su dovela do ovog otkrića te raspravljamo o tome kako ta sposobnost ovisi o modularnoj organizaciji enzima i njihovih S podjedinica. Na kraju, opisujemo primjere sustava restrikcije-modifikacije tipa II koji imaju zajedničke značajke s enzimima tipa I, s naglaskom na različite enzime tipa IIG.

Figure

Model M.EcoKI MTase…

Model M.EcoKI MTase (pdb datoteka 2Y7H). S podjedinica je sastavljena ...

Katalitičke komponente tipa I…

Katalitičke komponente enzima tipa I R – M. Gornja slika, lijevo: R/T podjedinica ...

Inhibitori proteina tipa I ...

Inhibitori proteina enzima tipa I R -M. Gornja ploča: DNK model (atomi vodika ...

Struktura podjedinice tipa I (pdb: 1YF2). Slijed prepoznavanja ovog…

Spirale dimerizacije tipa I…

Spirale dimerizacije podjedinica tipa I S. Gornji dijagram: poravnavanje slijeda…

Organizacije modificiranih MTaza gama klase.…

Organizacije modificiranih MT-aza klase gama. γ-MTaze kataliziraju prijenos metilne skupine iz…


Rad s restrikcijskim enzimima

Paket restrikcijskih enzima nalazi se u Bio.Restriction. Ovaj će vam paket omogućiti rad s restrikcijskim enzimima i realizaciju restrikcijske analize na vašem slijedu. Ograničenja koriste sadržaje koje nudi PONOVNO BAZA i sadrži klase za više od 800 restrikcijskih enzima. Ovo poglavlje će vas provesti kroz brzi pregled sadržaja koje nudi paket ograničenja Biopythona. Poglavlje je izgrađeno kao interaktivna Python sesija, a najbolji način za čitanje je s Python ljuskom otvorenom pored vas.

1.1 Uvoz enzima

Za uvoz enzima otvorite Python ljusku i upišite:

Sigurno ćete primijetiti da se paket prilično sporo učitava. To je normalno jer svaki enzim ima svoju klasu i ima ih mnogo. To neće utjecati na brzinu Pythona nakon početnog uvoza.

Ne znam za vas, ali smatram da je prilično nezgodno svaku operaciju morati staviti ispred Ograničenja. , pa evo još jednog načina uvoza paketa.

Međutim, ova metoda ima jedan veliki nedostatak: gotovo je nemoguće više koristiti naredbu dir () jer ima toliko enzima pa su rezultati teško čitljivi. Zaobilazno rješenje nalazi se na kraju ovog vodiča. Dopuštam vam da odlučite koju metodu više volite. Ali u ovom ću vodiču koristiti drugi. Ako preferirate prvu metodu, morat ćete svaki poziv prefiksirati restrikcijskom enzimu s Ograničenje. u preostalom dijelu vodiča.

1.2 Konvencija o imenovanju

Za pristup enzimu jednostavno unesite njegovo ime. Morate poštivati ​​uobičajenu konvenciju imenovanja s velikim slovima i latiničnim brojevima (također velikim slovima):

ecori ili EcoR1 nisu enzimi, EcoRI i KpnI jesu.

1.3 Traženje stranica s ograničenjima

Što možemo učiniti s tim restrikcijskim enzimima? Da bismo vidjeli da će nam trebati DNK slijed. Restrikcijski enzimi podržavaju objekte Bio.Seq.MutableSeq i Bio.Seq.Seq. Možete koristiti bilo koju abecedu DNK koja je u skladu s abecedom IUPAC.

Pretraživanje niza za prisutnost restrikcijskog mjesta za vaš željeni enzim jednostavno je kao:

Rezultati su popis. Ovdje je popis prazan jer očito nema web stranice EcoRI my_seq. Pokušajmo dobiti niz s EcoRI web mjestom.

Stoga imamo mjesto na poziciji 16 niza ekoseq. Položaj koji je vraćen metodom pretraživanja prva je baza nizvodnog segmenta nastala restrikcijom (tj. Prva baza nakon pozicije na kojoj će enzim presjeći). Paket ograničenja slijedi biološku konvenciju (prva baza niza je baza 1). Nema potrebe za otežanom pretvorbom između vaših zabilježenih bioloških podataka i rezultata koje proizvode enzimi u ovom paketu.

1.4 Dohvaćanje sekvenci nastalih digestijom

Objekti Seq kao i sve Python sekvence, imaju različite konvencije, a prva baza niza je baza 0. Stoga da bismo dobili sekvence proizvedene EcoRI digestijom ekoseq, treba učiniti sljedeće:

Čujem da mislite "ovo je glomazna i sklona pogreškama metoda dobivanje ovih sekvenci". Kako bi vam pojednostavilo život, Ograničenje pruža još jednu metodu za postizanje ovih sekvenci bez problema: kataliziranje. Ova metoda će vratiti tuple koji sadrži sve fragmente nastale potpunom probavom sekvence. Korištenje je jednostavno kao i prije:

BTW, možete koristiti i spell it na američki način katalizatora:

1.5 Analiza kružnih nizova

Sada, ako ste u ljusku unijeli prethodnu naredbu, možda ste primijetili da i pretraživanje i kataliziranje mogu uzeti drugi linearni argument koji je prema zadanim postavkama True. Korištenjem ovoga moći ćete simulirati kružne sekvence poput plazmida. Postavljanje linearnog na Netačno informira enzim o pretraživanju kružnog niza i traženju potencijalnih mjesta koja se protežu preko granica slijeda.

