Informacija

Kada trebam koristiti kriofiksaciju i kemijsku fiksaciju?

Kada trebam koristiti kriofiksaciju i kemijsku fiksaciju?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Znamo da tehnika koja se koristi u pripremi TEM uzorka uključuje više koraka, jedan od najvažnijih od njih je fiksacija.

Pričvršćivanje može biti dvije vrste:

  1. Kriofiksacija, koja sugerira da se uzorak podvrgne temperaturi smrzavanja kako bi se očuvao živi materijal stanice prije nego što ih promatramo.

  2. Kemijsko učvršćivanje uključuje upotrebu određenih kemikalija, poput formalina, glutaraldehida itd. U gotovo istu svrhu.

Postavlja se pitanje kada je obvezno koristiti samo jedan od njih? Kao što je kriofiksacija ili kemijska? U nekim slučajevima, jesu li istraživači ikada trebali koristiti obje tehnike istovremeno?


Kriofiksacija obično bolje čuva organele unutar stanica, ali je više posla i obično rezultira TEM slikama manjeg kontrasta. Kemijsko učvršćivanje lakše je i daje dobar kontrast, no veća je vjerojatnost da će uništiti detalje u osjetljivim uzorcima. Kemijsko učvršćivanje obično će se koristiti osim ako se utvrdi ili se očekuje da neće raditi dobro za određeni uzorak. Moguće je miješati metode, na primjer uključivanjem glutaraldehida u otopine za zamjenu smrzavanjem. Evo članka koji detaljnije opisuje sve što ste pitali, ako mu možete pristupiti: Usporedba krio-kemijske fiksacije u tlu zelene alge Jaagiella


Jedinstvena metoda za kriofiksaciju i korelacijsko svjetlo, elektronsku mikroskopiju i tomografiju zametaka zebrice

Zebrica je moćan sustav kralježnjaka za proučavanje stanica i razvoj. U ovom smo istraživanju optimizirali metode za brzo zamrzavanje i obradu embrija zebrice za elektronsku mikroskopiju (EM). Pokazujemo da se u nedostatku primarne kemijske fiksacije može postići izvrsna ultrastruktura, očuvanje fluorescencije zelenog fluorescentnog proteina (GFP), označavanje imuno zlata i elektronska tomografija korištenjem jedne tehnike koja uključuje zamrzavanje pod visokim tlakom i ugradnju u Lowicryl smole na niskoj temperaturi. Osim što će biti važan novi alat za istraživanje zebrica, održavanje fluorescencije GFP -a nakon brzog smrzavanja, zamjene smrzavanjem i ugradnje smole bit će opće koristi za korelacijsko svjetlo i EM bioloških uzoraka.

Zebrice su izvrstan modelni sustav za staničnu i razvojnu biologiju. Osim moći ovog sustava kralježnjaka za genetski pregled 1, 2, transparentnost embrija zebrice učinila ga je idealnim sustavom za svjetlosnu mikroskopiju koji se s punom prednošću koristio za proučavanje morfogenetskih procesa tijekom razvoja. Genetski ekrani sada se sve više nadopunjuju obrnutim genetskim pristupima, osobito uključujući pristupe zasnovane na morfolinu 3, ali u novije vrijeme koristeći snažan pristup na bazi nukleaze cinkovih prstiju 4, 5. Zametci zebrica također su idealni za elektronsko -mikroskopska (EM) istraživanja. Jedan poprečni presjek embrija od 72 sata lako se nalazi u jednom odjeljku EM -a, ali može sadržavati brojne različite vrste stanica i tkiva. Međutim, konvencionalne metode EM ne osiguravaju optimalno očuvanje svih tkiva i obično su nekompatibilne s imuno obilježavanjem i vizualizacijom eksprimiranih fluorescentno označenih proteina. Izuzetak od toga je metoda smrznutog rezanja Tokuyasu, ali odsutnost smole 6, iako pruža izvrsnu detekciju antigena, manje je pogodna za očuvanje velikih struktura ispunjenih tekućinom, poput nokorda zametka zebrice, ključne strukturne i signalna struktura.

Do nedavno je većina EM analiza zebrice provedena standardnim tehnikama koje uključuju kemijsko fiksiranje. U ovom smo istraživanju nastojali razviti tehniku ​​koja izbjegava kemijsku fiksaciju, što nam je omogućilo da iskoristimo moć zelenog fluorescentnog proteina (GFP) kao fluorescentni marker za svjetlosnu mikroskopiju, a istovremeno nam omogućilo da povežemo svjetlosna mikroskopska opažanja s imunozlatnim EM na istim odjeljcima. Idealno, ova tehnika bi nam također omogućila izvođenje trodimenzionalne (3D) elektronske tomografije na istim presjecima. Sada opisujemo metodu zamrzavanja embrija zebrice pod visokim tlakom koja ispunjava ove kriterije. Opisana metoda pruža poboljšanu ultrastrukturu u odnosu na konvencionalne metode. Ono što je najvažnije, ovom metodom pokazujemo da se fluorescencija GFP-a i dalje zadržava nakon supstitucije smrzavanjem (FS) i umetanjem Lowicryl zamrznutih (HPF) embrija pod visokim tlakom. Osim otkrivanja proteina označenih GFP-om, endogeni antigeni mogu se označiti "na presjeku" za svjetlosnu mikroskopsku detekciju i imunozlato označeno za EM detekciju u istim odjeljcima. Osim toga, ti se odjeljci mogu koristiti za elektronsku tomografiju.


Priprema TEM uzorka

Za rutinsku transmisijsku elektronsku mikroskopiju (TEM) općenito je prihvaćeno da uzorci trebaju biti tanki, suhi i sadržavati molekule koje difraktiraju elektrone. Biološki uzorci, koji su veliki i sastoje se od velikih količina vode, također ne odbijaju elektrone pa ih je stoga teško vidjeti u TEM -u. Priprema bioloških uzoraka za TEM, uz zadržavanje strukturne morfologije materijala, izazov je. Međutim, istraživači se bave biološkim materijalom dugi niz godina, a postoje mnogi protokoli koji nam omogućuju da promatramo biološki materijal na mnogo različitih načina. U nastavku je kratki prikaz nekih od uobičajenih načina gledanja na biološke uzorke u TEM -u.

Cijeli nosači

Mali ili vrlo tanki predmeti mogu se izravno pregledati postavljanjem na noseću foliju i uvođenjem izravno u elektronski snop. Kontrast se postiže taloženjem teških metala na jedan od tri načina.

