Informacija

Je li moguće sintetizirati kiralnu verziju organizma (nekompatibilnu s našim patogenima)?

Je li moguće sintetizirati kiralnu verziju organizma (nekompatibilnu s našim patogenima)?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

U teoriji bi trebalo biti moguće sintetizirati kiralnu (zrcalnu sliku) verziju nekog organizma: sa svim molekulama zamijenjenim svojim enantiomerima, na pr. L-šećeri umjesto naših D-šećera.

Izravna primjena takvog kiralnog života mogla bi biti proizvodnja enantiomera proteina u npr. kiralna E. Coli, što bi moglo biti korisno na primjer kao novi lijekovi.

Međutim, najzanimljivije je da bi takav kiralni život bio nespojiv s našim patogenima, na primjer dopuštajući projektiranje zaista sterilnih ekosustava za surova okruženja poput Marsa. Konačno, takvi kiralni ljudi bili bi imuni na većinu naših bolesti.

Lijep članak: http://wikibin.org/articles/chiral-life-concept.html

Pitanje je je li tehnološki moguće sintetizirati npr. kiralna verzija E. Coli?

Ažuriranje: Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Chiral_life_concept


Prvo, kratko pojašnjenje: "kiral" jednostavno znači različit od zrcalne slike. Sav trenutni život je kiralan, jer se sastoji od molekula koje imaju "ruku". Ono o čemu postavljate pitanje je život koji se sastoji od molekula suprotne ruke (koju ću nazvati "zrcalno kiralna").

Takav je oblik života teoretski moguć - kemijske i biološke reakcije i brzine reakcija potpuno su jednake između dviju ruku - pod pretpostavkom da svi sudionici (podloge, proizvodi, katalizatori itd.) okrenuti su do suprotne kiralnosti. Zrcalni kiral Jarek izgledao bi i funkcionirao potpuno isto kao i normalni kiralni Jarek, iako bi trebao jesti zrcalnu kiralnu hranu umjesto normalne kiralne hrane.

Dakle, kakve biste poteškoće imali pri sintezi zrcalnog kiralnog organizma? Najveći problem je problem podizanja sustava. U stanici postoji veliki broj molekula koje su sve potrebne za replikaciju stanice, pa čak i samo njezino održavanje. Sve to mora biti prisutno kako bi organizam funkcionirao. Organizam može izraditi sve te komponente ispočetka, ali da bi to učinio već mora imati te komponente.

Napravljeni su sintetički organizmi - to jest organizmi s genomom sastavljenim u računalu i abiološki sintetiziranim. Trik je, međutim, bio u tome što je sintetička DNA tada stavljena u već postojeće organizme kako bi se replicirala i kako bi joj se izrazili geni. Nema ograničenja (osim možda troškova) za sintezu zrcalne kiralnosti DNK - isti strojevi koji sintetiziraju normalnu kiralnost DNK to mogu učiniti ako zamijenite bočice s reagensom. Ali što učiniti s njim kad ga imate? Ne postoje zrcalno-kiralni organizmi u koje ga možete staviti radi replikacije i izražavanja gena.

Da bi se napravili zrcalno-kiralni organizmi, morali biste sintetizirati sve potrebne stanične komponente u njihovom zrcalnom obliku. Dakle, trebala bi vam zrcalna RNA polimeraza, zrcalni ribosomi, zrcalna t-RNA, zrcalo ... Ako sve radite kako treba, možete preskočiti većinu staničnih komponenti, ali još uvijek vam je potreban veliki broj njih.

Ovo nije nužno san. Zadnje što sam znao, Institut J. Craig Venter, ljudi koji su napravili prvi sintetički DNK organizam, aktivno istražuju to. Trik je u tome da sve smanjite na minimalni broj kiralnih komponenti potrebnih za podizanje sustava. Koliko ja razumijem, tu su (manje-više) usmjereni njihovi trenutni napori: koliki je minimalni broj gena potreban za održivu stanicu? Što je od navedenog potrebno za "bootstrap" stanice iz gole DNK?

Osobno sam prilično uvjeren da će jednog dana nastati zrcalno-kiralni organizam. Vremenski okvir za to je pomalo nejasan, ali ništa teoretski ne ograničava. Najveći problem su naša trenutna tehnička ograničenja u sintezi dovoljnih količina (ne-DNA) biomolekula na kemijski (abiološki) način. No, oni se stalno poboljšavaju, a dodatnim istraživanjem o tome što je potrebno za podizanje sustava sintetičke ćelije, zahtjeve ćemo još više sniziti.

Naravno, prvi zrcalno-kiralni organizam bit će prilično jednostavan. Bit će manje složeno nego čak E coli. Također će se morati hraniti (skupom) zrcalno-kiralnom hranom (aminokiseline, šećeri), pa će i njezina uporaba biti ograničena.


Čini se da se većinsko mišljenje pojavilo u znanstvenoj analizi asortimana tehnologija koje su dobile oznaku "sintetička biologija". Prema tom gledištu, društvo bi trebalo dozvoliti napredak tehnologije, pa čak i pružiti joj određenu financijsku potporu, a pritom pratiti njezin napredak i nastojati osigurati da razvoj vodi do dobrih rezultata. Gotovo konsenzus zabilježeno je u američkom Predsjedničkom povjerenstvu za proučavanje bioetičkih pitanja u svom izvješću Novi smjerovi: etika sintetičke biologije i novih tehnologija, koje je vjerojatno označilo kraj preliminarne runde analize o etičkim i političkim pitanjima sintetskom biologijom. Kao i brojni drugi, raniji dokumenti koje su izdale različite skupine diljem svijeta, izvješće je skrenulo pozornost na pitanja o tome kako će se tehnologija koristiti može li se zloupotrijebiti koje bi se vrste nesreća mogle dogoditi usput, gospodarske, ekološke i društvene utjecaje eventualnih primjena treba li sama ideja "sintetičke biologije" biti zabrinjavajuća i kako će se voditi rasprava o svim tim pitanjima. Međutim, kao i većina sličnih dokumenata, iako je zahtijevalo pažljivo praćenje i nadzor nad tehnologijom, nije preporučilo nikakva značajnija nova ograničenja u razvoju i uporabi. Stav komisije bio je da bi bilo "nepromišljeno ili proglasiti moratorij na sintetičku biologiju dok se svi rizici ne mogu utvrditi i umanjiti, ili jednostavno" pustiti znanost da razbije ", bez obzira na vjerojatne rizike.”

U ovom ćemo izvješću razmotriti trenutni konsenzus, komentirati neke od glavnih točaka neslaganja i identificirati sljedeće korake za raspravu. U prvom dijelu nudimo kratak pregled istraživanja i aplikacija koje su obično grupirane pod naslovom sintetička biologija, dijelom kako bi se pripremile teme za ostatak rasprave, a dijelom zato što želimo istaknuti neke konceptualne probleme koji nailaze na vrlo označena s obzirom na ovo polje. U dijelovima II, III i IV razmatramo tri široke klase zabrinutosti koje se javljaju u kontekstu sintetičke biologije: zabrinutost zbog unutarnje ili svojstvene vrijednosti rada sintetičke biologije, zabrinutost zbog konkretnih šteta i koristi sintetičku biologiju i zabrinutost za pravdu. Rješavanje ovih zabrinutosti zahtijeva metodu donošenja vrijednosti javnosti na donošenje politika koje se odnose na nove biotehnologije u dijelu V, raspravljamo o izazovima u razvoju takve metode.


Tlo, znanost i civilizacija

Sve znanosti su pod utjecajem vlastite povijesti. Utemeljitelji ekologije bili su ili botaničari kao što su Arthur Tansley, Frederick Clements i Henry Gleason, uglavnom zainteresirani za ekologiju zajednice i obrasce vegetacije, ili zoolozi poput Charlesa Eltona, čiji je fokus bio na ponašanju životinjskih populacija. Svi su oni radili na kopnenim ili slatkovodnim sustavima. Morska biologija već je razvila vlastiti koncept i praksu do trenutka kada je ekologija postala prepoznatljiva znanost pa je morska ekologija tipično pokrajina oceanografa, a ne ekologa. Slična se pripovijest odnosi i na znanost o tlu. Vasiliy Dokuchaev u Rusiji i Hans Jenny u Americi, dva osnivača discipline, ne bi sebe smatrali ekolozima, već geomorfolozima ili agronomima. Naknadni razvoj znanosti o tlu i ekologije kao zasebnih disciplina nije išao ni na ruku.

Gotovo svi kopneni ekosustavi temeljeni su na tlu. Biljke se oslanjaju na nju u pogledu vode i hranjivih tvari, kao i sve ostalo u ekosustavu, uključujući nas. Pa ipak, blaženo zanemarivanje naše vrste prema tlu dokaz je naše nespremnosti da shvatimo njezinu temeljnu ulogu u našoj dobrobiti. Edward Hyams bio je jedan od prvih koji je u svojoj klasičnoj knjizi istaknuo ovu slijepu pjegu Tlo i civilizacija (Hyams 1952), djelo koje bi trebalo pročitati za sve ekologe. Zacrtao je veze između dugovječnosti civilizacija i njihove sreće u tome što su utemeljene ili na tlima koja su se godišnje obnavljala zimskim poplavama i zamuljivanjem (Nil, Ganges, Žuta rijeka), ili na tlima koja su bila mlada (zbog nedavnog zaleđivanja) i u klimatskim zonama koje su im omogućile stvaranje novog tla brzinom koja odgovara našoj razornoj moći (veći dio zapadne Europe). Ta su tla otporna na oštećenja. Drugi su mnogo manje takvi. Mnoge velike ekološke katastrofe u povijesti dogodile su se kada su na krhka tla primijenjene neprikladne poljoprivredne tehnike, a poznati primjer je zdjela za prašinu američkog srednjeg zapada koja je inspirirala klasični roman Johna Steinbecka Plodovi gnjeva (Steinbeck 1939.).


UVOD

Metabolizam ugljikohidrata i šećera javlja se u gotovo svim živim organizmima. Objašnjeni su mnogi od ovih metaboličkih puteva i propisa. Fiziološke funkcije ovih metaboličkih puteva su opskrba stanica energijom, smanjenje snage i građevni blokovi za sintezu drugih biomolekula. U današnje doba postgenoma, međutim, još uvijek postoje enigme vezane uz poremećaje i bolesti metabolizma šećera, što se ne može objasniti našim trenutnim znanjem o metabolizmu šećera. Postojanje alternativnog puta katabolizma glikogena i škroba, koji bi mogao biti operativan u posebnim fiziološkim i okolišnim uvjetima, nekada je bilo otvoreno pitanje. Rad na hipotezi takvog puta počeo je s gljivama i algama, a sada je doveo do razjašnjenja alternativnog puta razgradnje glikogena, puta anhidrofruktoze (AF) (shema 1) i njegovog regulacijskog mehanizma (1-6). AF put koji smo otkrili i nazvali IUBMB je prihvatio 2006. (7). Pristupi koji su korišteni za njegovo razjašnjavanje uključivali su otkrivanje enzima, identifikaciju metabolita i naprednu analizu (8-12).

Anhidrofruktozni put katabolizma glikogena.

Sada je poznato da je ovaj put operativan u uvjetima biotičkog i abiotskog stresa u gljivama i crvenim algama, dok je u drugim mikroorganizmima taj put možda uključen u odgovor gladovanja i transdukciju signala (13). U sisavaca, uključujući i ljudska bića, ostaje da se riješe uloge metabolita ovog puta (shema 1). Recenzije o AF putu s različitim fokusima pojavile su se prije (10, 11). Ovdje predstavljamo ažurirani pregled onoga što je postignuto u razumijevanju AF puta katabolizma glikogena s obzirom na njegove biokatalizatore i metabolite u posljednjem desetljeću te kritički analiziramo objavljenu literaturu na tom području. Također se predlažu i raspravljaju akcijske točke za bitan daljnji rad. Nadalje, predstavljene su biokemijske reakcije i enzimi koji metaboliziraju AF, koji bi mogli biti dio AF puta u relevantnim organizmima kao spas AF za metabolizam energije.