U redu, ovo je velika razlika, dobivamo samo jedan fragment koji odgovara lineariziranom slijedu. Početni slijed pomaknut je kako bi se ta činjenica uzela u obzir. Štoviše, možemo vidjeti još jednu razliku:

Kao što možete vidjeti koristeći linear = False, učinite da se web mjesto prikazuje u slijedu new_seq. Ovo mjesto ne postoji u linearnom slijedu jer je mjesto EcoRI podijeljeno na dvije polovice na početku i na kraju niza. U kružnom slijedu, mjesto je učinkovito prisutno kada se spoje početak i kraj niza.

1.6 Usporedba enzima međusobno

Restrikcijski enzimi definiraju 4 usporedna operatora ==,! =, & Gt & gt i %. Svi ovi operatori uspoređuju dva enzima zajedno i vraćaju true ili false.

== (testni identitet) Vratit će True ako su dvije strane operatora iste. *Isto & quot je definirano kao: isto ime, isto mjesto, isti prevjes (tj. Jedino što je jednako EcoRI je EcoRI). ! = (test za drugo mjesto ili rezanje) Vratit će se True ako su dvije strane operatora različite. Dva enzima se ne razlikuju ako rezultat jednog enzima uvijek bude isti kao rezultat drugog (tj. Pravi izošizomeri neće biti isti enzimi, nisu različiti jer su međusobno zamjenjivi). & gt & gt (test na neošizomer) Istina ako enzimi prepoznaju isto mjesto, ali ga izrežu na drugačiji način (tj. enzimi su neošizomeri). % (testiraj kompatibilnost) Testiraj kompatibilnost završetka koje proizvode enzimi (bit će točno ako se fragmenti proizvedeni s jednim od enzima mogu izravno vezati na fragmente koje proizvodi drugi).

Upotrijebimo Acc65I i njegove izoizomere kao primjer:

1.7 Ostale mogućnosti koje pružaju klase enzima

Klasa ograničenja pruža niz drugih metoda. Nećemo prolaziti kroz sve njih, već ćemo samo nakratko pogledati najkorisnije.

Nemaju svi enzimi ista svojstva kada je u pitanju način probave DNK. Ako želite saznati više o načinu rezanja određenog enzima, možete upotrijebiti tri sljedeće metode. Prilično su jednostavni za razumijevanje i upućivanje na krajeve koje enzim proizvodi: tupi, 5 'nadvijeni (koji se nazivaju i 3' udubljeni) ljepljivi kraj i 3 'nadvijeni (ili 5' uvučeni) ljepljivi kraj.

Detaljniji prikaz mjesta ograničenja može se izraditi pomoću metode elucidate (). ^ Se odnosi na položaj reza u smislenom nizu niza, _ na rez na antisense ili komplementarnoj niti. ^_ znači tup.

Učestalost metode () dat će vam statističku učestalost mjesta enzima.

Da biste dobili duljinu sekvence prepoznavanja enzima, upotrijebite ugrađenu funkciju len ():

Zanimljive su i metode koje se bave izoshizomerima. Za pamćenje su dva enzima izošizomeri ako dijele isto mjesto za prepoznavanje. Daljnja podjela vrši se između izošizomera (istog naziva, prepoznaju isti slijed i izrezuju na isti način) i neoshizomeri koji režu na različitim položajima. Ekvizizomer je proizvoljan izbor za oblikovanje & quotisoschizomers_that_are_not_neoschizomers & quot jer je ovaj posljednji bio malo dugačak. Drugi skup metoda one_enzyme.is_*shizomeri (one_other_enzyme) omogućuju ispitivanje 2 enzima jedan protiv drugog.

dobavljači () dobit će popis svih dobavljača enzima. all_suppliers () će vam dati sve dobavljače u bazi podataka.

2. RestrictionBatch klasa: klasa koja se bavi s nekoliko enzima

Ako želite napraviti restrikcijsku kartu niza, korištenje pojedinih enzima može postati dosadno i izdržati će velike troškove zbog ponavljajuće pretvorbe sekvence u FormattedSeq (vidi Poglavlje 5). Ograničenje nudi klasu koja olakšava korištenje velikog broja enzima u jednom potezu: RestrictionBatch. RestrictionBatch će vam pomoći u manipulaciji s mnogo enzima jednom naredbom. Štoviše, svi enzimi u restrikcijskoj seriji dijelit će isti pretvoreni slijed, smanjujući troškove.

2.1 Stvaranje RestrictionBatch -a

Restrikcijsku skupinu možete pokrenuti tako da joj kao argument predate popis enzima ili imena enzima.