  1. Pozitivno bojenje: Objekt je kemijski obojen otopinom metalne soli i na svijetloj podlozi izgleda tamno.
  2. Negativno bojenje: Objekt ostaje neobojen, ali je ugrađen u osušeni film soli teških metala. Uzorak izgleda svijetlo na tamnoj podlozi. Ova metoda vizualizacije opsežno se koristi u proučavanju čestica virusa, ali je također korisna za stanične frakcije (npr. Obložene vezikule). Više detalja možete pronaći ovdje.
  3. Zasjenjivanje: Tanki sloj atoma teških metala taloži se na uzorku isparavanjem u vakuumskoj komori. Sjena iz jednog smjera proizvodi samo pseudo-trodimenzionalnu sliku. Rotacijsko zasjenjivanje, gdje je uzorak jednoliko obložen teškim metalom, koristi se za vizualizaciju nukleinskih kiselina i proteina.

Ultratanko rezanje

Najpopularnija tehnika za ispitivanje bioloških materijala je ugrađivanje materijala koji se proučava u plastiku i izrezivanje ultratankih presjeka koji se mogu ispitati TEM -om. Materijal se stabilizira kemijskom fiksacijom (obično s aldehidima poput formaldehida ili gluteraldehida), u kontrastu s otopinama soli teških metala (osmij tetroksid i uranil acetat), dehidrira u etanolu ili acetonu i ugrađen u plastiku (epoksidna smola). Ultratanki dijelovi (60 nm) izrezani staklenim ili dijamantnim noževima pomoću ultramikrotoma plutaju na vodi, prenose se na rešetke za podupiranje uzoraka i pregledavaju u TEM -u. Često se presjeci dodatno kontrastiraju s uranil acetatom i olovnim citratom prije ispitivanja u mikroskopu.

U nekim slučajevima, makromolekule se mogu posebno označiti prije ugradnje i rezanja. Na primjer, mjesto nekih enzima može se vizualizirati inkubacijom tkiva sa supstratom čija reakcija s enzimom dovodi do lokalnog taloženja elektronski neprozirnog materijala. Alternativno, antitijela se mogu povezati s takvim enzimima, a elektronski neprozirni reakcijski produkt koristi se za lokalizaciju antigena koje antitijela prepoznaju. Neke smole za ugradnju (npr. Lowicryl smole i LR bijela smola) osmišljene su tako da omogućuju nanošenje antitijela i elektronskih neprozirnih markera (poput koloidnih čestica zlata) na ultratanke dijelove. Na taj se način subcelularni antigeni koje prepoznaju antitijela mogu lokalizirati pomoću TEM -a.

Još jedna tehnika rezanja koja postaje sve popularnija je kriosekcioniranje (sekcija staklastog, smrznutog materijala). Nakon kemijske fiksacije, tkivo se uroni u krioprotektant (obično saharoza), a zatim brzo zamrzne u tekućem dušiku. Krio-zaštita omogućuje zamrzavanje biološkog materijala bez stvaranja kristala leda, što bi oštetilo ultrastrukturu. Ova vrsta smrzavanja ili vitrifikacije moguća je u odsutnosti krioprotektora, ali je tehnički zahtjevna. Odjeci izrezani iz vitrificiranog bloka mogu se odmrznuti i inkubirati s antitijelima specifičnim za podstanične antigene. Elektronski neprozirni markeri omogućuju da se protutijela vide u TEM -u.

Koloidno zlato povezano s proteinom A (protein iz staničnih stijenki bakterija koji se veže na dio Fc nekih imunoglobulina) posljednjih se godina opsežno koristi za lokalizaciju antitijela na smoli i smrznutim dijelovima bioloških materijala. Sposobnost stvaranja homogene populacije koloidnog zlata s različitim veličinama čestica omogućila je istraživačima da koriste ove sonde za kolokalizaciju različitih struktura na istom presjeku.

Kriofiksacija

Biološki materijal moguće je zamrznuti dovoljno brzo da vitrificira vodu prisutnu unutar stanica. Vitrifikacija vode nastaje kada se smrzavanje dogodilo toliko brzo da kristali leda nemaju vremena za stvaranje. Vitrificirani biološki materijal može se secirati na niskim temperaturama. Tanki filmovi vitrificirane vode i dijelovi vitrificiranog materijala mogu se ispitati u prijenosnim elektronskim mikroskopima koji su opremljeni stupnjevima uzoraka koji se mogu hladiti.

Metode brzog zamrzavanja

Trenutno postoji sedam glavnih metoda brzog zamrzavanja. Oni su:

  1. zamrzavanje potapanjem - uzorak se uranja u kriogen.
  2. smrzavanje (ili metalno zrcalo) smrzavanje - uzorak se udara na poliranu metalnu površinu ohlađenu tekućim dušikom ili helijem.
  3. zamrzavanje hladnog bloka - dva hladna, polirana metalna bloka pričvršćena na čeljusti par kliješta stisnuti i zamrznuti uzorak.
  4. zamrzavanje raspršivanjem - fini raspršeni uzorak u tekućoj suspenziji ubacuje se u kriogen (obično tekući propan).
  5. smrzavanje mlazom - mlaz tekućeg kriogena prska se na uzorak. - zamrzavanje uzorka pod visokim tlakom radi pothlađivanja vode.
  6. smrzavanje ekscizijom - hladna igla se ubacuje u uzorak, istovremeno zamrzavajući i secirajući uzorak.

Lomljenje smrzavanjem, nakon čega slijedi zamrzavanje graviranjem i replikacija

Ako se iz nekog razloga objekt koji se proučava ne može ispitati u TEM -u, tada se može napraviti tanka replika. To se obično postiže isparavanjem tankog sloja teškog metala (obično platine) na uzorak, a zatim se premaže tankim slojem ugljika. Objekt i replika odvajaju se ili plutanjem replike ili varenjem objekta. Četiri su osnovna koraka koja treba slijediti

  1. Uzorak je zamrznut (često bez obzira na vitrifikaciju).
  2. Uzorak je slomljen, dok je još zamrznut, pod vakuumom.
  3. Slomljeni uzorak tada se može nagrizati ostavljanjem smrznutog i pod vakuumom. Ovisno o vremenu izlaganja, više ili manje vode sublimira iz uzorka (sušenje smrzavanjem).
  4. Napravi se replika slomljene površine koja se zatim pregleda u elektronskom mikroskopu.

Nedavna modifikacija ove metode koristi brzo zamrzavanje postignuto udaranjem ćelija o bakreni blok ohlađen na -269 ° C s tekućim helijem. Ako su te smrznute stanice zatim izložene opsežnom sušenju smrzavanjem (duboko jetkanje), otkrivaju se vrlo impresivne slike unutarnjih struktura stanica.