Rezultati

Prošireni tlrs specifični za teleost u atlantskom bakalaru

Homologija traži tlr21, tlr22 i tlr23 paralozi u sklopu genoma bakalara identificirali su 15 otvorenih okvira za čitanje koji kodiraju proteine ​​homologno ovim teleost-specifičnim tlrs. In silico analiza predviđanja gena potvrdila je prisutnost jednog tlr21, 12 tlr22 paraloga i dva tlr23 paralozi, svi kodiraju tipičan Tlr protein (Tablica   1). Djelomično tlr21 cDNA od 3047 𠂛p je sekvencirana, uključujući 134 𠂛p 5 ′ -UTR i 2913 𠂛p kompletno kodirajuće područje koje odgovara proteinu od 970 aa. Bakalar Tlr21 dijeli više od 50% identiteta sa svojim ortolozima u ribama zebrici, tigrovoj ribi i medaki, kao i s Tlr21a i Tlr21b narančaste kirnje (Epinephelus coioides). Na temelju sastava genoma, tlr21 otkriveno je da je djelomični niz kodiran jednim egzonom (slika   1). CDNA sekvence pune duljine zajedno s 5 ′ - i 3 ′ -UTR regijama dobivene su za četiri tlr22 paralozi. Tlr22b, tlr22d, tlr22g i tlr22i bile su 3406, 3252, 3082 i 3219 𠂛p dugačke i kodirale 942, 959, 842 i 954 aa proteina. Sastojali su se od pet, tri, tri i tri egzona (slika   1). Na razini proteina, oni su 62 do 75% identični jedan s drugim i dijele do 73% sličnosti s drugim teleost Tlr22 proteinima. Djelomično kodiranje sekvenci za sedam tlr22 paralozi su dobiveni sa ili bez UTR regija od minimalne duljine od 1612 𠂛p do 2847 𠂛p, kodirajući parcijalne proteine ​​od 453 aa do 865 aa. U slučaju tlr22k, bilo je moguće dobiti samo kratki slijed od 384 𠂛p, uključujući 3 ′ -UTR i kodiranje za 96 aa parcijalni protein (Tablica   1). Za oba su određene kompletne sekvence cDNA tlr23 paralozi u bakalaru. Tlr23a iznosio je 3427 𠂛p dok je tlr23b iznosio je samo 2165 𠂛p. Tlr23a i tlr23b kodirani su s 5 odnosno 3 egzona (slika   1), što odgovara proteinima od 949 odnosno 578 aa. Na razini nukleotida, tlr23a i tlr23b bile su 45% međusobno identične i dijelile su 47% identiteta na razini proteina s tigrastom pahuljicom i zeleno pjegavom ribom Tlr23.

Genska struktura teleost-specifičnih tlrs u atlantskom bakalaru. Grafički prikaz atlantskog bakalara tlr21, tlr22 i tlr23 strukture gena. Egzoni i UTR prikazani su svijetloplavom i crvenom bojom. Introni su označeni kontinuiranim linijama. PCR amplikoni označeni su tamno plavom bojom. Traka ljestvice predstavlja 500 𠂛p.

Općenito, sve tlrs analizirani u ovoj studiji imali su N-terminalnu LRR domenu, transmembransku domenu i C-terminalnu TIR signalnu domenu (slika   2). Ponavljanja bogata leucinom (LRR) mapirana su ručno, a identificirana je i domena L-R-C-terminala (LRRCT). Tlr21 sadržavao je 27 LRR -a i tipičan CxCx24Cx15C motiv u svojoj LRRCT domeni. CDNA pune duljine iz tlr22b, tlr22d, tlr22g i tlr22i kodiran za 27 LRR -ova i imao je CxCx24Cx18C motiv na svojoj LRRCT domeni. Tlr23a i Tlr23b imali su CxCx24Cx18C na njihovoj LRRCT domeni s 27 odnosno 14 LRR -ova.

Struktura domene proteina Tlrs-a specifičnih za teleost u atlantskom bakalaru. Grafički prikaz strukture proteina atlantskog bakalara Tlr21, Tlr22 i Tlr23 predviđen od strane ScanProsite. LRR ektodomain, transmembranska domena i TIR domena predstavljene su plavom, sivom i zelenom bojom. Traka ljestvice označava 100 aa.

Sintenija i filogenetska analiza teleost-specifičnih tlrs-a u bakalaru

Većina bakalara tlrs su preslikane u pojedinačne kontigove (tablica   1). Tlr22a, tlr22b i tlr22e bili su prisutni u istoj kromosomskoj regiji (GeneScaffold_1177), koja je bila sintetička u palicama, tigrovima i zeleno pjegavim ribama tlr22 (Slika   3). Tlr22c i tlr22d pronađeni su u GeneScaffold_1176 i tlr22k i tlr22l oba su bila u GeneScaffold_351 zajedno s drugim genima, ali nije bilo prepoznatljive sintenije u tim regijama u drugim genomima teleosta (slika   3).

Djelomična karta sinteze genomske regije koja okružuje atlantski bakalar specifičan za teleost tlrgeni. A. Djelomična karta genomskih regija koje okružuju atlantski bakalar tlr21, tlr22 i tlr23 paralozi. Također je naznačeno njihovo genomsko mjesto na temelju trenutnog nacrta genomskog niza atlantskog bakalara (gadMor1 v67.1). B. Djelomična karta sinteze između bakalara tlr22a, tlr22b i tlr22e i tlr22 prljavština (G. aculeatus), zelena pjegava riba (T. nigroviridis) i tigraste ribe (T. rubripes). Tlr22 paralozi su povezani crnim linijama, dok su geni u njihovoj blizini povezani sivim linijama kako bi pokazali sintenziju među ova četiri teleosta. Geni nisu zastupljeni u razmjeru.

Bayesov zaključak iz 41 tlr21, tlr22 i tlr23 sekvence iz 15 teleost vrsta generirao je filogenetsko stablo konsenzusa koje je identično najvećoj vjerojatnosti (slika   4). svi tlr21 geni su grupirani u jednu kladu, dok tlr22 i tlr23 formirao zasebnu skupinu. Gregorac tlr21a skupljeni s drugim teleostom tlr21 gena, dok tlr21b činilo se da je proizašao iz nedavnog dupliciranja i bio je bliže povezan s teleostom tlr22. Značajno je da su svi tlr22 od bakalara skupljenog pod jednim kladom, dok su dva tlr23 paralozi grupisani zajedno sa njihovim homolozima iz Tetraodontidae. Očekivano, tlr22 paralozi kodirani salmonidima, poput atlantskog lososa i kalifornijske pastrve, bili su grupirani zajedno i odgovarali blisko povezanim paralozima, koji su vjerojatno nastali iz tetraploidizacije salmonida. Među bakalarom tlr22 samo paralozi koji su susjedni u genomu (slika   3) tlr22k i tlr22l grupirani zajedno, dok tlr22a, tlr22b i tlr22e ili tlr22c i tlr22d nije. Tlr22 kodirani bazalnim teleostojima koji pripadaju Nadriophysi nadredu grupirani kao zasebna klasa koju slijede Salmonidae i viši teleostovi iz nadreditelja Acanthopterygii. Neočekivano, bakalar tlr22 paralozi su bili udaljeniji od predaka tlr22 slijed nego njihovi Acanthopterygii ortolozi.

Filogenija specifična za teleost tlrs. Neukorijenjeno filogenetsko stablo specifično za teleost tlrs – tlr21, tlr22 i tlr23. Brojevi na čvorovima ukazuju na zadnje vrijednosti vjerojatnosti iz Bayesovog zaključivanja. Posteriorne vrijednosti vjerojatnosti izračunate su za svaki čvor Bayesovom analizom na temelju 250.000 generacija. Uzorci su se prikupljali svakih 100 generacija, a stablo konsenzusa izgrađeno je nakon spaljivanja početnih 1.250 stabala. Označene su samo vrijednosti vjerojatnosti iznad 0,8: 0,95 do 1 zasjenjene crvenom bojom, 0,9 do 0,94 plavom bojom i 0,8 do 0,89 zelenom bojom. Geni atlantskog bakalara istaknuti su unutar crvenih okvira.

Profili ekspresije tlr-a specifičnih za teleost u tkivima odraslih bakalara i tijekom rane ontogeneze

Tlr21, tlr22 i tlr23 paralozi su bili široko izraženi u mnogim tkivima, uključujući imunološki povezane organe (bubreg glave, bubrežna slezena i škrge), jetru i spolne žlijezde (slika   5A). Sva pregledana tkiva, osim jajnika, imala su mjerljive vrijednosti tlr21 transkripti s visokim razinama u bubrezima, jetri, škrgama, testisima i krvi. Uočen je različit obrazac ekspresije u tkivima odraslih riba tlr22 paralozi. Tlr22k transkripti su otkriveni u svim testiranim tkivima. Tlr22e imala najmanju ekspresiju u bubrezima, jetri i škrgama, dok nije otkrivena u drugim tkivima. svi tlr22 paraloge, osim tlr22e, otkriveni su u bubrezima glave, bubrezima, slezeni, jetri i škrgama na različitim razinama. Šest od 12 tlr22 paralozi, tlr22a, tlr22c, tlr22d, tlr22h, tlr22j i tlr22k, utvrđeno je da su izražene u želucu, dok su mišići i koža izraženi samo tlr22k. Testis je imao većinu transkripata tlr22 paralozi ali tlr22a, tlr22h i tlr22k bili jedini geni otkriveni u jajniku. Unutar tlr23 paralozi, izraz tlr23b bila niža od one tlr23a ali oboje su izraženi u bubrezima, bubrezima, slezeni, škrgama, krvi i testisima. Tlr23a transkripti su također pronađeni u jetri, srcu i mozgu.

Profil izraza specifičan za teleost bakalara tlrs u tkivima odraslih i tijekom ranog razvoja. A. Tkivni izraz atlantskog bakalara tlr21, tlr22 i tlr23 geni. Tlrs su uglavnom izražene u imunološki povezanim tkivima, poput bubrega glave, bubrega, slezene, jetre i škrga. Transkripti većine paraloga također su pronađeni u visokim razinama u krvi i testisima. Eef1a je korišten kao interna referenca za RT-PCR. Minus reverzna transkriptaza (−RT) i nijedna kontrola šablona (NTC) nisu uključene kako bi se utvrdila specifičnost PCR početnica. Veličine amplikona u bp označene su s desne strane slike. B. Analiza izraza tlrs tijekom embrionalnog razvoja. Niski izraz tlr21 je otkriven u kasnijim fazama od izlijeganja do prvog hranjenja, dok tlr23a i tlr23b nisu otkrivene ni u jednoj od ispitivanih razvojnih faza. Tlr22c, tlr22, tlr22j i tlr22k transkripti su pronađeni u neoplođenim jajima (UFE), dok tlr22k izražen je u većini ispitivanih razvojnih faza. Luciferaza upotrijebljen je kao vanjska referenca za RT-PCR.

Tlr22c, tlr22h, tlr22j i tlr22k transkripti su pronađeni u neoplođenim jajima (slika   5B). Tlr22k bio jedini tlr22 paralog koji će se izražavati tijekom ranog razvoja, a njegovi transkripti otkriveni su u fazama epibolije, somita, zlatnog oka, izlijeganja, mjehura i stražnjeg crijeva. Niski izraz tlr21 i tlr22a je otkriven u kasnijim fazama od izlijeganja do prvog hranjenja, dok tlr23a i tlr23b nisu bili prisutni ni u jednoj od ispitivanih razvojnih faza.

Diferencijalna ekspresija nakon izazivanja patogena

Specifično za Teleost tlrs kod bakalara različito su regulirani nakon izazova kupanja s V. anguillarum (Slika   6). Značajno smanjenje ekspresije tlr21 zabilježeno je nakon 48  h u škrgama (2,3 puta) i slezeni (2,2 puta) u usporedbi s početnom kontrolom. U bubrezima glave najveća promjena ekspresije primijećena je pri 4 hpc in tlr22c (Smanjenje od 3,3 puta) i tlr22l (4,2 puta povećanje), iako nije značajno, dok je većina ostalih paraloga ostala na bazalnoj razini. Nakon 2 puta značajnog smanjenja ekspresije tlr22a i tlr22b pri 4 hpc u bubregu glave, tlr22a transkripti su dosegli dvostruko veći izraz pri 48 KS, što je također značajno u usporedbi s početnim kontrolnim razinama. Nekoliko značajnih promjena u izrazu tlr22 paralozi su također primijećeni u škrgama i slezeni nakon izazivanja kupanja. U škrgama, tlr22d razine transkripta značajno su smanjene za 3,5 puta i ta se razina zadržala na 48 KS. U istom tkivu, smanjenje do 2 puta tlr22k ekspresija je primijećena pri 4 i 48 KS. Značajno smanjenje u tlr22f i tlr22i razine transkripta također su uočene na 48 KSc u škrgama. U slezeni, tlr22d (2,4 puta), tlr22h (2,4 puta) i tlr22k (1,2 puta) smanjene su regulacije na 4 KS i povećanje ekspresije tlr22f, tlr22h i tlr22k (2,1 puta) opaženo je pri 48 KS pri usporedbi s početnom kontrolom. Oba tlr23a i tlr23b slijedio je sličan obrazac sa značajnim smanjenjem izraza tlr23a u škrgama (2,8 puta) i slezeni (2,3 puta).