Dodavanje novog enzima u restrikcijsku seriju jednostavno je:

Drugi način stvaranja RestrictionBatch je jednostavnim dodavanjem restrikcijskih enzima, što je osobito korisno za male serije:

2.2 Ograničavanje RestrictionBatch na određenog dobavljača

Paket ograničenja temelji se na PONOVNO BAZA baza podataka. Ova baza podataka daje popis dobavljača za svaki enzim. Bilo bi šteta ne iskoristiti ovu mogućnost. Možete proizvesti RestrictionBatch koji sadrži samo enzime od jednog ili nekoliko dobavljača. Evo kako to učiniti:

Dobavljači argumenata uzimaju popis od jednog ili više oznaka s jednim slovom koji odgovaraju dobavljačima. Kodovi su isti kao što je definirano u REBASE. Budući da bi bilo bolno prisjetiti se svakog koda dobavljača, RestrictionBatch pruža metodu koja prikazuje kôd para & lt = & gt dobavljač:

Ovaj način proizvodnje RestrictionBatch -a može drastično smanjiti količinu beskorisnog izlaza iz analize ograničenja, ograničavajući pretraživanje na enzime kojih se možete domoći i ograničavajući rizik od živčanog sloma. Ništa nije frustrirajuće nego nabaviti savršeni enzim za sub-kloniranje samo da bi se ustanovilo da nije komercijalno dostupan.

2.3 Dodavanje enzima u RestrictionBatch

Dodavanje enzima u seriju ako je enzim već prisutan neće izazvati iznimku, ali neće imati učinka. Ponekad želite dobiti enzim iz RestrictionBatch -a ili ga dodati u seriju ako ga nema. Koristit ćete metodu get koja postavlja drugi argument add to True.

2.4 Uklanjanje enzima iz RestrictionBatch -a

Uklanjanje enzima iz serije vrši se metodom remove (). Ako enzim nije prisutan u seriji, to će izazvati KeyError. Ako vrijednost koju želite ukloniti nije enzim, to će izazvati ValueError.

2.5 Manipulacija RestrictionBatch -om

Ne možete, međutim, dodavati grupe jer su to skupovi Python. Morate koristiti operator cijevi | umjesto toga. Raskrižje između 2 paketa možete pronaći pomoću & amp (za više informacija pogledajte dokumentaciju Pythona o skupovima.

2.6 Analiza sekvenci pomoću RestrictionBatch -a

Za analizu slijeda za potencijalno mjesto možete upotrijebiti metodu pretraživanja serije, na isti način kao što ste to učinili za restrikcijske enzime. Međutim, rezultati više nisu popis, već rječnik. Ključevi rječnika su nazivi enzima i popis vrijednosti mjesta mjesta. RestrictionBatch ne primjenjuje metodu katalizatora, jer ne bi imao pravo značenje kada se koristi s velikom serijom.

2.7 Ostale metode RestrictionBatch

Među ostalim metodama koje pruža RestrictionBatch, svakako su najkorisniji elementi () koji vraćaju popis svih imena elemenata abecedno sortiranih.

Ako vas ne zanima abecedni redoslijed, upotrijebite metodu as_string () kako biste istu stvar dobili malo brže. Popis nije razvrstan. Redoslijed je slučajan jer su skupovi Pythona rječnik.

Ostale metode RestrictionBatch općenito se koriste u određene svrhe i neće se ovdje raspravljati. Ako ste zainteresirani, pogledajte izvor.

3. AllEnzymes and CommOnly: dvije unaprijed konfigurirane RestrictionBatches

Iako je ponekad praktično proizvesti vlastitu RestrictionBatch, sigurno ćete češće koristiti dvije serije isporučene s paketima ograničenja: AllEnzymes i CommOnly. Ove dvije serije sadrže sve enzime u bazi podataka i samo enzime koji imaju komercijalnog dobavljača. Prilično su veliki, ali ih zato čine korisnima. S ovim paketom možete stvoriti potpuni opis niza s jednom naredbom. Ove dvije serije možete koristiti kao bilo koju drugu skupinu.

O njima se nema puno toga reći osim činjenice da su prisutni. To su zaista normalne serije i možete ih koristiti kao bilo koju drugu seriju.

4. Klasa analize: još jednostavnija restrikcijska analiza

RestrictionBatch vam može dati rječnik sa stranicama za sve enzime u seriji. Međutim, ponekad je lijepo nabaviti nešto lakše za čitanje od Python rječnika. Složena analiza ograničenja nije jednostavna s RestrictionBatch -om. Neka poboljšanja u načinu pretraživanja niza stranica s ograničenjima pomoći će. Analiza pruža niz naredbi za prilagođavanje rezultata dobivenih serijom parova/nizom ograničenja parova i nekim mogućnostima kako bi izlaz bio čitljiviji za ljude.

4.1 Postavljanje analize

Za izradu analize ograničenja trebat će vam RestrictionBatch i slijed te mu reći da li je slijed linearan ili kružan. Prvi argument koji Analiza uzima je restrikcijska serija, drugi je niz. Ako treći argument nije naveden, Analiza će pretpostaviti da je slijed linearan.

4.2 Analiza potpunog ograničenja

Nakon što ste izradili novu analizu, možete je koristiti za dobivanje analize ograničenja vašeg niza. Način potpune analize ograničenja slijeda je:

To je gotovo isto kao i izlaz metode RestrictionBatch.search. Dobit ćete lakše čitljiv ispis s ispisom_koji se koristi bez argumenta:

Mnogo jasnije, zar ne? Izlaz je optimiziran za ljusku širine 80 stupaca. Ako se ispis čini čudnim, provjerite je li širina vaše ljuske najmanje 80 stupaca.