Sredstva za učvršćivanje

Postoje brojni reagensi koji se mogu koristiti za fiksiranje tkiva. Ovdje su opisani formaldehid, daleko najpopularniji agens za histopatologiju i glutaraldehid, koji se naširoko koristi za ultrastrukturna istraživanja koja zahtijevaju elektronsku mikroskopiju. Ostali reagensi razmatraju se u 3. dijelu.

Formaldehid: Formaldehid (CH2O) je jedini plinoviti aldehid i otopljen je u vodi do zasićenja pri 37% - 40% w/v. Ova se otopina općenito naziva "formalin" ili "koncentrirana otopina formaldehida". Za fiksaciju, jedan dio formalina obično se razrijedi s devet dijelova vode ili pufera. Time se dobiva 10% otopina formalina koja sadrži oko 4% formaldehida w/v, optimalne koncentracije za fiksaciju. U koncentriranim otopinama formaldehid postoji kao njegov monohidrat metilen glikol i kao niskomolekularni polimerni hidrati. U razrijeđenom obliku prevladava monohidrat. Paraformaldehid, visoko polimerizirani oblik formaldehida, može se taložiti u obliku bijelog taloga u koncentriranim otopinama formaldehida. Kako bi se to spriječilo, male količine metanola (do 15%) obično se dodaju u vlasničke otopine. Paraformaldehid se može kupiti kao suhi prah i upotrijebiti za izradu vrlo čistih otopina formaldehida, poput onih potrebnih za elektronsku mikroskopiju. 2, 3

Nebuferirani formalin polako će oksidirati do mravlje kiseline što će rezultirati padom pH. U tim uvjetima mravlja kiselina će reagirati s hemoglobinom stvarajući kiseli formaldehidni hematin, smeđe-crni pigment zrnatog artefakta koji se taloži u tkivima bogatim krvlju. Ovaj pigment je smetnja jer se može zamijeniti s mikroorganizmima ili drugim patološkim pigmentima. 4 Iako se pigment može ukloniti s dijelova zasićenom vodenom pikricnom kiselinom prije bojenja, poželjno je izbjeći njegovo stvaranje. Iz tog razloga i zbog toga što formaldehid najučinkovitije reagira pri približno neutralnom pH, 10% otopine formalina obično se puferiraju na pH 6,8 - 7,2.

Slika 2: Formalno fiksirani parafinski dio bubrega prikazuje tipično taloženje kiselog formaldehidnog hematina (formalinskog pigmenta) povezanog s crvenim krvnim stanicama. Pigment je smeđe do crne boje i dvostruko lomi pod polariziranim svjetlom. U tom slučaju uzorak je ostao u učvršćivanju duže vrijeme prije obrade.

Formaldehid reagira s bočnim lancima bjelančevina stvarajući reaktivne hidroksi-metilne skupine. Može prodrijeti u nuklearne proteine ​​i nukleinske kiseline stabilizirajući ljusku proteina nukleinske kiseline i modificirajući nukleotide reagirajući sa slobodnim amino skupinama. Formaldehid može reagirati s nekim skupinama u nezasićenim lipidima, osobito ako su prisutni kalcijevi ioni, ali ima tendenciju da ne reagira s ugljikohidratima. 5 Formaldehid može reagirati s skupinama na lizinu, argininu, cisteinu, tirozinu, treoninu, serinu i glutaminu tvoreći reaktivne komplekse koji se mogu međusobno kombinirati tvoreći metilenske mostove (poprečne veze) ili s vodikovim skupinama. 5 Opće je prihvaćeno da ispiranje tkiva nakon fiksacije formalinom može poništiti neke od ovih reakcija, ali važne umrežene veze ostaju. 6 Sposobnost je formaldehida očuvati peptide staničnih bjelančevina što ga je učinilo tako korisnim kao fiksator opće namjene.

Postoje poznate opasnosti povezane s upotrebom formaldehida kao učvršćivača kroz kontakt s kožom ili očima ili putem dišnog trakta. Iritira, nagriza i može izazvati alergijsku osjetljivost. Od 1981. formaldehid je naveden kao "razumno očekivano da će biti karcinogen za ljude", a 2011. je popis nadograđen na "poznato da je ljudski kancerogen". 7, 8 Studije su pokazale da formaldehid izaziva rak nazofarangea, sinonazalni karcinom i mijeloičnu leukemiju. Iz tih razloga u većini zemalja postoje stroge smjernice za ograničavanje izloženosti radnika formaldehidu na radnom mjestu. Na primjer, u SAD-u je dozvoljena granica izloženosti OSHA-i (PEL) 0,75 ppm (8 sati TWA) i granica kratkotrajne izloženosti (STEL) od 2 ppm (15 minuta izloženosti), a ove preporuke podržane su redovitim programom praćenja. U dobro opremljenom laboratoriju sa suvremenom opremom za ekstrakciju dima ove ciljne razine ne smiju se prekoračiti. 9, 10

Unatoč rizicima pri uporabi formaldehida, većina morfologa stekla je znanje o normalnim i oboljelim tkivima gledajući uzorke fiksirane formalinom. Kako smo sada svjesni toksičnih opasnosti ovog reagensa, mnogi su laboratoriji tražili i nastavljaju tražiti sigurniju alternativu. Međutim, alternative formalinu općenito se procjenjuju po njihovoj sposobnosti da proizvedu morfološku sliku sličnu, ako ne i bolju od one koju proizvodi formalin, te dopuštaju cijeli niz metoda bojenja, uključujući molekularne, i jednako su jeftine. Većina laboratorija i dalje koristi formalin jer ne mogu pronaći potpuno zadovoljavajuću zamjenu, pa je važno da osoblje bude svjesno opasnosti. Neke alternative formaldehidu razmatrane su u 3. dijelu.