Kvantificiranje atlantskog bakalara specifičnog za teleost tlrs kao odgovor na izazov kupanja s V. anguillarum. Toplinska karta koja predstavlja izraz atlantskog bakalara tlrs u bubregu glave, škrgama i slezeni kao odgovor na izazivanje kupke s V. anguillarum. Nakon prikupljanja početnih kontrolnih uzoraka, ribe su podvrgnute kupki V. anguillarum soj H610 u koncentraciji 2,6·10 7 �u ·ml -1. Uzorci su prikupljeni na 4 (4 hpc) i 48 (48 hpc) h nakon izazivanja. Relativni izraz tlr21, tlr22 i tlr23 je određen qPCR -om i izražen kao omjeri između svakog uzorka i odgovarajuće početne kontrole. Razine značajnosti postavljene su na P < 0.05 i statistički različite vrijednosti izraza zatvorene su u crvene okvire. Eef1a i ubi korištene su kao interne kontrole.

Reakcija na temperaturni stres

Nakon toplinskog šoka dolazi do značajne regulacije tlr21 i tlr22 paralozi su uočeni i u bubrezima i u slezeni, a većina transkripata se vratila na početnu razinu ili je bila regulirana prema gore u 72 hps (slika   7). U oba organa do 3 puta značajno smanjenje tlr21, tlr22f, tlr22g, tlr22i i tlr22k razina mRNA opažena je pri 4 hps. Tlr22a razine transkripta nisu pokazale veliku promjenu stresa, ali su imale 3,1 puta povećanje pri 72 hps u bubregu glave. Tlr22l ekspresija u glavi-bubregu povećana je 3 puta nakon toplinskog stresa, a zatim do 4 puta pri 72 hps, iako nije značajna. Najveća promjena razine prijepisa zabilježena je za tlr22d, sa 5,5 puta smanjenom slezenom pri 4 hps. Nije primijećena značajna promjena u tlr23 izraz s temperaturnim naprezanjem.

Kvantificiranje atlantskog bakalara specifičnog za teleost tlrs kao odgovor na temperaturni stres. Toplinska karta koja predstavlja izraz atlantskog bakalara tlrs u bubrezima i slezeni glave kao odgovor na temperaturni stres. Odrasle ribe održavane su na 4 ଌ. Nakon prikupljanja početnih kontrolnih uzoraka, temperatura vode postupno je povećavana na 12 ଌ u 4  h (4 hps), a ribe su održavane na ovoj temperaturi 72  h (72 hps). Relativni izraz tlr21, tlr22 i tlr23 paraloge je kvantificiran qPCR -om kao omjeri između svakog uzorka i početne kontrole. Razine značajnosti postavljene su na P < 0.05 i statistički različite vrijednosti izraza zatvorene su u crvene okvire. Eef1a i ubi korištene su kao interne kontrole.

Molekularna evolucija obitelji bakalara tlr22

Testovi odabira i testovi relativne stope

Z-test na temelju kodona u parovima otkrio je da je bakalar tlr22 paralozi se razvijaju različitim tempom (Tablica   3). Najviše vrijednosti dN-dS opažene su između tlr22c i tlr22i (2.852, P = 0,003) ili tlr22l (2.787, P = 0,003). Čak tlr22c i tlr22d, koji su kodirani od susjednih gena u genomu bakalara, otkriveno je da se razvijaju različitom brzinom (dN-dS = 2.157, P = 0,016). Tajima test relativne brzine dodatno je potvrdio evoluciju paraloga Tlr22 bakalara usporedbom u paru ovih proteinskih sekvenci s Tlr22b kao izvangrupom. Test je otkrio da je Tlr22d prošao relativno veliku divergenciju u odnosu na sve ostale paraloge Tlr22 (dodatna datoteka 3).

Tablica 3

Z-test na bazi kodona pozitivne analize selekcije između atlantskog bakalara tlr22paralozi

Paralozi atlantskog bakalaratlr22btlr22ctlr22dtlr22ftlr22gtlr22htlr22itlr22jtlr22l
tlr22b  𢄠.436 𢄡.789 0.002 0.241 0.135 0.833 0.779 0.449
tlr22c1.000   2.157 1.554 1.186 2.072 2.852 2.656 2.787
tlr22d1.000 0.016  0.264 1.265 1.722 2.465 1.907 1.577
tlr22f0.499 0.061 0.396   1.817 1.968 2.345 2.020 2.389
tlr22g0.405 0.119 0.104 0.036   0.800 2.314 1.131 2.126
tlr22h0.446 0.0200.0440.0260.213   0.074 𢄠.427 0.306
tlr22i0.203 0.0030.0080.0100.0110.471   1.632 1.893
tlr22j0.219 0.0040.0290.0230.130 1.000 0.053   0.901
tlr22l0.3270.0030.0590.0090.0180.3800.0300.185 

Korištena je modificirana Nei-Gojobori metoda s Jukes-Cantor-ovom korekcijom. Testna statistika (dN-dS) prikazana je iznad dijagonale, a odgovarajuća P-vrijednost navedena je ispod dijagonale. P-vrijednosti manje od 0,05 označene su podebljanim slovima. Položaji koji sadrže praznine eliminirani su za ovu analizu i ukupno je 708 kodona uključeno u konačni skup podataka.

Pozitivna selekcija

Analiza kliznog prozora kompletnog kodiranja od devet tlr22 paralozi izvedeni sa SNAP-om otkrili su da pojava nesinonimnih mutacija nije jednolika u cijelom kodirajućem slijedu (slika   8A). Prosječni omjer dN/dS za potpuni kodirajući slijed bio je 0,748 (dS = 0,223, dN = 0,167), dok je omjer za LRR regiju bio znatno veći (dN/dS = 0,815) nego za područje TIR (dN/dS = 0,313). Ove razlike u stopama supstitucije potvrđuju da je TIR domena unutar teleost-specifičnih Tlrs u bakalaru očuvanija od regije LRR. Stoga se analiza pozitivnog odabira za određeno mjesto usredotočila na potonje. Testovi omjera vjerojatnosti (LRT) otkrili su da su PAML modeli koji su omogućili adaptivnu pozitivnu selekciju bolje odgovarali podacima od onih koji nisu (M3 u odnosu na M0, p = 0 M2 u odnosu na M1, p = 0 M8 u odnosu na M7, p = 0) (Tablica & #x02009 4). Ukupno, sa sva tri modela, M2, M3 i M8, identificirana su 24 pozitivno odabrana kodona (PSC), s vrijednostima ω od 4,08, 4,36 i 4,06, respektivno. SLAC i FEL analize otkrile su da se 2 i 28 kodona razvijaju pod pozitivnom selekcijom s p-vrijednošću manjom od 0,1 (podaci nisu prikazani), a REL je identificirao 19 PSC-a mjesta s Bayesovim faktorom većim od 50 (Tablica   4). Analiza poslužitelja Datamonkey pokazala je da je 37 kodona pod pritiskom odabira. Datamonkey je također odabrao 24 mjesta označena Bayesovim pristupom pomoću PAML -a. Svi kodoni pod pozitivnom selekcijom pronađeni su unutar N-terminalne LRR domene, koja prepoznaje patogene, a 19 od tih mjesta bilo je prisutno na konveksnoj površini (slika   8B, ​, 8C). 8C). Petnaest od 24 PSC -a pronađeno je unutar ponavljanja LRR -a. Samo je pet od 24 mjesta pronađeno u beta pločama unutar konkavne površine dome u obliku potkove, dok je većina aminokiselina pod selekcijskim pritiskom bila na strukturnim komponentama LRR-a, zavojnicama.

Kodoni pod pozitivnom selekcijom u paralozima atlantskog bakalara Tlr22 i njihovo mjesto unutar Tlr22b. A. Kumulativne nesinonimne (zelene) i istoznačne (crvene) zamjene za sve usporedbe u paru između devet atlantskih bakalara tlr22 paralozi. Omjer nesinonimne (dN) i sinonimne (dS) supstitucije veći je u LRR regiji nego u TIR domeni. B. Poravnanje višestrukog slijeda bakalara Tlr22. Ostaci aminokiselina identični atlantskom bakalaru Tlr22b predstavljeni su točkom, a praznine u poravnanju označene su crticom. LRR regije zasjenjene su sivom bojom, a pozitivno odabrana mjesta označena su crvenom bojom. Grupa cisteina unutar domene LRRCT označena je zelenom bojom. C. Predviđena struktura atlantskog bakalara Tlr22b. LRR regija s pozitivno odabranim mjestima istaknuta crnom bojom. Njihov položaj aminokiselina označen je strelicama.

Tablica 4

Identifikacija pozitivno odabranih mjesta u atlantskom bakalaru tlr22paralozi analizom maksimalne vjerojatnosti

ModeliProcjene parametaraLn vjerojatnostUsporedba modelaPozitivno odabrana web mjesta
M0: neutralno ω = 1.12 �.27   Nijedan
M1: gotovo neutralno ω0 = 0,081, ω1 = 1 �.92   Nije dozvoljeno
str0 = 0,39, str1 = 0.61
M2: pozitivan odabir ω0 = 0,05, str0 = 0.28 �.74 M2 vs M1 4, 6, 30, 41, 73, 126, 170, 224, 250, 274, 279, 318, 326, 333, 369, 371, 427, 443, 452, 455, 458, 478, 484, 501, 503, 505, 507, 509, 528, 531, 553, 577, 674
ω1 = 1, str1 = 0.54 2 ΔlnL = 192,35,
ω2= 4.08, str2 = 0.18 df = 2, p = 0
M3: diskretno ω0 = 0,18, str0 = 0.35 �.56 M3 vs M0 1, 3, 4, 6, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 23, 25, 27, 28, 30, 33, 37, 40, 41, 43, 44, 49, 51, 52, 54, 56, 57, 59, 68, 70, 71, 73, 75, 76, 78, 80, 81, 82, 83, 94, 95, 97, 108, 110, 112, 115, 116, 122, 124, 126, 127, 129, 132, 134, 147, 152, 154, 156, 157, 159, 163, 169, 170, 172, 174, 175, 177, 178, 179, 180, 181, 189, 194, 196, 197, 210, 211, 212, 215, 224, 227, 230, 231, 233, 234, 236, 237, 240, 241, 245, 246, 247, 250, 251, 252, 253, 257, 260, 262, 267, 268, 271, 273, 274, 276, 277, 279, 281, 284, 287, 288, 294, 295, 297, 298, 301, 302, 303, 305, 307, 311, 313, 315, 316, 318, 320, 326, 330, 331, 333, 334, 335, 336, 338, 339, 340, 341, 342, 344, 345, 347, 349, 350, 352, 354, 355, 357, 358, 368, 369, 371, 375, 376, 378, 379, 382, 383, 387, 388, 392, 393, 395, 397, 400, 402, 403, 406, 410, 413, 414, 416, 417, 419, 421, 426, 427, 428, 429, 430, 432, 434, 438, 440, 441, 443, 445, 448, 452, 453, 455, 457, 458, 460, 471, 472, 474, 475, 476, 478, 480, 481, 484, 493, 495, 498, 499, 501, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 517, 524, 526, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 535, 538, 539, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 555, 556, 557, 572, 574, 577, 578, 579, 595, 596, 598, 600, 601, 603, 613, 616, 619, 620, 622, 624, 639, 642, 643, 645, 650, 662, 666, 670, 673, 674, 680, 681, 691, 702, 712, 719
ω1 = 1,19, str1 = 0.49 2 ΔlnL = 413,43,
ω2= 4.36, str2 = 0.16 df = 4, p = 0
M7: β p = 0,02, q = 0,01 �.60   Nije dozvoljeno
M8: β + ωS ϡ p = 0,1, q = 0,05 �.86 M8 protiv M7 1, 4, 6, 30, 41, 56, 73, 126, 170, 174, 224, 245, 250, 274, 279, 287, 295, 318, 326, 333, 342, 344, 355, 369, 371, 378, 393, 400, 427, 443, 452, 455, 457, 458, 460, 471, 474, 478, 484, 501, 503, 505, 506, 507, 509, 528, 529, 530, 531, 553, 577, 619, 674
ω = 4.062 ΔlnL = 201,48,
str0 = 0,81, str1 = 0.19 df = 2, p = 0
REL   4, 6, 30, 41, 49, 73, 76, 126, 147, 157, 170, 224, 246, 274, 279, 295, 318, 320, 326, 333, 342, 369, 371, 397, 400, 427, 452, 455, 478, 484, 501, 503, 507, 509, 553, 578, 613

Označena su samo pozitivno odabrana mjesta s Bayesovom stražnjom vjerojatnosti iznad 95%, a ona veća od 99% istaknuta su podebljana.