4.3 Promjena naslova

Analizi možete dati naslov i izmijeniti rečenicu 'Enzimi koji ne presijecaju slijed', postavljanjem dva izborna argumenta print_that, title i s1. Formatiranje se neće izvršiti na ovim nizovima pa ako morate uključiti novi redak ( n) kako smatrate prikladnim:

4.4 Prilagođavanje izlaza

Neke aspekte izlaza možete promijeniti interaktivno. Postoje tri glavne vrste ispisa, dvije vrste popisa (abecedno sortirane i razvrstane po broju web stranica) i vrsta slična karti. Da biste promijenili izlaz, upotrijebite metodu print_as () Analize. Promjena izlaza je trajna za instancu Analysis (to je do sljedećeg korištenja print_as ()). Argument print_as () su nizovi: 'map', 'number' ili 'alpha'. Kao što ste već vidjeli, zadano ponašanje je abecedni popis ('alfa').

Da biste se vratili na prethodno ponašanje:

4.5 Analiza ograničenja uzgoja

Neću ulaziti u detalje za svaku pojedinačnu metodu, ovdje su sve funkcije koje su dostupne. Većina je sama po sebi razumljiva, a ostale su prilično dobro dokumentirane (upotrijebite pomoć ('Analysis.command_name')). Metode su:

Korištenje ovih metoda je jednostavno:

Da biste dobili lijep izlaz, i dalje koristite print_that, ali ovaj put sa naredbom koju želite izvršiti kao argument.

4.6 Složenija analiza

Sve ove metode (osim full () koje dobro rade potpunu analizu ograničenja) mogu se isporučiti s dodatnim rječnikom. Ako rječnik nije dostavljen, kao početna točka koristi se potpuna analiza ograničenja. Inače se koristi rječnik koji daje argument dct. Rječnik mora biti formatiran kao rezultat RestrictionBatch.search. Stoga oblika <'ime_enzima': [položaj1, položaj2]. >, gdje pozicija1 i pozicija 2 su cijeli brojevi. Sve metode navode prethodno objavljene takve rječnike i mogu se koristiti kao polazište.

Koristeći ovu metodu možete izgraditi zaista složene upite ulančavanjem nekoliko metoda jednu za drugom. Na primjer, ako želite da svi enzimi koji su 5 'nadvijeni i prerežu niz samo jednom, imate dva načina:

Težak način sastoji se u izgradnji restrikcijske serije koja sadrži samo 5 'nadvisujućih enzima i upotrebi ove serije za stvaranje nove instance Analize, a zatim koristite metodu s_N_sites () kako slijedi:

Jednostavno rješenje je ulančati nekoliko metoda analize. To je moguće jer svaka metoda vraća rječnik kao rezultat i može uzeti rječnik kao ulaz:

Rječnik je uvijek zadnji argument bez obzira na naredbu koju koristite.

Način preferiranja zasigurno ovisi o uvjetima u kojima ćete koristiti svoju instancu Analysis. Ako ćete vjerojatno često koristiti istu skupinu s različitim nizovima, upotreba namjenske RestrictionBatch može biti brža jer će serija vjerojatno biti manja. Metode ulančavanja općenito su brže pri radu s interaktivnom ljuskom. U skripti proširenu sintaksu može biti lakše razumjeti za nekoliko mjeseci.

5. Napredne značajke: klasa FormattedSeq

Restrikcijski enzimi zahtijevaju mnogo strože oblikovanje DNK sekvenci nego što objekt Bio.Seq pruža. Na primjer, restrikcijski enzimi očekuju da će pronaći velika slova bez razmaka (bez razmaka), dok objekt Bio.Seq dopušta da se sekvence u malim slovima odvajaju razmacima. Stoga, kada restrikcijski enzim analizira objekt Bio.Seq (bio to Seq ili MutableSeq), objekt prolazi kroz pretvorbu. Klasa FormattedSeq osigurava glatku pretvorbu iz Bio.Seq objekta u nešto što enzim može sigurno koristiti.

Iako se ova konverzija vrši automatski od strane enzima, ako im date Seq ili MutableSeq, postoji vrijeme u kojem će biti učinkovitije prije nego što se konverzija ostvari. Svaki put kada se Seq objekt proslijedi enzimu na analizu plaćate režijske troškove zbog pretvorbe. Kad uvijek iznova analizirate isti slijed, bit će brže pretvoriti slijed, pohraniti pretvorbu, a zatim koristiti samo pretvoreni niz.