Glutaraldehid: Glutaraldehid ili glutarski dialdehid (CHO (CH2)3CHO) Smatra se bifunkcionalnim aldehidom koji ima aldehidne skupine na oba kraja molekule koje imaju potencijal reagirati s istim kemijskim skupinama kao i formaldehid. Oni će tvoriti adicijske spojeve i metilenske mostove, ali također i jedna molekula glutaraldehida može tvoriti izravne poprečne veze ako to dopušta sterički raspored susjednih peptida. U tom smislu posebno su važne amino skupine lizina. Tkivo fiksirano u glutaraldehidu bit će opsežnije umreženo od tkiva fiksiranog u formalinu, a također će posjedovati i neke nereagirane aldehidne skupine koje, osim ako nisu kemijski blokirane, mogu uzrokovati pozadinsko bojenje u metodama kao što je PAS. Opsežno umrežavanje negativno utječe na imunohistokemijsko bojenje, ali pruža izvrsnu ultrastrukturnu očuvanost što objašnjava njegovu opsežnu uporabu kao primarnog fiksatora za elektronsku mikroskopiju. Reakcije umrežavanja glutaraldehida uvelike su nepovratne. Glutaraldehid prodire vrlo sporo i preporučuje se debljina tkiva manje od 1 mm u barem jednoj dimenziji. 5, 11

Glutaraldehid će se polako raspadati i stvarati glutarinsku kiselinu, a također će se polimerizirati u ciklične i oligomerne spojeve. Glutaraldehid se stoga najbolje dobiva u zatvorenim ampulama u prikladnom obliku "stabiliziranom za elektronsku mikroskopiju" i može se dodati u odgovarajući pufer pri pH 7,2 - 7,4 (obično kakodilat, fosfat ili maleat) kako bi se dobila 3% koncentracija glutaraldehida za uporabu. Za elektronsku mikroskopiju glutaraldehid primarnu fiksaciju obično prati sekundarna fiksacija u osmij tetroksidu. Glutaraldehid se obično ne koristi za rutinsku histopatologiju. 11


Razmaz ili stanice: priprema i fiksacija

Prije bojenja, materijal koji ćete promatrati pričvrstite preko stakalca. Ako pripravak nije fiksiran ili zalijepljen na stakalce, stanice se ispiru tijekom postupka bojenja.

Priprema razmaza:

Stavite malu kap tekuće kulture s inokulacijskom petljom na čisto stakalce. Ako se kultura uzme iz čvrstog medija. Stavite malu kap vode na stakalce i temeljito pomiješajte s njom malo kulture. Ravnomjerno rasporedite kap na stakalcu kako biste formirali tanak sloj stanica. Taj tanki sloj stanica naziva se razmaz koji mora biti što ujednačeniji.

Fiksiranje stanica (razmaz) na dijapozitivima:

Nakon pripreme jednoličnog razmaza, mora se učvrstiti ili zalijepiti za stakalce. Fiksacija je proces kojim se unutarnje i vanjske strukture stanica i mikroorganizama čuvaju i učvršćuju na svom mjestu. Inaktivira enzime te noći remeti staničnu morfologiju i žilavost staničnih struktura tako da se ne mijenjaju tijekom bojenja i promatranja.

Stanica se obično ubija i dodaje joj da klizi tijekom mikroskopskog promatranja.

Fiksiranje mikrobne stanice vrši se na dva načina:

Toplinska fiksacija ili kemijska fiksacija. Toplinska fiksacija rutinski se koristi za promatranje prokariota. Ćelijski film lagano se zagrijava dok klizač prolazi kroz plamen. Toplinska fiksacija zadržava svu morfologiju, ali ne i strukture unutar stanice. Kemijska fiksacija koristi se za zaštitu fine stanične podstrukture i morfologije velikih i osjetljivih mikroorganizama.

Kemijski fiksatori prodiru u stanicu i reagiraju sa staničnim komponentama, obično proteinima i lipidima, što ih čini neaktivnim. Uobičajena mješavina za učvršćivanje sadrži etanol, octenu kiselinu, živin klorid, formaldehid i glutaraldehid.


Reference

  1. Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. Uvod u teoriju i praksu fiksacije tkiva. J Histotehnol 200124173 -190.
  2. Leong AS-Y. Fiksatori i fiksatori. U Woods AE i Ellis RC eds. Laboratorijska histopatologija. New York: Churchill Livingstone, 19944.1-1-4.1-26.
  3. Hopwood D. Fiksatori i fiksatori. U izdanju Bancroft J i Stevens A. Teorija i praksa histoloških tehnika. New York: Churchill Livingstone, 1996.
  4. Carson FL. Histotehnologija. 2. izd. Chicago: ASCP Press, 2007. (zbornik).
  5. Titford ME, Horenstein MG. Histomorfološka procjena fiksativa zamjenskih formalina za dijagnostičku kiruršku patologiju. Arch Pathol Lab Med 2005129502-506.
  6. Kothmaier H, Rohrer D, Stacher E, Quehenberger F, Becker K-F, Popper HH. Usporedba fiksatora tkiva bez formalina: proteomska studija koja testira njihovu primjenu za rutinsku patologiju i istraživanje. Arch Pathol Lab Med 2011135744-752.

Sadržaj Puta znanja Leica Biosystems podliježe uvjetima korištenja web stranice Leica Biosystems, dostupnim na: Pravna obavijest. Sadržaj, uključujući webinare, prezentacije obuke i srodne materijale, ima za cilj pružiti opće informacije o određenim temama od interesa za zdravstvene djelatnike i nije namjera, niti bi ih se trebalo tumačiti kao medicinski, regulatorni ili pravni savjet. Stavovi i mišljenja izraženi u bilo kojem sadržaju trećih strana odražavaju osobne stavove i mišljenja govornika/a/autora i ne predstavljaju nužno ili odražavaju stajališta ili mišljenja Leica Biosystemsa, njegovih zaposlenika ili agenata. Sve veze sadržane u sadržaju koje omogućuju pristup resursima ili sadržaju trećih strana pružaju se samo radi praktičnosti.

Za uporabu bilo kojeg proizvoda potrebno je konzultirati primjenjivu dokumentaciju o proizvodu, uključujući upute za uporabu, umetke i upute za uporabu. Leica Biosystems i urednici ovime se odriču svake odgovornosti koja izravno ili neizravno proizlazi iz uporabe sadržaja, uključujući bilo koje lijekove, uređaje, tehnike ili postupke opisane u sadržaju.

Autorska prava © 2021 Leica Biosystems odjel Leica Microsystems, Inc. i njegovih podružnica Leica Biosystems. Sva prava pridržana. LEICA i logotip Leica registrirani su zaštitni znaci Leica Microsystems IR GmbH.