U REL analizi pozitivno su odabrana mjesta s Bayesovim faktorom većim od 50 podebljana.


3. Kemijske sonde na djelu: Primjene u oslikavanju bakterija

U nastavku ćemo istaknuti neka od najrelevantnijih područja primjene snimanja na temelju kemijskih sondi. Ove su aplikacije sažete na slici 2, a sonde su navedene u tablici 1.

Primjena kemijskih sondi u snimanju bakterija. Slike pokazuju korisnost u teškim sondama za vizualizaciju i potencijal za pročišćavanje, izolaciju i nizvodnu analizu razvrstavanjem stanica. Uzorne aplikacije za slikanje ilustrirane su slikama iz primarnih publikacija: (i) Ujednačeno označavanje PG uživo B. subtilis stanice pomoću FDAA (HADA) [112]. Slika je reproducirana uz dopuštenje [112]. (ii) Podstanična lokalizacija PBP -a tijekom diobe stanica i produženja u Lactococcus lactis prikazan je oznakom Bocillin-FL [130]. Slika je reproducirana iz [130] pod licencom Creative Commons Attribution (CC BY). (iii) Live –imenovanje mrtvih u E coli pokazuje označavanje FDAA -a (HADA) u živim stanicama (plavo), ali ne i mrtve stanice (crveno) [112]. Slika je reproducirana uz dopuštenje [112]. (iv) Internalizacija derivata ciprofloksacin fluorofora u živom obliku E coli sa (zelenim, lijevim) i bez (crvenim, desnim) inhibitorom ispušne pumpe [126]. Slika je reproducirana pod licencom Creative Commons Attribution 3.0 Unported License od [126] —Objavio Kraljevsko kemijsko društvo. (v) Odsustvo označavanja sondi zasnovanih na djelotvornosti (ABP) (ljubičasto) u nekim izrazima GFP-a S. aureus stanice (zelene) tijekom eksponencijalne faze ukazuju na fenotipski različite subpopulacije [7]. Slika je reproducirana uz dopuštenje [7]. (vi) Vibrioni su selektivno označeni fluorescentnim siderofornim konjugatom dobivenim od vibroferina vibrioferin-fluorescein (VF-FL) (gore), dok druge vrste nisu označene (dolje) [60]. Slika je prilagođena uz dopuštenje [60]. Autorsko pravo (2017.) Američko kemijsko društvo. (vii) Neinvazivno optičko in vivo snimanje miša s E coli i S. aureus-inducirani miozitis u udu pomoću fluorescentno označenog vankomicina [146].

Stol 1

Kemijske sonde i njihova primjena u vizualizaciji strukture i fiziologije bakterija.

Naziv sondeTip sondeCiljane vrsteMolekularni ciljOznake za otkrivanjePrimjenaReference
Vibrioferrin-FLNekovalentni ciljani konjugatV. parahaemolyticus,
V. kolere, i V. vulnificus
Put usvajanja sideroforaFluorofor/Bioortogonalna ručkaVizualizacija apsorpcije vibrioferina i selektivno otkrivanje vibriona u uvjetima ograničenim željezom[60]
DOTAM 𠄿LNekovalentni ciljani konjugatP. aeruginosa i E coliPut usvajanja sideroforaFluoroforVizualizacija transporta željeza i otkrivanje bakterijskih infekcija[25]
MDP -oviNekovalentni ciljani konjugatE coli, P. aeruginosa, B. subtilis, i S. aureusPut preuzimanja maltodekstrinaFluorofor/RadiooznakaVizualizacija preuzimanja maltodekstrina i otkrivanje bakterija visoke osjetljivosti in vivo[27,73,124]
Neo 𠄼y5Nekovalentni ciljani konjugatP. aeruginosa, A.
baumannii, K. pneumoniae, S. typhimurium,
i S. aureus
Put apsorpcije aminoglikozidnih antibiotikaFluorofor/Bioortogonalna ručkaVizualizacija unosa aminoglikozida i načina djelovanja[125]
Cipro-azidNekovalentni ciljani konjugatE coli i S. aureusPut preuzimanja antibiotikaFluorofor/Bioortogonalna ručkaRazumijevanje mehanizama prodiranja bakterija i istjecanja pumpe[126]
Van-FLNekovalentni ciljani konjugatB. subtilis, S. pneumoniae, S. coelicolor i C. glutamicumPG matični peptid (D-Ala-D-ALA)FluoroforVizualizirajte nastanak biosinteze PG u živim stanicama[64,127]
BOCILLIN-FLSonda na temelju aktivnostiE coli, P. aeruginosa, i S. pneumoniaeAktivni PBP (široki spektar)FluoroforDetekcija širokog spektra PBP aktivnosti u živim stanicama.[128,129,130]
Ceph C-TSonda na temelju aktivnostiB. subtilis i S. pneumoniaePBP -ovi 1a/1b, 2b, 2c i 4 (B. subtilis) i PBP1b i 3b (S. pneumoniae)FluoroforVizualizirajte uključivanje različitih
PBP podskupine u živim stanicama
[97]
β-laktonske sondeSonda na temelju aktivnosti S. pneumoniaePBP1a, PBP1b, PBP2x i PBP2aFluoroforVizualizirajte katalitičku aktivnost podskupina PBP -a
u živim stanicama
[131]
Sonda izvedena iz meropenema MEM-FLSonda na temelju aktivnosti B. subtilisPBP3 i 5Fluorofor/Bioortogonalna ručkaVizualizirajte
Aktivnost PBP3 u pojedinačnim stanicama tijekom diobe stanica
[132]
Fluoro-fosfonati (FP-TMR)Sonda na temelju aktivnosti S. aureusSerinske hidrolazeFluorofor/BiotinIdentifikacija aktivnosti serin hidrolaze[7,89]
JCP251-bTSonda na temelju aktivnosti S. aureusSerin-hidrolaza B (FphB) koja veže fluorofos-fonatFluoroforVizualizirajte lokalizaciju i distribuciju subcelularne FphB u staničnoj populaciji[7]
Sonde za triazol ureeSonda na temelju aktivnosti S. aureusSerinske hidrolaze i lipaze koje vežu fluorofos-fonatFluorofor/Bioortogonalna ručkaProcjena specifičnih razina aktivnosti stanične serin hidrolaze[84]
GlcA-ABPSonda na temelju aktivnostiMiš gastrointestinalni
mikroba
β-glukuronidazaFluorofor/Bioortogonalna ručkaDetekcija, izolacija i identifikacija mikrobnih subpopulacija u crijevnom mikrobiomu[133]
CSL174Sonda za supstrat M. tuberkulozaHidrolaza važna za patogenezu 1 (Hip1)FluoroforSpecifično otkrivanje aktivnosti proteaze Hip1[12]
BLJESAKSonda za supstrat M. tuberkulozaHidrolaza važna za patogenezu 1 (Hip1)ChemiluminescentOtkrivanje uživo M. tuberkuloza[45]
Calcein- AMSonda za supstratM. tuberkuloza i Mycobacterium smegmatisEsterazeFluoroforJednostanična procjena aktivnosti esteraze i unos sonde[103]
Redoks senzor zelen (RSG) Sonda za supstrat E coliBakterijska reduktazaFluoroforProcjena stanične redoks aktivnosti [104,105]
Peptidi izvedeni iz LPETG-a Metaboličko označavanje S. aureusSidrenje stanične stjenke ovisno o sortazi A –Fluorofor/Bioortogonalna ručkaSnimanje razina stanične sortaze A, reinženjering stanične stijenke[134,135]
CLSP i CLLPSonda za supstratSalmonela spp. i L. monocitogeniEsteraza i fosfatidilinositol-specifična fosfolipaza C (PI-PLC)LuminoforSelektivno otkrivanje Salmonela spp. i L.monocytogenes iz uzoraka hrane[44]
Nitro-aril fluorogenSonda za supstrat B. subtilisAktivnost nitroreduktazeFluoroforVizualizacija subcelularna lokalizacija nitroreduktaza [106]
CDG-OMeSonda za supstrat M. tuberkulozaβ-laktamaza (Bla) CFluoroforOtkrivanje uživo M. tuberkuloza[136,137]
Cy5. 5-TTSonda za supstrat S. aureusMikrokokna nukleaza (MN)Ugašeni fluoroforNeinvazivno otkrivanje S. aureus infekcije u modelu piomiozitisa miša[138]
Analozi D-alaninaMetaboličko označavanje L.  monocitogeniPeptidoglikanBioortogonalna ručkaVizualizacija PG dinamike[16]
Propargil-kolinMetaboličko označavanje S. pneumoniaeTeihoična kiselinaBioortogonalna ručkaVizualizacija biosinteze pneumokokne teihoične kiseline.[139]
FDAAMetaboličko označavanjeB. subtilis, E coli, S. aureus, S. pneumoniae, Agrobacterium tumefaciens
i C. crescentus
PG matični peptidFluorofor/Bioortogonalna ručkaVizualizacija biosinteze PG i ilustracija rasta i diobe bakterija[61,112,140,141,142]
KDOMetaboličko označavanjeE coli i Salmonella typhimuriumLPSFluorofor/Bioortogonalna ručkaVizualizacija strukture i položaja LPS -a[143]
Homopropargilglicin (HPG)Metaboličko označavanjeBakterije koje smanjuju sulfat,
nekulturni mikrobi
Sinteza proteinaBioortogonalna ručkaJednostanična procjena translacijske aktivnosti[144,145]
L-azidohomo-alanin (AHA)Metaboličko označavanjeE coli, pojedinačni sojevi bakterija iz okoliša i složeni uzorciSinteza proteinaBioortogonalna ručkaJednostanična procjena translacijske aktivnosti[19]
Azido-modificirana trehalozaMetaboličko označavanje M. tuberkulozaGlikolipidi na površini staniceBioortogonalna ručkaDetekcija i vizualizacija glikolipida na površini stanice[15]
Analozi trehalozeMetaboličko označavanjeMycobacterium sppMiko-membranaFluorofor/Bioortogonalna ručkaOdređivanje strukture ovojnice Mycobacterium[113]
Tioflavin T (ThT)Nespecifična fluorescentna boja B. subtilisMembranaFluoroforKvantifikacija membranskog potencijala[114]
DMN-TreSenzor okoliša/Metaboličko označavanje M. tuberkulozaMiko-membranaFluoroforOtkrivanje M. tuberkuloza[63]

3.1. Stanični zid

Bakterijska stanična stijenka je složeni makromolekularni heteropolimer koji stanici osigurava stabilnost, kontrolira unos i oslobađanje molekula i služi kao predložak za interakcije s okolinom. Proučavanje stanične stijenke bakterija nije važno samo za razumijevanje stanične morfologije, diobe i rasta stanica. Kako smetnje u strukturi stanične stjenke i biosintezi obično imaju štetne posljedice za stanicu, sveobuhvatno razumijevanje mehaničkih značajki strukture, funkcije i biosinteze PG -a također je ključno za razvoj novih antibiotika.

Bakterijska stanična stijenka sadrži kruti sloj peptidoglikana (PG). PG se sastoji od glikanskog lanca ponavljajućih disaharidnih jedinica N-acetilglukozamin i N-acetilmuramička kiselina koja je umrežena putem peptidnih mostova koji najčešće sadrže L-Ala, D-Ala, D-Glu, Gly, L-Lys, mezodiaminopimelovu kiselinu (DAP) ili druge aminokiseline. Točan sastav i struktura umrežavanja peptidnih mostova razlikuje se u različitim obiteljima bakterija (npr. Gram-pozitivne, gram-negativne i mikobakterije), ali također ovisno o točnoj vrsti i na temelju uvjeta kulture [147,148].