5.1 Stvaranje FormattedSeq

Stvaranje FormattedSeq iz Bio.Seq objekta je jednostavno. Prvi argument FormattedSeq je slijed koji želite pretvoriti. Možete navesti oblik s drugim argumentom linearnim, ako ne, FormattedSeq će biti linearan:

5.2 Za razliku od Bio.Seq -a, FormattedSeq zadržava podatke o njihovom obliku

FormattedSeq zadržava podatke o obliku niza. Stoga, za razliku od Seq -a i MutableSeq -a, ne morate navesti oblik niza pri korištenju search () ili catalyze ():

Zapravo, oblik FormattedSeq nije promijenjen drugim argumentom naredbi search () i catalyze ():

5.3 Promjena oblika FormattedSeq

Međutim, možete promijeniti oblik FormattedSeq. Naredbe za korištenje su:

5.4 Korištenje operatora / i // s FormattedSeq

Ne morate navesti oblik niza za analizu daje vam priliku da koristite stenografiju '/' i '//' s restrikcijskim enzimima:

Drugi način da se izbjegnu dodatni troškovi zbog ponavljajuće pretvorbe iz objekta Seq u FormattedSeq je korištenje RestrictionBatch.

Zaključno, povećanje performansi postignuto korištenjem FormattedSeq umjesto Seq nije veliko. Analiza sekvence od 10 kb po svim enzimima u AllEnzymes (za x u AllEnzymes: x.search (seq), 867 enzima) je 7 % brža kada se koristi FormattedSeq nego Seq. Korištenje RestrictionBatch -a (AllEnzymes.search (seq)) otprilike je jednako brzo kao i FormattedSeq pri prvom pokretanju pretraživanja. To se međutim dramatično smanjuje u sljedećim izvođenjima s istim redoslijedom (RestrictionBatch čuva u memoriji rezultat posljednjeg izvođenja dok se slijed ne mijenja).

6. Naprednije značajke

Ovo se poglavlje bavi nekim naprednijim značajkama paketa, većina korisnika može to sigurno zanemariti.

6.1 Ažuriranje enzima iz REBASE

Većina ljudi zasigurno neće morati ažurirati enzime. Paket restrikcijskih enzima ažurirat će se sa svakim novim izdanjem Biopythona. No, ako želite dobiti ažuriranje između izdanja Biopythona, evo kako to učiniti.

Najprije morate preuzeti dvije skripte rebase_update.py i ranacompile.py: Idite na https://github.com/biopython/biopython/tree/master/Scripts/Restriction, kliknite odgovarajuću datoteku i pritisnite tipku 'Sirovi'u gornjem desnom kutu prozora koda. Zatim desnom tipkom miša spremite datoteku. Obje skripte moraju biti u istom direktoriju.

6.1.1 Ručno dohvaćanje nedavnih enzimskih datoteka iz REBASE

Svaki mjesec REBASE objavljuje novu zbirku podataka o restrikcijskim enzimima. Iako se enzimi ne mijenjaju tako često, možda ćete htjeti ažurirati klase restrikcijskih enzima. Prvo što trebate učiniti je nabaviti posljednju datoteku za ponovnu izgradnju. Izdanje REBASE možete pronaći na http://rebase.neb.com/rebase/rebase.files.html. Datoteka koja vas zanima je u EMBOSS formatu. Datoteke možete preuzeti izravno s poslužitelja REBASE ftp pomoću preglednika. Datoteka se nalazi na adresi ftp://ftp.neb.com/pub/rebase. Morat ćete preuzeti 3 datoteke: emboss_e. ###, emboss_r. ### i emboss_s. ###. ### je troznamenkasti broj koji odgovara godini i mjesecu izdanja. Prva znamenka je godina, dvije posljednje su mjesec: dakle srpanj 2015. bit će: 507. listopada 2016 .: 610 itd. Preuzmite tri datoteke koje odgovaraju tekućem mjesecu i stavite ih u istu mapu kao i vaša rebase_update.py i ranacompiler.py skripte.

6.1.2 Dohvaćanje najnovijih enzimskih datoteka pomoću rebase_update.py

Drugi način da učinite istu stvar je korištenje skripte rebase_update.py. Spojit će se izravno na rebase ftp poslužitelj i preuzeti zadnju hrpu emboss datoteka. Iz DOS ili Unix ljuske učinite sljedeće:

Potrebno je neko objašnjenje: -p je prekidač za označavanje skripte da koristite proxy. Ako koristite ftp proxy, unesite njegovu adresu i priključak za vezu nakon ':'.

6.1.3 Sastavljanje novog rječnika s ranacompiler.py

Nakon što ste dobili nedavne emboss datoteke, možete sastaviti novi modul koji sadrži podatke potrebne za stvaranje restrikcijskog enzima.

Napomena: ako datoteke za utiskivanje nisu prisutne u trenutnom direktoriju ili ako nisu ažurirane, ranacompiler.py će pozvati skriptu rebase_update.py, koju je potrebno instalirati u istu mapu. Morat ćete koristiti iste opcije kao i prije (tj. -M i -p). Za više pojedinosti pogledajte prethodni odlomak na rebase_update.py.