Sažetak

Magnetska spektrometrija sekundarnih iona tijekom leta (TOF-SIMS) obećava alat je za podstaničnu kemijsku analizu bioloških stanica. Međutim, kako bi se dobile relevantne informacije, metoda koja se koristi za pripremu uzorka kritična je. U ovom smo radu koristili TOF-SIMS, skenirajuću elektronsku mikroskopiju (SEM) i interferencijsku refleksionu mikroskopiju (IRM) za proučavanje učinaka različitih metoda fiksacije i sušenja na morfologiju i kemijsku strukturu stanica ljudskih fibroblasta (hTERT) kojih se pridržavamo. silikonska površina. Konkretno, istraživane su dvije tehnike fiksacije (kemijska fiksacija glutaraldehidom i kriofiksacija potapanjem) i dvije tehnike sušenja (sušenje zamrzavanjem i sušenje supstitucijom alkohola). Utvrđeno je da se kriofiksacijom, nakon čega slijedi sušenje smrzavanjem, dobivaju osušene stanice sa očuvanom staničnom morfologijom, netaknute stanične membrane i zadržani gradijenti koncentracije natrijevih/kalijevih iona na plazma membrani. Ispiranjem uzoraka u vodenoj otopini amonijevog formata (AF) prije kriofiksacije moglo bi se spriječiti nakupljanje soli na površini uzorka tijekom sušenja. IRM mjerenja pokazala su da je morfologija stanica očuvana tijekom ispiranja amonijevim formatom, iako je došlo do oticanja. U usporedbi s kriofiksacijom, stanice fiksirane glutaraldehidom pokazale su fine strukture na staničnoj površini u SEM-u i sličnu raspodjelu lipida u TOF-SIMS-u, ali gradijenti iona natrija/kalija nisu zadržani. Utvrđeno je da se sušenjem alkohola značajno uklanjaju fosfolipidi stanične membrane, iako se pokazalo da upotreba osmijevog tetroksida kao postfiksatora smanjuje taj učinak.


Sažetak

Magnetska spektrometrija sekundarnih iona tijekom leta (TOF-SIMS) obećava alat je za podstaničnu kemijsku analizu bioloških stanica. Međutim, kako bi se dobile relevantne informacije, metoda koja se koristi za pripremu uzorka kritična je. U ovom smo radu koristili TOF-SIMS, skenirajuću elektronsku mikroskopiju (SEM) i interferencijsku refleksionu mikroskopiju (IRM) za proučavanje učinaka različitih metoda fiksacije i sušenja na morfologiju i kemijsku strukturu stanica ljudskih fibroblasta (hTERT) kojih se pridržavamo. silikonska površina. Konkretno, istraživane su dvije tehnike fiksacije (kemijska fiksacija glutaraldehidom i kriofiksacija potapanjem) i dvije tehnike sušenja (sušenje zamrzavanjem i sušenje supstitucijom alkohola). Utvrđeno je da se kriofiksacijom, nakon čega slijedi sušenje smrzavanjem, dobivaju osušene stanice sa očuvanom staničnom morfologijom, netaknute stanične membrane i zadržani gradijenti koncentracije natrijevih/kalijevih iona na plazma membrani. Ispiranjem uzoraka u vodenoj otopini amonijevog formata (AF) prije kriofiksacije moglo bi se spriječiti nakupljanje soli na površini uzorka tijekom sušenja. IRM mjerenja pokazala su da je morfologija stanica očuvana tijekom ispiranja amonijevim formatom, iako je došlo do oticanja. U usporedbi s kriofiksacijom, stanice fiksirane glutaraldehidom pokazale su fine strukture na staničnoj površini u SEM-u i sličnu raspodjelu lipida u TOF-SIMS-u, ali gradijenti iona natrija/kalija nisu zadržani. Utvrđeno je da se sušenjem alkohola značajno uklanjaju fosfolipidi stanične membrane, iako se pokazalo da upotreba osmijevog tetroksida kao postfiksatora smanjuje taj učinak.


Važnost fiksacije

Opći cilj fiksacije tkiva je očuvanje stanica i sastavnih dijelova tkiva u "životnom stanju", i to na način koji omogućuje pripremu tankih, obojenih dijelova. 1 Naravno, tijekom fiksacije i koraka koji slijede, dolazi do značajnih promjena u sastavu i izgledu staničnih i tkivnih komponenti, koje su prilično udaljene od idealnog „stanja nalik životu“. Međutim, oprezno možemo proizvesti dosljedne kemijske i fizičke karakteristike u presjecima tkiva koji omogućuju uočavanje uzoraka, bilježenje morfoloških i kemijskih promjena te usporedbe. Ova zapažanja omogućuju nam pogled na dinamično stalno mijenjajuće se okruženje "fiksirano" u određenom trenutku u vremenu 2 i mogu omogućiti histopatološku dijagnozu.

U praktične svrhe fiksacija ima za cilj spriječiti ili zaustaviti degenerativne procese koji počinju čim se tkivo liši opskrbe krvlju. Autoliza, koja rezultira probavom tkiva unutarstaničnim enzimima koji se oslobađaju pri pucanju membrana organela, te bakterijskim razgradnjom ili truljenjem uzrokovanim mikroorganizmima koji se već mogu naći u uzorku, postupci su koji se moraju spriječiti. Gubitak i difuzija topljivih tvari moraju se izbjegavati što je više moguće taloženjem ili koagulacijom ovih komponenti ili njihovim umrežavanjem s drugim netopljivim strukturnim komponentama. Tkiva moraju biti u velikoj mjeri zaštićena od štetnih učinaka obrade tkiva, uključujući infiltraciju vrućim voskom, ali, što je važno, tkiva moraju zadržati reaktivnost na mrlje i druge reagense, uključujući antitijela i sonde nukleinske kiseline. 1, 2

Važno je shvatiti da će fiksator u početku proizvesti brojne promjene u tkivima u uobičajenom vodenom okolišu. To će uključivati ​​skupljanje, oticanje i stvrdnjavanje različitih komponenti. Unatoč tim početnim učincima, tkiva će se tijekom obrade podvrgnuti daljnjim promjenama kada se stave u nevodenu sredinu. 2 Na primjer, fiksacija u 10% puferiranom formalinu u početku uzrokuje blago oticanje uzoraka tkiva. Međutim, tijekom obrade uzorak se može smanjiti 20% - 30% svog volumena. 3 Određeni fiksator također će utjecati na stupanj do kojeg će se pojedini elementi bojati različitim histokemijskim i imunohistokemijskim reagensima. 4 Prema tome, ukupni učinak određenog fiksatora na tkiva treba procijeniti nakon što je tkivo obrađeno, presječeno i obojeno kako bi se pokazali potrebni elementi.

Slika 1: Parafinski dio bubrega koji je fiksiran neutralnim puferiranim formalinom. Ovo je primjer dobro fiksiranog tkiva koje pokazuje dobru nuklearnu i citoplazmatsku morfologiju s minimalnim skupljanjem s jasno definiranim bazalnim membranama i rubovima stanica.
Slika 2: Parafinski dio bubrega koji je fiksiran neutralnim puferiranim formalinom. Ovo je primjer loše fiksiranog tkiva koje pokazuje inferiornu nuklearnu i citoplazmatsku morfologiju s prekomjernim skupljanjem i slabo definiranim rubovima stanica. Obratite pozornost na vakuolaciju i fragmentaciju jezgre i citoplazme stanica distalnog tubula i povlačenje glomerula uslijed skupljanja.