Biosinteza peptidoglikana započinje u citoplazmi gdje su prekursori disaharidnih građevnih blokova UDP-N-acetilmuramil (UDP-MurNAc) -pentapetid i UDP-N-acetilglukozamin (UDP-GlcNAc) se sintetizira, veže i kombinira na membranski lokalizirani izoprenoidni nosač kako bi se dobila središnja molekula PG-prekursora Lipid II (pregledano u [149]). Lipid II se zatim okreće prema vanjskoj strani citoplazmatske membrane (u gram-pozitivnih bakterija), što je ekvivalentno periplazmatskoj strani unutarnje membrane gram-negativnih bakterija. Nakon toga, disaharidne jedinice su ugrađene u postojeću, jako umreženu peptidoglikansku strukturu kroz aktivnost glikoziltransferaze ili transpeptidaze proteina koji vežu penicilin (PBP) (pregledano u [150,151]). DD-transpeptidazna aktivnost PBP-ova osigurava peptidno umrežavanje između D-Ala i DAP-a, dok LD-transpeptidaze izvode umrežavanje dva DAP ostatka [152]. Nadalje, PBP mogu također imati aktivnost DD-karboksipeptidaze i/ili endopeptidaze [153,154]. Biosintezu stanične stijenke možemo ispitati i vizualizirati pomoću dvije glavne strategije: prvo, ciljanjem enzimskih aktivnosti koje oblikuju staničnu stjenku i drugo, metaboličkim označavanjem polimera stanične stjenke.

3.1.1. Metaboličko označavanje peptidoglikana

Putevi sinteze PG te rast i struktura stanične stijenke mogu se proučavati pomoću metaboličkog označavanja s funkcionaliziranim D-aminokiselinama. Među najčešće korištenim sondama D-aminokiselina (DAA) su klikabilni analozi D-Ala i analozi fluorescentnih D-aminokiselina (FDAA) D-Ala i D-Lys [112] od kojih svaka ima različite karakteristike uključivanja u različite sonde bakterijske vrste. Kako bi se olakšali sekvencijalni protokoli označavanja i osigurala kompatibilnost s drugim postupcima bojenja, dostupni su FDAA-i, poput emitiranja plavog svjetla (HCC-amino-d-alanin, HADA), zelenog (NBD-amino-d-alanin, NADA i fluorescein- d-lizin, FDL) ili crveni (TAMRA-d-lizin, TDL) za PG označavanje živih bakterija [140]. Upotreba FDAA -e omogućila je, na primjer, otkrivanje mjesta nove sinteze PG -a u stanicama živih bakterijskih stanica, čime se razlikuje "##x02018stari ’" od ‘novog ’ PG te se također razlikuje metabolički aktivna od neaktivnih stanica [140]. Također je pomogao u identifikaciji inhibitora stanične diobe, u potvrđivanju uloge čimbenika diobe/produljenja stanica i drugih čimbenika uključenih u sintezu PG pomoću mutiranih sojeva [140]. Još jedno revolucionarno otkriće omogućeno je pomoću sondi D-Ala koje su se mogle kliknuti: Riješile su zagonetku anomalije hlamidije ‘ ’ (tj. Činjenicu da C. trachomatis je osjetljiv na antibiotike usmjerene na PG, dok se PG nije mogao otkriti), vizualizacijom funkcionalnog PG u C. trachomatis po prvi put [141].

Ugradnja DAA u PG može se odvijati na tri različita načina, ovisno o vrsti koja se proučava: Ugradnja se može dogoditi u D-Ala-D-Ala djelovanjem citoplazmatske D-alanin D-alanin ligaze (Ddl) ili putem ekstracitoplazme (npr. Periplazma) u gram-negativnih bakterija) L, D- ili D, D transpeptidaze (detaljno pregledano u [150,151]). Zanimljivo je da se pokazalo da su FDAA -e uključene u PG E coli i B. subtilis ekstracitoplazmatskim putovima, a ne putem unutarstaničnog prekursora D-Ala-D-Ala [142]. Važno je istaknuti da je međudjelovanje različitih puteva ugradnje PG od velike važnosti za aktivnost i rezistenciju antibiotika jer je objavljeno da sposobnost LD-transpeptidaza da zaobiđu aktivnost DD-transpeptidaze rezultira većom razinom rezistencije i#x003b2-laktamskih antibiotika u oba E coli i E. faecium [155,156]. Za detaljniji pregled istraživanja o tome kako su DAA-sonde pridonijele našem razumijevanju dinamike rasta i diobe bakterija čitatelj se upućuje na ovaj izvrstan pregledni članak [157]. Značajna kemijska inovacija za sonde D-aminokiselina bio je razvoj fluorogenih D-aminokiselina, koje pružaju nižu pozadinu i pogodne su za snimanje sinteze peptidoglikana u stvarnom vremenu [8].

3.1.2. Disektiranje aktivnosti proteina koji vežu penicilin

Objašnjenje specifične uloge različitih PBP u sintezi PG važno je za razumijevanje rasta stanica i homeostaze stanične stjenke, kao i za razumijevanje učinkovitosti i rezistencije antibiotika koji ciljaju na PBP. Fluorescentni derivati ​​penicilina (BOCILLIN-FL) bili su prvi ABP-i usmjereni na PBP. Oni su bili i još uvijek su korisni alati za otkrivanje PBP -a u membranskim frakcijama označenih stanica [129]. BOCILLIN-FL ne pravi razliku između različitih članova obitelji PBP, dok su fluorescentno označeni analozi beta-laktamskih antibiotika cefalosporina C i meroponema, kao i beta-laktoni uspješno korišteni za vizualizaciju aktivnosti pojedinih PBP-a u kontekstu žive stanice [91,131,132].

3.1.3. Ciljanje prekursora staničnih zidova

Druga strategija ispitivanja strukture i biosinteze PG -a je ciljanje prekursora Lipid II s fluorescentnim konjugatima vankomicina (glikopeptid) i ramoplanina (glikolipodepsipeptid) [64]. U neinvazivnim in vivo studijama snimanja, blisko infracrveni fluorescentni vankomicin-konjugati korišteni su za specifično otkrivanje mišjih infekcija uzrokovanih gram-pozitivnim bakterijama [146]. S obzirom na njihovu sposobnost razlikovanja gram-pozitivnih od gram-negativnih patogena u kompleksnih živih životinja u stvarnom vremenu, fluorescentni vankomicin-konjugati mogu se smatrati mrljom od gramature#21. stoljeća.

Ostali fluorescentni konjugati učinkovito su korišteni za proučavanje njihovog načina djelovanja, poput dansiliranih polimiksina koji otkrivaju njegovu interakciju s LPS-om u vanjskoj membrani gram-negativnih bakterija [65,158].

3.1.4. Ciljanje drugih komponenti stanične ovojnice

Sloj PG također predstavlja mjesta sidrenja za vezanje daljnjih makromolekula, uključujući proteine ​​usidrene na staničnoj stijenci, anionske polimere poput zidne teihoične kiseline i kapsula polisaharida. Kod gram-negativnih bakterija površinski izloženi polimeri, poput lipopolisaharida, mogu se usidriti u vanjsku membranu. 3-deoksi-D-mano-oktulosonska kiselina (KDO) bitna je komponenta unutarnje jezgre LPS-a i stoga je postala privlačan kandidat za pristup označavanju metaboličke sonde [143]. Još jedan dobar razlog što je KDO odabran kao meta sonde jer se analogni sonda 𠆜lickable ’ sonde KDO, poput 8-azido-8-deoksi-KDO, dobro podnosi putem KDO u širokom rasponu gram-negativnih bakterije [143]. Pokazalo se da je metabolička ugradnja analoga KDO u bakterijske lipopolisaharide neovisna o genetskim promjenama što je rezultiralo učinkovitim alatom za ispitivanje strukture LPS -a i njihove uloge u patofiziološkom procesu [143]. Nasuprot tome, nema široko primjenjive tehnike za označavanje teihoičnih kiselina u gram-pozitivnih bakterija. Međutim, jedinstvena značajka S. pneumoniae za ugradnju kolina u teihoičnu kiselinu omogućilo je upotrebu propargil-kolina kao bioortogonalne sonde za metaboličko označavanje teihoičnih kiselina koje se može detektirati putem CuAAC [139].

Izlučeni proteini mogu se usidriti u staničnu stijenku bakterije djelovanjem transpeptidaza koje prepoznaju specifične peptidne motive prepoznavanja. U S. aureus, Sortaza A prepoznaje svoje supstrate na temelju N-terminalne LPXTG-sekvence, cijepa se između Thr i Gly i prenosi N-terminalni dio proteina na slobodni NH2-krajci u Lipidu II [134]. Ovaj motiv sidrišta usmjeren na sortazu iskorišten je za razvoj fluorescentnih i bioortogonalnih kemijskih sondi koje su ukrašene na bakterijskoj staničnoj stjenci, omogućavajući podstaničnu lokalizaciju supstrata sortaze A i dopuštajući druge strategije inženjeringa stanične stijenke [134,135]. Druge strukture stanične površine poput flagella i pili igraju ključnu ulogu u bakterijskoj patogenezi koja uključuje pokretljivost stanica, adheziju, kemotaksiju i konjugaciju. Koliko znamo, nisu razvijene posebne kemijske sonde za ispitivanje njihove funkcije, međutim, neke komercijalne nespecifične fluorescentne boje korištene su za hvatanje flagela i pili u djelovanju na nekoliko bakterijskih vrsta [9,159,160,161,162].

3.1.5. Trehaloza i jedinstvena stanična ovojnica mikobakterija

Mikobakterije, koje uključuju M. tuberkuloza (Mtb), imaju staničnu ovojnicu koja se jako razlikuje od Gram-pozitivne i Gram-negativne i koja uključuje jedinstveni sloj mikomembrane koji sadrži arabinogalaktan i dugolančane mikolne kiseline obogaćene glikolipidima koji sadrže trehalozu (pregledano u [163,164]). Primjena fluorescentnih konjugata trehaloze otkrila je označavanje mikobakterijske membrane i polova te omogućila selektivnu detekciju Mtb unutar makrofaga [113]. Druge su studije koristile analoge trehaloze modificirane azidima za vizualizaciju glikolipida na površini stanice otkrivajući mehanistički uvid u molekularne putove modifikacija trehaloze i recikliranje [15]. Metabolizam trehaloze također je iskorišten za razvoj ekološki osjetljive fluorescentne sonde trehaloze koja svijetli u hidrofobnom okruženju ovojnice mikobakterijskih stanica i može se koristiti za brzo i osjetljivo otkrivanje Mtb [63]. Zanimljivo je da je nedavno istraživanje koje je koristilo fluorescentne aminoglikozidne antibiotike otkrilo subpopulacije E coli s različitim svojstvima označavanja sondi. Slabo označavanje subpopulacije pripisano je nespecifičnom vezanju sonde za membranu, dok stanice s visokim obilježavanjem sonde preuzimaju antibiotik u procesu ovisnom o energiji, što ukazuje na to da ove dvije subpopulacije posjeduju različitu osjetljivost na aminoglikozidne antibiotike [125].

3.2. Diseciranje osjetljivosti i rezistencije na antibiotike

Rezistencija na antibiotike može se temeljiti na različitim mehanizmima koji se mogu proučavati pomoću kemijskih sondi, uključujući mehanizme zaobilaženja cilja, enzime koji mijenjaju antibiotike ili promijenjena svojstva stanične penetracije/istjecanja. Za PBP, u S. aureus ili E. faecium identificirani su pojedinačni PBP-ovi povezani s niskim afinitetom. S proširenim skupom alata od ABP -a koji selektivno ciljaju PBP -ove [97,131,132], vizualizacija svojstava otpornosti pomoću kemijskih sondi čini se nadohvat ruke.

Drugi razlog za rezistenciju na β-laktam mogu biti enzimi β-laktamaze koji hidroliziraju i inaktiviraju β-laktamske antibiotike [137]. Fluorogeni umbelliferon-cefalosporinski konjugati koji služe kao korisno oruđe za proučavanje prirodne β-laktamaze Mtb (Bla) [136,137]. Pokazano je da je fluorogena sonda na bazi cefalosporina visoko selektivna za Bla i da je stoga primjenjiva u dijagnostičke svrhe na licu mjesta [136].