Radi jednostavnosti pretpostavimo da smo datoteke za utiskivanje stavili u istu mapu kao i datoteke koje sadrže skriptu ranacompiler.py. Možda ćete morati promijeniti način datoteke kako bi bila izvršna:

Obično dobivate sljedeću poruku:

Prvi redak označava koje su datoteke reljefa korištene za ovu kompilaciju. Upozorenja možete zanemariti sve dok je sastavljanje novog rječnika: OK. je prisutan u posljednjem dijelu izlaza. Ovdje su radi otklanjanja pogrešaka. Naveden je broj enzima u novom modulu, kao i popis rječnika koji je sastavljen. Posljednji dio označava da je modul uspješno kreiran, ali nije instaliran. Da biste dovršili ažuriranje, morate kopirati datoteku Restriction_Dictionary.py u mapu/your_python_path/site-packages/Bio/Restriction/kako je navedeno u skripti. Ako pogledate sadašnju mapu, vidjet ćete nove datoteke: novostvoreni rječnik Restriction_Dictionary.py i Restriction_Dictionary.old. Ova zadnja datoteka koja sadrži stari rječnik na koju se možete vratiti u slučaju da je nova datoteka oštećena (to se ne bi trebalo dogoditi jer je skripta dovoljno sretna da je novi rječnik dobar, ali ako postoji problem, uvijek je lijepo znati vas može se vratiti na prethodnu postavku bez ponovne instalacije cijele stvari.

Ako želite, skripta može instalirati mapu i za vas, ali morat ćete je pokrenuti kao root ako vaš normalni korisnik nema pristup pisanju vašoj instalaciji Python (a ne bi trebao). Za to upotrijebite naredbu ranacompiler.py -i ili ranacompiler.py --install.

Ako bilo što pođe po zlu (na primjer, nemate pristup upisu u odredišnu mapu), skripta će vas obavijestiti da nije izvršila instalaciju. Ipak će novi modul spremiti u trenutni direktorij.

Kao što vidite, skripta nije jako svijetla i ponovit će kompilaciju svaki put kada se pozove, bez obzira na to je li prethodna verzija modula već prisutna.

6.2 Podrazred klase Analiza

Kao što je ranije vidljivo, neke aspekte izlaza analize možete mijenjati interaktivno. Međutim, ako želite napisati vlastitu klasu analize, možda ćete htjeti pružiti druge izlazne mogućnosti nego što je navedeno u ovom paketu. Ovisno o tome što želite učiniti, jednostavno ćete promijeniti metodu make_format izvedene klase ili ćete morati pružiti nove metode. Umjesto da ulazimo u dugo objašnjenje, evo implementacije prilično beskorisne klase Analysis:

Koristeći ovaj primjer, kao predložak sada biste mogli moći podrazrediti Analizu kako želite. Više detalja o implementaciji pronaći ćete u modulu Bio.Restriction.PrintFormat koji sadrži klasu koja nudi sve metode _make_*.

7. Ograničenja i upozorenja

Konkretno, klasa Analiza je brza i prljava implementacija koja se temelji na sadržajima koje paket sadrži. Provjerite rezultate i prijavite grešku.

Na općenitijoj osnovi, ograničenja imaju neka druga ograničenja:

7.1 Sva DNK nije metilirana

Još uvijek nije implementiran nijedan objekt za rad s metiliranom DNK. Što se tiče enzimskih klasa, sva DNA nije metilirana DNA. Provedba osjetljivosti metilacije vjerojatno će se dogoditi u budućnosti. No, za sada, ako je vaš slijed metiliran, morat ćete provjeriti je li mjesto metilirano na druge načine.

7.2 Nema podrške za aktivnosti zvijezda

Kao i dosad, još uvijek nije implementirana potpora za pronalaženje mjesta koje enzimi pogrešno prepoznaju u uvjetima visoke koncentracije soli, tzv. Zvjezdana aktivnost. To će se provesti čim za to dobijem dobar izvor informacija.

7.3 Sigurno za upotrebu s degeneriranom DNK

Sigurno je koristiti degeneriranu DNK kao ulaz za upit. Nećete biti preplavljeni besmislenim rezultatima. Ali ovo ima svoju cijenu: GAANTC neće biti prepoznat kao potencijalno EcoRI mjesto, na primjer, zapravo uopće neće biti prepoznat. Degenerirane sekvence neće se analizirati. Ako vaš slijed nije u potpunosti sekvenciran, zasigurno ćete propustiti ograničenja:

7.4 Nestandardne baze u DNK nisu dopuštene

Iako možete koristiti degeneriranu DNK, upotreba nestandardne bazne abecede uzrokovat će gušenje enzima, čak i ako ih Bio.Seq.Seq prihvati. Međutim, znakovi slični razmaku ('', '', '',.) I znamenka bit će uklonjeni, ali neće zaustaviti enzim koji analizira niz. Možete ih koristiti, ali će fragmenti nastali katalizacijom izgubiti bilo kakvo oblikovanje. catalyze pokušava zadržati izvorno slovo slijeda (tj. mala slova će generirati male fragmente, velika slova nizova velika slova), ali mješovita će slova vratiti velika fragmente:

Zabrana dopuštanja drugih slova osim IUPAC -a može se činiti drastičnom, ali ovo je ograničavanje grešaka. Nije potpuno budalasto, ali pomaže.

7.5 Mjesta pronađena na rubu linearne DNA možda neće biti dostupna u stvarnoj probavi

Iako se web stranice jasno nalaze izvan sekvence neće biti prijavljene, ništa nije učinjeno kako bi se pokušalo utvrditi je li mjesto ograničenja na kraju linearnog niza valjano:

EcoRI finds a site at position 2 even if it is highly unlikely that EcoRI accepts to cut this site in a tube. It is generally considered that at about 5 nucleotides must separate the site from the edge of the sequence to be reasonably sure the enzyme will work correctly. This "security margin" is variable from one enzyme to the other. In doubt consult the documentation for the enzyme.