Reference

Acetarin JD, Carlemalm E, Villiger W (1986.) Razvoj novih Lowicryl smola za ugradnju bioloških uzoraka na još nižim temperaturama. J Microsc 143: 81–88

Adrian M, Dubochet J, Lepault J, McDowall AW (1984.) Krio-elektronska mikroskopija virusa. Priroda 308: 32–36

Al-Amoudi A, Chang JJ, Leforestier A, McDowall A, Salamin LM, Norlen LP, Richter K, Blanc NS, Studer D, Dubochet J (2004) Krio-elektronska mikroskopija presjeka staklastog tijela. Embo J 23: 3583–3588

Al-Amoudi A, Dubochet J, Norlen L (2005a) Nanostruktura epidermalnog izvanstaničnog prostora promatrana krio-elektronskom mikroskopijom staklastih dijelova ljudske kože. J Invest Dermatol 124: 764–777

Al-Amoudi A, Studer D, Dubochet J (2005b) Rezanje artefakata i postupak rezanja u presjecima od staklastog materijala za krio-elektronsku mikroskopiju. J Struct Biol 150: 109–121

Al-Amoudi A, Diez DC, Betts MJ, Frangakis AS (2007) Molekularna arhitektura kadherina u nativnim epidermalnim desmosomima. Nature 450: 832–837

Allison DP, Daw CS, Rorvik MC (1987.) Konstrukcija i rad jednostavnog, jeftinog uređaja za zamrzavanje za elektronsku mikroskopiju. J Microsc 147: 103–108

Batson PE, Dellby N, Krivanek OL (2002) Sub-angstrom rezolucija pomoću elektroničke optike korigirane aberacijom. Priroda 418: 617–620

Baumeister W (2002) Elektronska tomografija: prema vizualizaciji molekularne organizacije citoplazme. Curr Opin Struct Biol 12: 679-684

Baumeister W (2005) Od proteomskog inventara do arhitekture. Letter FEBS 579: 933–937

Behrman EJ (1984) Kemija fiksacije osmijevog tetroksida. U: Revel JP, Barnard T, Haggis GH (ur.) Znanost o biološkoj pripremi uzoraka. SEM Inc, AMF O’Hare, Illinois, str. 1–5

Boggon TJ, Murray J, Chappuis-Flament S, Wong E, Gumbiner BM, Shapiro L (2002) C-kadherin ektodomanska struktura i implikacije za mehanizme adhezije stanica. Znanost 296: 1308–1313

Böhm J, Frangakis AS, Hegerl R, Nickell S, Typke D, Baumeister W (2000) Prema otkrivanju i identifikaciji makromolekula u staničnom kontekstu: podudaranje predložaka primijenjeno na elektronskim tomogramima. Proc Natl Acad Sci USA 97: 14245–14250

Carlemalm E, Armbruster BL, Chiovetti R, Garavito RM, Hobot JA, Villiger W, Kellenberger E (1982) Perspectives for achieving improved information by the observation of thin sections in the electron microscope. Tokai J Exp Clin Med 7(Suppl):33–42

Causton BE (1986) Does the embedding chemistry interact with tissue? In: Müller M, Becker RP, Boyde A, Wolosewick JJ (eds) The science of biological specimen preparation. SEM Inc, AMF O’Hare, Illinois, pp 209–214

Claeys M, Vanhecke D, Couvreur M, Tytgat T, Coomans A, Borgonie G (2004) High-pressure freezing and freeze substitution of gravid Caenorhabditis elegans (Nematoda: Rhabditida) for transmission electron microscopy. Nematol 6:319–327

Cope GH, Williams MA (1968) Quantitative studies on neutral lipid preservation in electron microscopy. J R Microsc Soc 88:259–277

Cope GH, Williams MA (1969a) Quantitative studies on the preservation of choline and ethanolamine phosphatides during tissue preparation for electron microscopy. I. Glutaraldehyde, osmium tetroxide, Araldite methods. J Microsc 90:31–46

Cope GH, Williams MA (1969b) Quantitative studies on the preservation of choline and ethanolamine phosphatides during tissue preparation for electron microscopy. II. Other preparative methods. J Microsc 90:47–60

Craig S, Gilkey JC, Staehelin LA (1987) Improved specimen support cups and auxiliary devices for the Balzers high pressure freezing apparatus. J Microsc 148:103–106

Drochmans P, Freudenstein C, Wanson JC, Laurent L, Keenan TW, Stadler J, Leloup R, Franke WW (1978) Structure and biochemical composition of desmosomes and tonofilaments isolated from calf muzzle epidermis. J Cell Biol 79:427–443

Dubochet J (2007) The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol 79:7–21

Dubochet J, McDowall AW, Menge B, Schmid EN, Lickfeld KG (1983) Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. J Bacteriol 155:381–390

Dubochet J, Adrian M, Chang JJ, Homo JC, Lepault J, McDowall AW, Schultz P (1988) Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys 21:129–228

Ebersold HR, Luthy P, Cordier JL, Muller M (1981) A freeze-substitution and freeze-fracture study of bacterial spore structures. J Ultrastruct Res 76:71–81

Edelmann L (1978) A simple freeze-drying technique for preparing biological tissue without chemical fixation for electron microscopy. J Microsc 112:243–248

Edelmann L (1986) Freeze-dried embedded specimens for biological microanalysis. Scan Electron Microsc 1986(Pt4):1337–1356

Eppenberger-Eberhardt M, Riesinger I, Messerli M, Schwarb P, Muller M, Eppenberger HM, Wallimann T (1991) Adult rat cardiomyocytes cultured in creatine-deficient medium display large mitochondria with paracrystalline inclusions, enriched for creatine kinase. J Cell Biol 113:289–302

Epperlein HH, Radomski N, Wonka F, Walther P, Wilsch M, Muller M, Schwarz H (2000) Immunohistochemical demonstration of hyaluronan and its possible involvement in axolotl neural crest cell migration. J Struct Biol 132:19–32

Escaig J (1982) New instruments which facilitate rapid freezing at 83 K and 6 K. J Microsc 126:221–229

Frangakis AS, Bohm J, Forster F, Nickell S, Nicastro D, Typke D, Hegerl R, Baumeister W (2002) Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proc Natl Acad Sci USA 99:14153–14158

Frotscher M, Zhao S, Graber W, Drakew A, Studer D (2007) New ways of looking at synapses. Histochem Cell Biol 128:91–96

Galway ME, Heckman JW Jr, Hyde GJ, Fowke LC (1995) Advances in high-pressure and plunge-freeze fixation. Methods Cell Biol 49:3–19