Drugi važan mehanizam rezistencije na antibiotike je promijenjena svojstva preuzimanja i istjecanja antibiotika zbog smanjene ekspresije porina ili povećane ekspresije efluksnih pumpi (detaljno pregledano [165]). Ti se mehanizmi mogu proučavati pomoću fluorescentnih antibiotskih konjugata. Linezolid je bakterijski inhibitor sinteze proteina koji pripada klasi oksazolidinonskih antibiotika, a sonde linezolida funkcionalne azidima mogu se koristiti za vizualizaciju apsorpcije AB-a u gram-pozitivne bakterije [72], dok djelovanje efluksnih pumpi sprječava označavanje Gram- negativne stanice s ovom sondom [166]. Sonde izvedene iz fluorokinolona i trimetoprima također su korištene za proučavanje prodora i istjecanja bakterijskih stanica, a studije mutantne i kemijske inhibicije pokazale su da njihova unutarstanična akumulacija ovisi o aktivnosti efluksnih sustava [126,167]. Osim proučavanja nakupljanja antibiotika u bakterijskim stanicama, fluorescentni konjugati također su korišteni za proučavanje tkivne distribucije antibiotika [72].

3.3. Vizualizacija specifičnih metaboličkih puteva usvajanja

3.3.1. Siderofori

Željezo je bitan element za rast i opstanak bakterija. Siderofori koje izlučuju i koriste mikrobi sudjeluju u uklanjanju željeza iz njihove okoline, što je ključno za preživljavanje bakterija u uvjetima ograničavanja željeza. U potrazi za novim i poboljšanim lijekovima, AB-konjugati su nova strategija koja obećava isporuku AB-a stanicama koje inače nisu osjetljive na AB [25,168,169]. Ti su napori doveli do odobrenja FDA-e za siderofor-cefalosporinski konjugat cefiderokol koji je vrlo učinkovit protiv gram-negativnih bakterija [170]. Kako ti AB-konjugati okreću mehanizme preuzimanja patogena protiv sebe, pristup je nazvan strategijom trojanskog konja. Unos siderofora u E coli je aktivan proces ovisan o energiji koji započinje vezanjem za proteine ​​receptora na vanjskim membranama (OM) [171]. Fluorescentne i radioaktivno obilježene sideroforne konjugate na bazi katehola učinkovito apsorbiraju različiti bakterijski patogeni i korišteni su za neinvazivno optičko in vivo snimanje miševskog modela P. aeruginosa infekcija [25]. Autori primjećuju da su u mnogim slučajevima u mikroskopskim i protočnim citometrijskim pokusima primijetili da je "samo iz nepoznatih molekularnih razloga" samo subpopulacija stanica uspjela preuzeti te sonde [25], što naglašava korisnost kemijske sonde u seciranju funkcionalna heterogenost među staničnim populacijama.

Ostale sideroforne sonde oslanjaju se na vrlo specifične putove usvajanja i mogu ih preuzeti samo mala skupina bakterija, dopuštajući diferencijaciju bakterijskih vrsta. Jedan takav primjer je Vibrioferin (VF), fluorescentni konjugati od kojih fluorescentni VF-konjugati mogu selektivno označiti Vibrio vrste u uvjetima koji ograničavaju željezo, dopuštajući njihovu diskriminaciju od S. aureus ili E coli [60].

3.3.2. Unos šećera

Druga skupina biomolekula čija se stanična apsorpcija pokreće posebnim molekularnim strojevima su šećeri poput maltodekstrina. Aktivno preuzimanje maltodekstrina uključuje translokaciju kroz OM putem maltoporina, nakon čega slijedi periplazmatsko vezanje na protein koji veže maltozu i translokacija kroz unutarnju membranu putem transportera maltodekstrina [124]. Zbog nedostatka transportera maltodekstrina u sisavaca, fluorescentni konjugati maltodekstrina mogu poslužiti kao selektivni alati za neinvazivno optičko in vivo snimanje bakterijskih infekcija [73]. Ista skupina pokazala je u nastavku istraživanja da se unos maltodekstrina također može ciljati radiooznačenim sondama za vizualizaciju mjesta bakterijskih infekcija kod miševa putem PET snimanja [26].

3.4. Vizualizacija enzima povezanih s virusom

Enzimi mogu biti važni čimbenici virulencije, a snimanje temeljeno na kemijskim sondama može pružiti važan uvid u podstaničnu lokalizaciju i obrasce dinamičke aktivnosti enzima povezanih s virulencijom. Naš nedavni rad na prethodno nekarakteriziranom S. aureus fluorofosfonat-vezujuće hidrolaze (Fph) ilustrira kako ABP-i mogu biti instrumentalni kako u identifikaciji novih enzimskih aktivnosti, tako i u njihovoj funkcionalnoj validaciji [7,84]. Fluorescentni konjugati novootkrivenih inhibitora specifičnih za FphB otkrili su selektivno označavanje ciljnog enzima na specifičnim mjestima stanične ovojnice i obilježavanje presjeka poprečne stijenke stanica koje dijele ovisno o rastu, što upućuje na to da njegova fiziološka uloga može biti modifikacija supstrata koji se nalaze u stanična stijenka [7,84]. Također smo pokazali da je FACS-analiza ABP-obilježenih bakterijskih populacija prikladna za seciranje dinamičke raspodjele razine enzimske aktivnosti po stanicama u različitim okruženjima rasta [7,84].

U drugim slučajevima, faktori virulencije ciljani su na omogućavanje detekcije specifične za patogene na osnovi sonde, što je slučaj za staničnu ovojnicu povezanu M. tuberkuloza proteaza Hidrolaza važna za patogenezu 1 (Hip 1) [12]. Razjašnjenje profila selektivnosti proteolitičkog supstrata za Hip1 omogućilo je stvaranje visoko specifičnih hibridnih kanonskih/nekanonskih peptidnih fluorogenih supstrata koje Mtb okreće na način ovisan o Hip1 i obećava razvoj Mtb-specifičnih sredstava za snimanje [12] . Ova sekvenca peptida usmjerena na Hip1 nedavno je uvedena u luminogenu sondu FLASH koja detektira aktivnost Hip1 s iznimno visokom osjetljivošću [45].

Izlučene nukleaze važni su čimbenici virulencije S. aureus koji sudjeluju u razgradnji izvanstanične DNA S. aureus biofilmovi. Ugašeni fluorescentni oligonukleotidni supstrati s kemijskim modifikacijama za sprječavanje cijepanja nukleazama sisavaca osiguravaju S. aureus nukleazni specifični signal koji je omogućio neinvazivno in vivo snimanje S. aureus infekcije u modelu piomiozitisa miša [138]. Slične sonde nukleaze temeljene na FRET-u također su bile korisne za snimanje površinske lokalizacije nukleazne aktivnosti nukleaze i identificirale su vršnu aktivnost tijekom ranog logaritamskog rasta [172].

3.5. Biofilmovi i druge mikrobne zajednice

Biofilmovi su heterogene bakterijske zajednice koje su ugrađene u samoproizvedeni izvanstanični matriks polisaharida, proteina i DNA. Biofilmovi su najčešće površinski povezani, a u kontekstu infekcija povezanih s medicinskim proizvodima/implantatima, predstavljaju veliku kliničku zabrinutost jer ih je teško iskorijeniti. Za postavke biofilma, upotreba kemijskih sondi korisna je za vizualizaciju i kvantificiranje funkcionalno različitih stanica unutar populacije. Najjednostavnija i najčešća funkcionalna diferencijacija stanica unutar biofilmova je između živih i mrtvih stanica pomoću kombinacije različitih nespecifičnih boja s različitom staničnom propusnošću u živim i mrtvim stanicama [173,174]. Valja napomenuti, međutim, da čimbenici osim stanične smrti mogu utjecati na očitavanja stanične propusnosti [5,6].

Druga klinički značajna stanična subpopulacija bakterija su perzistentne stanice. Perzistentne stanice su fenotipske varijante unutar izogenih bakterijskih populacija koje mogu preživjeti liječenje antibioticima bez razvoja genetske rezistencije na antibiotike [175]. Ove se stanice morfološki ne razlikuju od većine stanica osjetljivih na antibiotike. Brynildsen i suradnici primijenili su fluorogene supstrate koji se aktiviraju reduktazama kao markeri za metaboličku aktivnost u kombinaciji s fluorescentno aktiviranim sortiranjem stanica (FACS) i analizama perzistentnih stanica. Ove elegantne studije otkrile su da je u E coli, spontano nastali perzisti u eksponencijalnoj fazi uglavnom su izvedeni iz metabolički uspavanih stanica (s niskim označavanjem fluorogene sonde) [104], dok je za stvaranje aktiviranih perzistera u stacionarnoj fazi bila potrebna velika redoks-aktivnost (označavanje s visokom sondom) [105].

Druga studija koristila je nespecifičnu sondu esteraze kalcein-AM u mikobakterijama, nakon čega je uslijedilo sortiranje po FACS-u i ispitivanje osjetljivosti na antibiotike [103]. Autori su nastavili s transpozonskim mutantnim ekranom temeljenim na FACS-u koji je identificirao čimbenike koji utječu na bojanje kalceinom-AM u stanicama. Ovo je uključivalo očite kandidate kao što su esteraze i pumpe za istjecanje, ali je također identificiran faktor mikobakterijske podjele odgovoran za heterogenost u polarnom rastu. [103]

Sonde koje odabiru mete također mogu poslužiti kao izvještači o fenotipskoj heterogenosti u populaciji bakterija, kao što su naše već spomenute studije o raspodjeli enzimskih aktivnosti S. aureus otkriveni su faktori virulencije serina FphB i FphE u svim uvjetima rasta [7,84]. Iako fiziološka važnost i molekularni mehanizmi koji stoje iza ovog opažanja ostaju nejasni, on pokazuje kako uporaba kemijskih sondi u staničnom oslikavanju može otkriti novu biologiju & dizajnom i slučajnošću.

Dok prethodni primjeri ilustriraju moć kemijskih sondi u disekciji fiziološke raznolikosti unutar populacija pojedinačnih bakterijskih vrsta, oni su također primijenjeni za dekonstrukciju još složenijih uzoraka uzetih iz ekoloških zajednica ili ljudskog mikrobioma. Whidbey i suradnici koristili su sonde zasnovane na aktivnosti specifične za beta-glukuronidazu kako bi izolirale bakterijske subpopulacije iz uzorka fekalnog miša i odredile svojte beta-glukuronidaze aktivne unutar crijevnog mikrobioma [133].

Jedna nova strategija metaboličkog označavanja koja se koristila za razlikovanje pojedinačnih stanica uzoraka bakterija iz okoliša na temelju njihove translacijske aktivnosti je 𠆛io-ortogonalno nekanonsko označavanje aminokiselina ’ (BONCAT [19,144]). BONCAT koristi analoge L-metionina funkcionalizirane azidom/ili alkinom, koji su ugrađeni u novoprevedene proteine ​​i mogu se vizualizirati konjugacijom fluorescentnih boja u bio-ortogonalnoj reakciji nakon označavanja [19] i omogućuje razdvajanje stanica na temelju njihove anaboličke aktivnosti sortiranjem stanica aktiviranih fluorescencijom [62,144].


Biorazgradnja od strane pripadnika roda Rhodococcus: Biokemija, fiziologija i genetska prilagodba

Ovo se poglavlje usredotočuje na biokemijsku i genetsku svestranost pripadnika roda Rhodococcus te dodatno naglašava važnost ovih bakterija u ekološkim primjenama. Rod Rhodococcus uključuje raznoliko grupiranje unutar šire skupine nokardioformnih aktinomiceta i uobičajeno je u mnogim ekološkim nišama od tla do slatke vode, morske vode, biljaka i životinja. Izvanredna sposobnost pripadnika roda Rhodococcus za razgradnju mnogih organskih spojeva, njihovu sposobnost proizvodnje površinski aktivnih tvari i postojanost u okolišu čine ih idealnim kandidatima za poboljšanje bioremedijacije onečišćenih mjesta. S obzirom na značaj za okoliš, raznolikost metabolizma i potencijal za biotehnološke primjene, rodokoki su u nekim aspektima slični pseudomonadama i srodnim bakterijama. Njegova je genetska raznolikost ogromna, a odabir reprezentativnog soja težak. Značajka koja može utjecati na segregaciju genetskih elemenata, a koja se često ne uzima u obzir je njihov stanični pleomorfizam.