7.6 Restriction reports cutting sites not enzyme recognition sites

Some enzymes will cut twice each time they encounter a restriction site. The enzymes in this package report both cut not the site. Other software may only reports restriction sites. Therefore the output given for some enzymes might seems to be the double when compared with the results of these software. It is not a bug.

8. Annex: modifying dir() to use with from Bio.Restriction import *

Having all the enzymes imported directly in the shell is useful when working in an interactive shell (even if it is not recommended by the purists). Here is a little hack to get some sanity back when using dir() in those conditions:


Restrikcijski enzimi

Procvat biotehnologije omogućen je otkrićem restrikcijskih enzima početkom 1950 -ih. Pomoću njih DNK se može rezati na točno određenim mjestima. Drugi enzim-DNA ligaza-tada se može upotrijebiti za ponovno sastavljanje komada bilo kojim željenim redoslijedom. Ova dva enzima zajedno omogućuju istraživačima sastavljanje prilagođenih genoma. Na primjer, istraživači mogu stvoriti dizajnerske bakterije koje proizvode inzulin ili hormon rasta ili dodati gene za otpornost na bolesti poljoprivrednim biljkama.

Zanimljivo svojstvo restrikcijskih enzima pojednostavljuje ovo molekularno rezanje i lijepljenje. Restrikcijski enzimi obično prepoznaju simetrični slijed DNA, kao što je mjesto EcoRI prikazano na slici. Primijetite da je gornji pramen isti kao i donji, čitati unatrag. Kad enzim presiječe lanac između G i A, ostavlja nadvisene lance. Oni se nazivaju "ljepljivi krajevi" jer će parovi baza nastali između dva previsoka dijela zalijepiti dva dijela zajedno, iako je kralježnica prerezana. Ljepljivi krajevi bitan su dio genetskog inženjeringa, dopuštajući istraživačima da izrežu male komadiće DNK i postave ih na određena mjesta, gdje se ljepljivi krajevi podudaraju.

Istražujući strukturu

PDB sadrži strukture za mnoge restrikcijske enzime. Ovdje je prikazan još jedan primjer iz Escherichia coli-EcoRV. Struktura na vrhu, uzeta iz PDB unosa 1rva, prikazuje enzim vezan za kratki dio DNA. Strelica prikazuje fosfatnu skupinu koja će se rezati. Donja ilustracija, preuzeta iz PDB unosa 1rvc, prikazuje strukturu nakon što je DNK izrezana. Umetnuta je molekula vode, pa sada postoje dva atoma kisika, jedan blizu drugog, ali nisu međusobno povezani, gdje je u netaknutoj DNA bio jedan vezani atom kisika.

Na obje ilustracije, protein je prikazan jednostavnim prikazom kralježnice, a jedan lanac DNA obojen je u zeleno. Ove ilustracije nastale su pomoću RasMola. Slične ilustracije možete stvoriti klikom na gornje pristupne kodove PDB -a i odabirom jedne od opcija za 3D gledanje.


Arber, W. & Linn, S. A. Rev. Biochem. 38, 467–500 (1969).

Bullas, L. R., Colson, C. & Van Pel, A. J. gen. Mikrobiol. 95, 166–172 (1976).

Fuller-Pace, F. V., Bullas, L. R., Delius, H. & Murray, N. E. Proc. natn. Akad. Sci. SAD. 81, 6095–6099 (1984).

Nagaraja, V., Shepherd, J. C. W., Pripfl, T. & Bickle, T. A. J. molec. Biol. 182, 579–587 (1985).

Sanger, F., Coulson, A. R., Hong, G. F., Hill, D. F. & Petersen, G. B. J. molec. Biol. 162, 729–773 (1982).

Bajwa, W., Meyhack, B., Rudolph, H., Schweingruber, A. M. & Hinnen, A. Nukleinske kiseline Res. 12, 7721–7739 (1984).

Sengstag, C. & Arber, W. EMBO J. 2, 67–71 (1983).

Chan, P. T., Ohmori, H., Tomizawa, J.-I. & Lebowitz, J. J. biol Chem. (u tisku).

Dunn, J. J. & Studier, F. W. J. molec. Biol. 166, 477–535 (1983).

Sadler, I., Suda, K., Schatz, G., Kaudewitz, F. & Haid, A. EMBO J. 3, 2137–2143 (1984).

Bickle, T. A. in The Nucleuses (eds Linn, S. & Roberts, R. J.) 85–108 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Cough, J. A. & Murray, N. E. J. molec. Biol. 166, 1–19 (1983).

Arber, W. & Kühnlein, U. Staza. Mikrobiol. 30, 946–952 (1967).

Krüger, D. H. & Bickle, T. A. Mikrobiol. Vlč. 47, 345–360 (1983).