Guerquin-Kern JL, Wu TD, Quintana C, Croisy A (2005) Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochim Biophys Acta 1724:228–238

Haussinger D, Ahrens T, Sass HJ, Pertz O, Engel J, Grzesiek S (2002) Calcium-dependent homoassociation of E-cadherin by NMR spectroscopy: changes in mobility, conformation and mapping of contact regions. J Mol Biol 324:823–839

Hayat MA (2000) Principles and techniques of electron microscopy: biological applications, 4th edn. Cambridge University Press, Cambridge

He W, Cowin P, Stokes DL (2003) Untangling desmosomal knots with electron tomography. Science 302:109–113

Hess MW (1993) Cell-wall development in freeze-fixed pollen: Intine formation of Ledebouria socialis (Hyacinthaceae). Planta 189:139–149

Hohenberg H, Mannweiler K, Muller M (1994) High-pressure freezing of cell suspensions in cellulose capillary tubes. J Microsc 175:34–43

Hohenberg H, Tobler M, Muller M (1996) High-pressure freezing of tissue obtained by fine-needle biopsy. J Microsc 183:133–139

Humbel BM, Schwarz H (1989) Freeze-substitution for immunochemistry. In: Verkleij AJ, Leunissen JLM (eds) Immuno-gold labeling in cell biology. CRC Press, Boca Raton, pp 115–134

Humbel BM, Marti T, Müller M (1983) Improved structural preservation by combining freeze substitutuion and low temperature embedding. Beitr Elektronenmikroskop Direktabb Oberfl 16:585–594

Kanno H, Speedy RJ, Angell CA (1975) Supercooling of water to −92°C under pressure. Science 189:880–881

Kellenberger E, Johansen R, Maeder M, Bohrmann B, Stauffer E, Villiger W (1992) Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc 168:181–201

Koch AW, Bozic D, Pertz O, Engel J (1999) Homophilic adhesion by cadherins. Curr Opin Struct Biol 9:275–281

Kopp F (1973) Morphology of the plasmalemma of baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae. In: Benedetti EL, Favard P (eds) Freeze-etching techniques and applications. Societé Française de Microscopie Electronique, Paris, pp 181–185

Leforestier A, Richter K, Livolant F, Dubochet J (1996) Comparison of slam-freezing and high-pressure freezing effects on the DNA cholesteric liquid crystalline structure. J Microsc 184:4–13

Linner JG, Livesey SA, Harrison DS, Steiner AL (1986) A new technique for removal of amorphous phase tissue water without ice crystal damage: a preparative method for ultrastructural analysis and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem 34:1123–1135

Lucic V, Forster F, Baumeister W (2005) Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem 74:833–865

Lucic V, Leis A, Baumeister W (2008) Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochem Cell Biol 130:185–196

Luft JH (1961) Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol 9:409–414

Matsko N, Müller M (2005) Epoxy resin as fixative during freeze-substitution. J Struct Biol 152:92–103

Maupin P, Pollard TD (1983) Improved preservation and staining of HeLa cell actin filaments, clathrin-coated membranes, and other cytoplasmic structures by tannic acid-glutaraldehyde-saponin fixation. J Cell Biol 96:51–62

McDonald KL, Morphew MK (1993) Improved preservation of ultrastructure in difficult-to-fix organisms by high pressure freezing and freeze substitution: I. Drosophila melanogaster i Strongylocentrotus purpuratus embryos. Microsc Res Tech 24:465–473

Medalia O, Weber I, Frangakis AS, Nicastro D, Gerisch G, Baumeister W (2002) Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science 298:1209–1213

Meryman HT (2007) Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion 47:935–945

Moor H (1987) Theory and practice of high pressure freezing. In: Steinbrecht RA, Zierold K (eds) Cryotechniques in biological electron microscopy. Springer, Berlin, pp 175–191

Moor H, Mühletaler K (1963) Fine structure in frozen-etched yeast cells. J Cell Biol 17:609–628

Moor H, Bellin G, Sandri C, Akert K (1980) The influence of high pressure freezing on mammalian nerve tissue. Cell Tissue Res 209:201–216

Murk JL, Posthuma G, Koster AJ, Geuze HJ, Verkleij AJ, Kleijmeer MJ, Humbel BM (2003) Influence of aldehyde fixation on the morphology of endosomes and lysosomes: quantitative analysis and electron tomography. J Microsc 212:81–90

Newman GR, Hobot JA (1987) Modern acrylics for post-embedding immunostaining techniques. J Histochem Cytochem 35:971–981

Newman GR, Jasani B, Williams ED (1983) A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. Histochem J 15:543–555

Nickell S, Kofler C, Leis AP, Baumeister W (2006) A visual approach to proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol 7:225–230

Nitta K, Kaneko Y (2004) Simple plunge freezing applied to plant tissues for capturing the ultrastructure close to the living state. J Electron Microsc (Tokyo) 53:677–680

North AJ, Bardsley WG, Hyam J, Bornslaeger EA, Cordingley HC, Trinnaman B, Hatzfeld M, Green KJ, Magee AI, Garrod DR (1999) Molecular map of the desmosomal plaque. J Cell Sci 112(Pt 23):4325–4336

Palade GE, Porter KR (1954) Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med 100:641–656

Pease DC, Porter KR (1981) Electron microscopy and ultramicrotomy. J Cell Biol 91:287s–292s

Pertz O, Bozic D, Koch AW, Fauser C, Brancaccio A, Engel J (1999) A new crystal structure, Ca 2+ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. Embo J 18:1738–1747

Pfeiffer S, Krupinska K (2005) Chloroplast ultrastructure in leaves of Urtica dioica L. analyzed after high-pressure freezing and freeze-substitution and compared with conventional fixation followed by room temperature dehydration. Microsc Res Tech 68:368–376

Ravazzola M, Perrelet A, Roth J, Orci L (1981) Insulin immunoreactive sites demonstrated in the Golgi apparatus of pancreatic B cells. Proc Natl Acad Sci USA 78:5661–5664

Richter T, Biel SS, Sattler M, Wenck H, Wittern KP, Wiesendanger R, Wepf R (2007) Pros and cons: cryo-electron microscopic evaluation of block faces versus cryo-sections from frozen-hydrated skin specimens prepared by different techniques. J Microsc 225:201–207

Riehle U, Hoechli M (1973) The theory and technique of high pressure freezing. In: Benedetti EL, Favard P (eds) Freeze etching techniques and applications. Société Française de Microscopie Electronique, Paris, pp 31–61