REZULTATI

Epidermalne stanice V. aestivalis i V. vinifera Različito reagirajte na konidiospore

Za usporedbu karakteristika simptoma izazvanih PM-om u dva genotipa vinove loze, proveli smo mikroskopsko istraživanje klijanja konidiospora i razvoja hifa tijekom 6-dnevnog razdoblja. Mikroskopske slike od 24, 48 i 120 hpi prikazane su na slici 1. Konidiospore su proizvodile apresoriju i sekundarne hife na obje V. vinifera i V. aestivalis odlazi pri 24 hpi. U V. aestivalis lišće, većina epidermalnih stanica napadnutih konidiosporama ima smeđu boju, koja je bila vidljiva nakon što je tkivo očišćeno od klorofila (slika 1). Ovo smeđe se pojačalo u području stanične stjenke. Smeđe obojene stanice također su uočene ispod apresorija koje su se razvile iz sekundarnih hifa nadalje V. aestivalis ostavlja pri 120 hpi. Infekcija je dovela do stvaranja kolonija s gustim sekundarnim hifama V. vinifera lišće, ali samo male kolonije s rijetkim hifama V. aestivalis ostavlja za 120 hpi.

Napredovanje PM uključeno V. vinifera i V. aestivalis lišće. Prikazane su reprezentativne slike snimljene pri 24, 48 i 120 hpi s konidiosporama. Spore i hife obojene su 0,05% anilin plavom bojom. Slike su snimljene pri uvećanju od 100 × pod svjetlom prijenosa. Traka ljestvice = 65 μm. Umetci unutar prve dvije fotografije slike su uvećanja od 600 ×. Traka ljestvice = 25 μm. bc, smeđe ćelije HP, sekundarne hife sp, konidiospore.

SA je prisutan na povišenim razinama u PM zaraženim V. vinifera i u Mock-Inoculated V. aestivalis

Poznato je da je SA signalna molekula u indukciji obrambenih odgovora domaćina, uključujući preosjetljivi odgovor i sistemski stečenu rezistenciju, te da je povećanje razine endogenog SA povezano s aktivacijom ekspresije gena PR (Shah, 2003). Za procjenu mijenjaju li se razine SA tijekom PM infekcije u V. aestivalis i V. vinifera, izmjerili smo ukupni sadržaj SA u lisnom tkivu zaraženom PM V. aestivalis i V. vinifera u usporedbi s lažnim uzorcima inokuliranim pomoću HPLC. Promjene sadržaja SA u inokuliranim PM-om V. aestivalis na 24, 48 i 120 hpi nisu bile statistički značajne u usporedbi s lažnim inokuliranim tkivom lišća (slika 2A). Nasuprot tome, otkrili smo da se razina SA povećala u lisnom tkivu zaraženom PM V. vinifera pri 120 hpi, ali nije bilo značajne razlike u razinama SA između uzoraka inokuliranih PM-om i lažnih inokuliranih uzoraka pri 24 i 48 hpi (slika 2B).

Endogene razine ukupnog SA u V. aestivalis i V. vinifera. A, Akumulacija SA u PM zaraženom V. aestivalis tkivo lista (I) u usporedbi s lažno inokuliranim uzorcima (M) pri 24, 48 i 120 hpi. B, Akumulacija SA u PM zaraženom V. vinifera tkivo lista (I) u usporedbi s lažno inokuliranim uzorcima (M) pri 24, 48 i 120 hpi. Vrijednosti su prosjek tri biološka uzorka za svaku vremensku točku. Trake pogrešaka predstavljaju sd, n = 3.

Naši raniji rezultati iz analize promjena transkriptoma specifičnih za genotip pokazali su da reprezentativni PR geni uključuju PR-2 i PR-3 su konstitutivno prepisane na višim razinama u V. aestivalis nego u V. vinifera (Fung i sur., 2007.). Moguće je da je veća ekspresija PR gena posljedica povišenih razina SA u V. aestivalis. Kako bismo ispitali tu mogućnost, usporedili smo razine endogenog SA između dva genotipa vinove loze u lažnim uvjetima inokulacije. Utvrdili smo da sadržaj endogenog SA u V. aestivalis bila znatno veća nego u V. vinifera u nedostatku gljive (slika 2).

PM-Responsive Transcript Profili su različiti u dva genotipa vinove loze

U prethodnoj studiji otkrili smo da se promjene transkriptoma mogu pouzdano mjeriti u oba V. aestivalis i V. vinifera pomoću Vitis GeneChip (Fung i sur., 2007). Ovaj nam je nalaz omogućio da usporedimo broj transkripta između biljaka inokuliranih PM-om i lažno inokuliranih biljaka u dva genotipa vinove loze pri 0, 4, 8, 12, 24 i 48 hpi. Prikupljeni su i analizirani podaci o tri neovisna biološka ponavljanja. Proveli smo dva neovisna Ž testovi (po jedan za svaki genotip) kako bi se utvrdilo je li razina ekspresije transkripta u biljci inokuliranoj PM različita od lažno inokulirane biljke u bilo kojem trenutku. Proveli smo i dodatnu Ž test s modelom koji je uključivao podatke iz oba genotipa i uključivao učinak genotipova za testiranje iste nulte hipoteze. Radi objašnjenja heteroskedastičnosti varijance pogreške između dva genotipa vinove loze, raspodjela rezidua ɛijkm se smatralo normalnim s varijansom pogreške σ 2 N za ostatke povezane s V. aestivalis opažanja i σ 2 C za ostatke povezane s V. vinifera. Ako je nulta hipoteza odbačena, to je pokazalo da se razina transkripta između uzoraka inokuliranih PM-om i lažnih inokuliranih uzoraka razlikovala u najmanje jednoj vremenskoj točki, te da se smatralo da transkript reagira na PM za taj genotip. Da bismo objavili statističku značajnost i uzeli u obzir višestruke testove, koristili smo razinu lažne stope otkrivanja (FDR) od 0,05 aproksimiranu primjenom pristupa Benjamini-Hochberg (Benjamini i Hochberg, 1995.). Identificirali smo 626 prijepisa na Vitis GeneChip koji su različito izraženi u V. vinifera. Nasuprot tome, smatralo se da su samo četiri transkripta različito izražena u V. aestivalis na 0,05 razini FDR-a tri su također pronađena u 626 PM-odgovarajućih transkripata V. vinifera. U slučajnom otkriću, jedan od transkripata koji reagiraju na PM (Affy ID 1615715_at) poravnat s EST gljive E. necator, a predviđena aminokiselinska sekvenca homologna je hipotetičkom proteinu MG09900.4 iz Magnaporthe grisea (e = 2e-15). Ovaj gljivični prijepis dosljedno je bio prisutan u PM-inokuliranom V. aestivalis i V. vinifera ali nedostaje u lažnim uzorcima cijepljenim u svih šest vremenskih točaka. Ovaj je transkript slučajno poslužio kao set kontrolnih sondi koji je potvrdio prisutnost i odsutnost konidija u uzorcima inokuliranim PM-om, odnosno lažno. Tako su pronađena tri odnosno 625 biljno specifičnih transkripata. Imena gena temeljena na homologiji sekvenci prema drugim biljnim vrstama, UniGene ID, vrijednost izraza transformirana logom, promjena nabora, nominalna P vrijednost i FDR-ispravljen P vrijednost za 625 PM transkripata koji reagiraju na PM u V. vinifera i tri transkripta koji odgovaraju na PM V. aestivalis su navedene (Dopunska tablica S1).

Za gene koji su se značajno razlikovali između PM i lažno inokuliranih uzoraka u najmanje jednoj vremenskoj točki, klasificirali smo razlike u svakoj vremenskoj točki kao regulirane prema gore, prema dolje ili iste na temelju nominalne P vrijednost za kontrast između PM i lažno inokuliranih uzoraka u toj vremenskoj točki i smjer razlike (dodatna tablica S1). Uočili smo da se broj transkripata koji reagiraju na PM povećavao kako se PM razvijao u V. vinifera (Slika 3). Ukupan broj transkripata reguliranih prema gore i prema dolje tijekom rane faze infekcije (0 𠄸 hpi) bio je oko 100 do 150, a zatim se povećao na preko 250 pri 12 hpi i 350 pri 48 hpi (slika 3). Daljnja analiza transkripata odgovornih na 625 PM pokazala je da predstavljaju 598 gena (510 UniGena i 88 singletona) na temelju dodjele UniGene u Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (NCBI). Dvadeset od 510 UniGenea bilo je predstavljeno s više od jednog skupa sondi. Ukupno je 240 gena (175 UniGena i 65 singletona) bilo regulirano prema gore, a 345 gena (323 UniGena i 22 singletona) regulirano je prema dolje u najmanje jednoj vremenskoj točki, dok su četiri gena (UniGene) bila gore i dolje- regulirano tijekom nekih vremenskih točaka. Ekspresija 12 gena (11 UniGena i jedan singleton) bila je značajna samo za početni test, ali ne i za pojedinačni test u vremenskoj točki.

Broj transkripata (skupova sondi) koji su različito izraženi kao odgovor na inokulacije PM u odnosu na lažne inokulacije V. vinifera u svakoj od šest vremenskih točaka.

Pretpostavili smo da je mogući razlog za mali broj transkripata koji reagiraju na PM u V. aestivalis je da su mnogi od 625 PM transkripata koji odgovaraju na PM konstitutivno izraženi na višoj ili nižoj razini u V. aestivalis nego u V. vinifera čak i prije PM infekcije. Kako bismo provjerili ovu hipotezu, usporedili smo razinu transkripta dvaju genotipova za 625 PM-odgovornih transkripata V. vinifera. Prvo smo testirali jesu li dva genotipa različita u bilo kojem trenutku pri FDR -u od 0,05. Nominalno P vrijednost kontrasta u pojedinačnoj vremenskoj točki, zajedno sa smjerom uočene razlike, korištena je za klasifikaciju razlike među genotipovima u toj vremenskoj točki kao veće, niže ili iste. Utvrdili smo da 508 od 625 PM transkripata koji reagiraju na PM pokazuju veću ili nižu ekspresiju u V. aestivalis u usporedbi s V. vinifera za najmanje jednu pojedinačnu vremensku točku. Od ovih 508 transkripata, 83 transkripta su izražena na višoj razini, a 219 na nižoj razini u V. aestivalis u svih šest vremenskih točaka pod uvjetom lažne inokulacije. Također smo testirali jesu li naši nalazi u skladu s diferencijalnim odgovorom na liječenje izravno testiranjem interakcije tretmana i raznolikosti u svim vremenskim točkama. Od 625 identificiranih transkripata, 533 su pokazala dokaze o interakciji između tretmana i sorte (FDR 0,20).

Reprezentativni geni provjereni su kvantitativnim PCR -om

Izveli smo kvantitativne PCR testove u stvarnom vremenu (qRT-PCR) na podskupu gena kako bismo provjerili diferencijalnu ekspresiju izmjerenu u analizi mikročipova. Trinaest gena je odabrano od 598 gena koji reagiraju na PM u V. vinifera (Prag FDR -a P vrijednost < 0,05). Dva od tri različito regulirana u V. aestivalis kao odgovor na PM infekciju također su analizirani qRT-PCR. Stupanj promjene u broju transkripata svakog gena određen mikromrežom i qRT-PCR testom uspoređen je korištenjem razlike u prirodnim log vrijednostima između uzoraka PM-i lažno inokuliranih za svaku od šest vremenskih točaka (Dopunska tablica S2 ). Za 13 od 15 gena, rezultati između qRT-PCR-a i mikromreže bili su u skladu. Korelacija između procjena mikromreže i qRT-PCR bila je pozitivna u svim slučajevima i značajno se razlikovala od nule (dopunska tablica S2, dopunska slika S1). Najniža uočena korelacija bila je 0,61 pri 0 hpi, a najveća 0,90 pri 24 i 48 hpi. Za dva od 15 gena (1611550_at i 1611058_at), podudarnost u vremenskim točkama 0 i 12 hpi bila je loša. Čini se da su ova dva gena pokazala apsolutne razlike u razinama ekspresije između dvije platforme te su, na temelju toga, eliminirana iz usporedbi za preostale vremenske točke.