BspT104I (AsuII, NspV) restriction enzyme

Molimo pogledajte Certifikat o analizi proizvoda za informacije o uvjetima skladištenja, komponentama proizvoda i tehničkim specifikacijama. Molimo pogledajte popis komponenti kompleta kako biste odredili komponente kompleta. Certifikati o analizi i Popis komponenti kompleta nalaze se na kartici Dokumenti.

Takara Bio USA, Inc.
Sjedinjene Američke Države/Kanada: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
SAMO ZA ISTRAŽIVANJE. NIJE ZA KORIŠTENJE U DIJAGNOSTIČKIM POSTUPKIMA. & kopiraj 2021 Takara Bio Inc. Sva prava pridržana. Svi zaštitni znakovi vlasništvo su Takara Bio Inc. ili njegovih povezanih podružnica u SAD -u i/ili drugim zemljama ili njihovih vlasnika. Određeni zaštitni znakovi možda nisu registrirani u svim jurisdikcijama. Dodatni podaci o proizvodu, intelektualnom vlasništvu i ograničenoj upotrebi dostupni su na takarabio.com.

Takara Bio Europe član je Takara Bio Group, vodeće tvrtke za znanosti o životu koja se zalaže za poboljšanje ljudskog stanja putem biotehnologije. Kroz naše robne marke Takara, Clontech i Cellartis, naša je misija razviti visokokvalitetne inovativne alate i usluge za ubrzanje otkrivanja.


Restriction enzymes, how are the recognition sequences determined? - Biologija

Restriction enzymes have obscure sounding names which are directly derived from the bacterial strains from which they were first isolated. Most of the restriction enzymes we purchase commercially have been cloned and are now isolated from engineered E. coli expressing them - they still bear their original names however. Several examples of how these enzymes are named are shown below.

Restriction enzymes are classified on the basis of two fundamental properties.
First, whether the enzyme cuts at its recognition site, and second whether the restriction and modification activities are associated with the same or different complexes.

Restriction endonucleases recognize specific sequences 4 to 8 base pairs long. These restriction sites are typically pallindromic - they read identically on both strands.

While each restriction enzyme recognizes and cleaves a specific sequence, a given recognition sequence may be recognized by multiple enzymes. Enyzmes which recognize the same sequence are called isoschizomers. Recently these have been further divided into two classes - isoschizomers and neoschizomers - which cleave the DNA at the same position or different positions respectively.

Frequency of Restriction Enzyme Sites

The frequency with which restriction sites occur in a random sequence can be simply calculated if the GC content of the random sequence is known. For each nucleotide position in the restriction site, determine the frequency with which that position is occupied by the appropriate base. Then multiply the frequencies together to obtain the frequency with which the complete site is observed.

4-mer sequence will occur
1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4
= 1/256 bp

6-mer sequence will occur
1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4
= 1/4096 bp

8-mer sequence will occur
1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4
= 1/65536 bp

2/10 x 3/10 x 3/10 x 2/10
= 1/278 bp

Similarly the 6-mer would cut

2/10 x 2/10 x 3/10 x 3/10 x 2/10 x 2/10
= 1/6944 bp

2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10 x 2/10
= 1/390625 bp

Average fragment size and average frequency of restriction enzyme cutting depends on both the length and the GC bias of the recognition site as well as the GC bias of the genome being cut.


Explain briefly (a) PCR (b) Restrikcijski enzimi i DNA (c) Chitinase

(a) PCR: - Polymerase chain reaction (PCR) is a technique in molecular biology to amplify a gene or a piece of DNA to obtain its several copies. It is extensively used in the process of gene manipulation. The process involves in vitro synthesis of sequences using a primer, a template strand, and a thermostable DNA polymerase enzyme obtained from a bacterium, called Thermus aquaticus. The enzyme utilizes building blocks dNTPs (deoxynucleotides) to extend the primer. In the first step, the double stranded DNA molecules are heated to a high temperature so that the two strands separate into a single stranded DNA molecule. This process is called denaturation. Then, this ssDNA molecule is used as a template strand for the synthesis of a new strand by the DNA polymerase enzyme and this process is called annealing, which results in the duplication of the original DNA molecule. This process is repeated over several cycles to obtain multiple copies of the rDNA fragment.

(b) Restriction enzymes are molecular scissors used in molecular biology for cutting DNA sequences from a specific site. It plays an important role in gene manipulation. The enzymes recognize a specific six-box pair sequence known as the recognition sequence and cut the sequence at a specific site. For example, the recognition site for enzyme ECORI is as follows:

Restriction enzyme are categorized into two types &minus

(i) Exonuclease &minus It is a type of restriction enzyme that removes the nucleotide from either 5 &rsquo or 3 &rsquo ends of the DNA molecule.

(ii) Endonuclease &minus It is a type of restriction enzyme that makes a cut within the DNA at a specific site. This enzyme acts as an important tool in genetic engineering. It is commonly used to make a cut in the sequence to obtain DNA fragments with sticky ends, which are later joined by enzyme DNA ligase.

(c) Chitinase &minus Chitinase is a class of enzymes used for the degradation of chitin, which forms a major component of the fungal cell wall. Therefore, to isolate the DNA enclosed within the cell membrane of the fungus, enzyme chitinase is used to break the cell for releasing its genetic material.


Gledaj video: What is a Type II Restriction Enzyme? (Kolovoz 2022).