Ripper D, Schwarz H, Stierhof YD (2008) Cryo-section immunolabelling of difficult to preserve specimens: advantages of cryofixation, freeze-substitution and rehydration. Biol Cell 100:109–123

Romano EL, Romano M (1977) Staphylococcal protein A bound to colloidal gold: a useful reagent to label antigen-antibody sites in electron miroscopy. Immunochemistry 14:711–715

Romano EL, Stolinski C, Hughes-Jones NC (1974) An antiglobulin reagent labelled with colloidal gold for use in electron microscopy. Immunochemistry 11:521–522

Roth J (1983) The colloidal gold marker system for light and electron microscopy. Theory and application. In: Bullock GR, Petrusz P (eds) “Techniques in immunocytochemistry”. Academic Press, New York II, pp 217–284

Roth J, Bendayan M, Orci L (1978) Ultrastructural localization of intracellular antigens by the use of protein A-gold complex. J Histochem Cytochem 26:1074–1081

Roth J, Bendayan M, Carlemalm E, Villiger W, Garavito M (1981a) Enhancement of structural preservation and immunocytochemical staining in low temperature embedded pancreatic tissue. J Histochem Cytochem 29:663–671

Roth J, Ravazzola M, Bendayan M, Orci L (1981b) Application of the protein A-gold technique for electron microscopic demonstration of polypeptide hormones. Endocrinology 108:247–253

Sartori N, Richter K, Dubochet J (1993) Vitrification depth can be increased more than 10-fold by high pressure freezing. J Microsc 172:55–61

Sawaguchi A, McDonald KL, Forte JG (2004) High-pressure freezing of isolated gastric glands provides new insight into the fine structure and subcellular localization of H+/K+-ATPase in gastric parietal cells. J Histochem Cytochem 52:77–86

Scala C, Cenacchi G, Ferrari C, Pasquinelli G, Preda P, Manara GC (1992) A new acrylic resin formulation: a useful tool for histological, ultrastructural, and immunocytochemical investigations. J Histochem Cytochem 40:1799–1804

Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW (2008) Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells. Nat Methods 5:539–544

Schwarz H, Humbel BM (1989) Influence of fixatives and embedding media on immunolabelling of freeze-substituted cells. Scanning Microsc Suppl 3:57–63 Discussion 63–54

Semmler K, Wunderlich J, Richter W, Meyer HW (1998) High-pressure freezing causes structural alterations in phospholipid model membranes. J Microsc 190:317–327

Shanbhag SR, Park SK, Pikielny CW, Steinbrecht RA (2001) Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res 304:423–437

Shapiro L, Fannon AM, Kwong PD, Thompson A, Lehmann MS, Grubel G, Legrand JF, Als-Nielsen J, Colman DR, Hendrickson WA (1995) Structural basis of cell–cell adhesion by cadherins. Nature 374:327–337

Sharp DJ, McDonald KL, Brown HM, Matthies HJ, Walczak C, Vale RD, Mitchison TJ, Scholey JM (1999) The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles. J Cell Biol 144:125–138

Shimoni E, Muller M (1998) On optimizing high-pressure freezing: from heat transfer theory to a new microbiopsy device. J Microsc 192:236–247

Shotton D, Thompson K, Wofsy L, Branton D (1978) Appearance and distribution of surface proteins of the human erythrocyte membrane. An electron microscope and immunochemical labeling study. J Cell Biol 76:512–531

Studer D, Michel M, Muller M (1989) High pressure freezing comes of age. Scanning Microsc Suppl 3:253–268 Discussion 268–259

Studer D, Hennecke H, Müller M (1992) High pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta 188:155–163

Studer D, Michel M, Wohlwend M, Hunziker EB, Buschmann MD (1995) Vitrification of articular cartilage by high-pressure freezing. J Microsc 179:321–332

Studer D, Chiquet M, Hunziker EB (1996) Evidence for a distinct water-rich layer surrounding collagen fibrils in articular cartilage extracellular matrix. J Struct Biol 117:81–85

Studer D, Graber W, Al-Amoudi A, Eggli P (2001) A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc 203:285–294

Sung HW, Hsu HL, Shih CC, Lin DS (1996) Cross-linking characteristics of biological tissues fixed with monofunctional or multifunctional epoxy compounds. Biomaterials 17:1405–1410

Szczesny PJ, Walther P, Muller M (1996) Light damage in rod outer segments: the effects of fixation on ultrastructural alterations. Curr Eye Res 15:807–814

Tokuyasu KT (1973) A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol 57:551–565

Tokuyasu KT (1980) Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J 12:381–403

Van Donselaar E, Posthuma G, Zeuschner D, Humbel BM, Slot JW (2007) Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic 8:471–485

Van Harreveld A, Crowell J (1964) Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. Anat Rec 149:381–385

Vanhecke D, Graber W, Herrmann G, Al-Amoudi A, Eggli P, Studer D (2003) A rapid microbiopsy system to improve the preservation of biological samples prior to high-pressure freezing. J Microsc 212:3–12

Vanhecke D, Graber W, Studer D (2008) Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol 88:151–164

Verkade P (2008) Moving EM: the rapid transfer system as a new tool for correlative light and electron microscopy and high throughput for high-pressure freezing. J Microsc 230:317–328

Walther P (2003) Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J Microsc 212:34–43

Walther P, Ziegler A (2002) Freeze substitution of high-pressure frozen samples: the visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. J Microsc 208:3–10

Wang L, Humbel BM, Roubos EW (2005) High-pressure freezing followed by cryosubstitution as a tool for preserving high-quality ultrastructure and immunoreactivity in the Xenopus laevis pituitary gland. Brain Res Brain Res Protoc 15:155–163

Waschke J (2008) The desmosome and pemphigus. Histochem Cell Biol 130:21–54

White DL, Andrews SB, Faller JW, Barrnett RJ (1976) The chemical nature of osmium tetroxide fixation and staining of membranes by X-ray photoelectron spectroscopy. Biochim Biophys Acta 436:577–592

Williams GJ, Hanssen E, Peele AG, Pfeifer MA, Clark J, Abbey B, Cadenazzi G, de Jonge MD, Vogt S, Tilley L, Nugent KA (2008) High-resolution X-ray imaging of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cytometry A

Zeuschner D, Geerts WJ, van Donselaar E, Humbel BM, Slot JW, Koster AJ, Klumperman J (2006) Immuno-electron tomography of ER exit sites reveals the existence of free COPII-coated transport carriers. Nat Cell Biol 8:377–383

Zuber B, Nikonenko I, Klauser P, Muller D, Dubochet J (2005) The mammalian central nervous synaptic cleft contains a high density of periodically organized complexes. Proc Natl Acad Sci USA 102:19192–19197