Profili izraza transkripata odgovornih na PM različiti su u šest vremenskih točaka

Kako bismo stekli globalni pregled transkriptoma koji reagira na PM, proveli smo nelinearnu klaster analizu razlike između uzoraka inkuliranih PM i 14,571 informativnih transkripata u V. vinifera koji su otkriveni u najmanje jednom uzorku (Qu i Xu, 2006). Ovaj pristup grupira profile ekspresije gena na temelju uzorka srednjih razlika između vrijednosti ekspresije PM- i lažno inokuliranih uzoraka tijekom šest vremenskih točaka. Ukupno je identificirano 25 klastera (Dopunska slika S2 Dopunska tablica S3).Otkrili smo da su mnogi geni u skupinama 5, 16 i 18 među 625 statistički značajnih transkripata koji reagiraju na PM (25,4%, 100%i 23,3%, respektivno). Slika 4A prikazuje distribuciju 625 transkripata koji reagiraju na PM u svakom klasteru. Zanimljivo je da su ove tri skupine pokazale različite obrasce izražavanja za koje se čini da odražavaju napredovanje PM infekcije (slika 4B). Nadalje, poznato je da većina transkripata koji reagiraju na PM iz grozdova 5, 16 i 18 reagira na biljne patogene (slika 4B). Odgovara na PM PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5, i PR-8 pripadao grupi 5 zajedno s bZIP transkripcijskim faktorom i protein oksidazom sličnom dirigentu. Klaster 18 sadržavao je tri PR-10s i pet gena stilbene sintaze, a PR-2, a PR-3, a KRIVO, a također i gen koji kodira protein sličan dirigentu (slika 4B). Grupu 5 karakteriziralo je stalno povećanje broja transkripata počevši od 12 hpi, dok su klasteri 16 i 18 predstavljali obrazac čiji je izraz dosegao vrhunac na 12 hpi, a zatim se smanjio na 24 hpi (slika 4B).

Klasterska analiza transkripata koji reagiraju na PM V. vinifera. A, Postotak čitavih skupova sondi u cjelini Vitis GeneChip koji je raspodijeljen u svakoj skupini (isprekidana linija) i udio od 625 značajno izraženih transkripata (skup Si-sondi) u svakoj od 25 grupa (puna linija). B, Izraziti obrasci ekspresije gena u klasterima 5, 16 i 18. Desno je popis gena među 625 PM-reagirajućih transkripata koji su grupirani zajedno u tom klasteru.

Ključne promjene obrambenih gena u PM-inokuliranim V. vinifera

Otkrili smo da razina ekspresije gena koji kodiraju PR-2 (β-1,3-glukanaze), PR-3 (hitinaze) i PR-5 (protein sličan taumatinu) povećavali su se nakon PM infekcije tijekom procesa infekcije (Dopunska tablica S1), potvrđujući prijašnja izvješća da su ti geni povezan s obranom vinove loze od patogena (Derckel i sur., 1996. Busam i sur., 1997. Salzman i sur., 1998. Jacobs i sur., 1999. Renault i sur., 2000. Tattersall i sur., 2001. Ferreira i sur., 2004.) . Također smo identificirali mnoge obrambene/PR gene koji nisu dobro okarakterizirani u interakcijama između PM i vinove loze. Ti su geni potencijalno uključeni u percepciju obrambenog signala i MAPK-posredovanu transdukciju signala, regulaciju transkripcije, biosintezu fitoaleksina i lignina, modifikaciju stanične stijenke i metabolizam reaktivnih vrsta kisika (ROS Tablica I). Pronašli smo najmanje osam gena kinaze slične receptorima (RLK) (Tablica I). Tri od njih su homologna s genom Avr9/Cf-9 koji se brzo izlučuje (ACRE) 256 u duhanu (Nicotiana tabacum) biljka. Profil ekspresije jednog gena RLK prikazan je na slici 5. Dva gena su homologna Arabidopsisu (Arabidopsis thaliana) AtMEK1 i AtMPK3 kodiranje MAPKK odnosno MAPK (Tablica I). Gen MAPKK induciran je već pri 12 hpi (slika 5). Za dva identificirana gena EDS1 (tablica I), jedan je induciran pri 24 i 48 hpi (slika 5), ​​dok je drugi bio reguliran prema gore pri 4 i 48 hpi. Sedam pripadnika KRIVO obitelj je bila regulirana (Tablica I). Najbliži ortolozi Arabidopsisa KRIVOs jesu AtWRKY11, 15, 33, 40, 53, i 75. Profil izraza AtWRKY53 homolog koji predstavlja primjer uzorka ekspresije gena WRKY prikazan je na slici 5. Jedan PR-1 je inducirano u V. vinifera nakon 8 hpi (slika 5) i najbliži Arabidopsis homolog At2g14610 jedini je PR-1 koji je induciran SA ili infekcijom patogenom (Uknes i sur., 1992. van Loon i sur., 2006.). PR-1 je marker gen koji ukazuje na početak lokalne obrane i sistemski stečene rezistencije, iako njegova precizna enzimska aktivnost i funkcija još nisu definirani (van Loon i sur., 2006.). Identificirano je pet gena PR-10, od kojih su četiri bili regulirani prema gore, dok je jedan bio blago potisnut. Jedan PR-10 je induciran pri 8 hpi i nastavio se povećavati sa 12 na 48 hpi (slika 5). Stoga je vjerojatno da će indukcija PR-1 i PR-10 pokazatelj je obrambenog odgovora tijekom interakcije vinove loze i PM-a, kao i u drugim patosustavima biljka-mikrob (van Loon i sur., 2006.). Identificirali smo četiri različita gena PR-9 uključena u metabolizam ROS-a koji kodiraju peroksidaze, od kojih su dva inducirana (slika 5), ​​a druga dva su potisnuta PM-om u V. vinifera. Tri gena NADH dehidrogenaze potisnuta su u PM inokulirana V. vinifera lišća i također izrazito izražen u V. vinifera u usporedbi sa V. aestivalis (Slika 5). Tri glutationa Sgeni -transferaze (GST) također su inducirani PM (dopunska tablica S1). Diferencijalna ekspresija ovih gena povezanih s obranom ukazuje na aktivaciju obrambenih puteva čak i u kompatibilnim interakcijama između vinove loze i gljive.

Tablica I.

Reprezentativni transkripti povezani s obranom i sekundarnim metabolizmom koji su različito izraženi u jednoj od šest vremenskih točaka nakon što je V. vinifera zaražena PM-om


Opcije pristupa

Omogućite potpuni pristup časopisu 1 godinu

Sve cijene su NETO cijene.
PDV će biti dodat kasnije prilikom plaćanja.
Obračun poreza bit će dovršen tijekom plaćanja.

Nabavite vremenski ograničen ili potpuni pristup članku na ReadCube -u.

Sve cijene su NETO cijene.


Perspektive

Divergencija uravnoteženih kompleksa predstavlja problem koji tek treba u potpunosti istražiti eksperimentalno ili teoretski. Naime, ako je uravnotežen skup gena u interakciji otporan na promjene u stehiometriji, kako to pokazuju široki evolucijski dokazi, kako je moguće da se razlikuju? Jedna je mogućnost da će odabir koji djeluje na jednog člana kompleksa predstavljati sukob s članovima u interakciji i izvršiti pritisak odabira na svojstva interakcije (Birchler et al., 2007.). Primjer odabira na jednog člana kompleksa koji utječe na interakcijske partnere opisan je u slučaju smrtonosnog kompleksa specifičnog za muškarce u Drosophila (Levine et al., 2007. Rodriquez et al., 2007.). Drugi mogući način za razvoj nove ravnoteže jest ako dođe do promjena među ciljnim lokusima koje se javljaju u cis koji mijenjaju razinu izražavanja (Birchler et al., 2007.). Postoje neki dokazi za povećanje cis regulatorna divergencija s povećanjem genetske udaljenosti (Lemos et al., 2008. Wittkopp et al., 2008.). S vremenom bi se takve promjene mogle akumulirati među kritičnim ciljnim genima kontroliranim regulatornim kompleksom i omogućiti suptilne varijacije u uravnoteženim interaktorima da promijene stehiometrijske odnose. Nismo svjesni da li su traženi dokazi za takav scenarij. Nadalje, potpuno neistražen koncept je uloga mikroRNA modulacije translacije proteina koji su uključeni u uravnotežene komplekse. MikroRNA bi potencijalno mogle suptilno modulirati ekspresiju gena ili održavati ravnotežu proteina i proteina ili uzrokovati njezinu divergenciju. Zadržani duplikati tijekom diploidizacije mogu se opet ponoviti tijekom sljedećeg događaja tetraploidizacije. S sada prisutnih osam kopija gena, promjene u količini genskog proizvoda mogle bi se tolerirati, a kopija gena se može izgubiti ili razlikovati.

Jedan od budućih pravaca koji zaslužuje pozornost je eksperimentalni rad na temelju toga kako promjena stehiometrije podjedinica višemolekularnih kompleksa utječe na djelovanje kompleksa. Jedna mogućnost uključuje uređenu montažu kompleksa na takav način da se nefunkcionalni potkompleksi redovito formiraju i smanjuju količinu kompletnog kompleksa koji se može sastaviti (Veitia, 2002, 2003 Veitia et al., 2008.). Druga je mogućnost da će s različitim količinama podjedinica nastati kompleks s više podjedinica, a nepovezane podjedinice će se razgraditi (Veitia et al., 2008 ).

Drugo pitanje od interesa je kako se regulatorna ravnoteža očituje. Genetski i evolucijski dokazi ukazuju na to da su regulatorni sustavi koji djeluju u kompleksima čvrsto očuvani, dok se ciljni lokusi mogu izbrisati natrag na diploidnu razinu nakon tetraploidizacije ili se mogu redovito mijenjati u varijantama broja kopija. Međutim, učinak regulatorne ravnoteže mora se u konačnici ostvariti izražavanjem ciljnih lokusa koji izvode stanični metabolizam i razvojne procese. Dinamika regulatora i njihovih ciljnih lokusa nije istražena u kontekstu ravnoteže.

Druga tema vrijedna teorijskog istraživanja u kontekstu regulatorne ravnoteže je sudbina dupliciranih gena i njihova evolucija novih funkcija. Duplicirani geni imaju potencijal podijeliti svoje aktivnosti putem procesa koji se naziva subfunkcionalizacija. Alternativno, jedna od kopija mogla bi razviti novo svojstvo, koje se naziva neofunkcionalizacija (Lynch & Conery, 2000). Oba procesa držala bi duplicirani par u evolucijskoj lozi. Jasno je da znamo da je neofunkcionalizacija dovela do stvaranja novih regulatornih gena i gena za održavanje domaćinstva. Međutim, sada znamo iz ponovljenih događaja tetraploidizacije praćenih diploidizacijom u biljaka i Paramecij da se duplicirani geni mogu držati u lozi zbog stehiometrijskih ograničenja uključenih u molekularne komplekse. Ostale klase gena redovito se brišu natrag na diploidnu razinu i stoga se rijetko održavaju podfunkcionalizacijom ili nefunkcionalizacijom. Međutim, postoje iznimke poput gena otpornosti na bolesti koji su u stalnoj 'utrci u naoružanju' s patogenima. Ipak, važno je napomenuti da će ih održavanje dupliciranih regulatornih gena putem ravnotežnih ograničenja zadržati u evolucijskoj lozi dulje od drugih klasa gena. Ovaj bi scenarij pružio duži vremenski okvir za nastanak slučajeva neofunkcionalizacije. Također, stupanj u kojem ti čimbenici drže duple gene u lozi zaslužuje daljnje proučavanje. U biljkama i Paramecij, kako se događaji tetraploidizacije povlače u daleku prošlost, sve je manje dupliciranih parova, što upućuje na to da subfunkcionalizacija i nefunkcionalizacija, iako važni za evolucijsku novinu, nisu sveprisutni (Freeling, 2008).

Hipoteza o ravnoteži gena sugerira da će kvantitativna svojstva kontrolirati veliki broj gena koji mogu pridonijeti varijacijama. Ova je varijacija ograničena zbog međusobne ravnoteže regulatora do vrlo uskog prozora oko populacijske norme u većini uvjeta. Međutim, zbog velikog broja lokusa uključenih u bilo koju osobinu, moguće su suptilne progresivne promjene velikih ekstrema pod intenzivnom selekcijom. Suptilne regulatorne varijacije male veličine, ali prisutne na mnogim mjestima, mogu biti neutralne tijekom dugih razdoblja evolucije, pružajući mogućnost razvoju novotarije s promjenom okruženja. Dakle, hipoteza o ravnoteži gena ima potencijal objasniti naizgled kontradiktorna zapažanja da se status quo može održati eonima, ali iznimna novost može se razviti unutar nekoliko generacija.


Gledaj video: The Frajle u0026 Aleksandar Sofronijević - Dal je moguće studio sesion (Kolovoz 2022).