Informacija

Postoji li normalna koncentracija ljudskog melatonina do krivulje razine svjetlosti?

Postoji li normalna koncentracija ljudskog melatonina do krivulje razine svjetlosti?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tražim grafikon ili krivulju koja bi pokazala tipična koncentracija melatonina u krvi ili slini za ljude tijekom 24 sata. Bilo bi dobro znati i fotoperiod za istog čovjeka.

Znam da oslobađanje melatonina inhibira plavo svjetlo, koje se percipira kroz mrežnicu, pri čemu je melanopsin fotopigment koji signalizira suprahijazmičkoj jezgri da potisne oslobađanje melatonina. Zato bi bilo sjajno vidjeti podatke o melatoninu uz podatke o izloženosti svjetlosti.

Hvala vam na bilo kakvim savjetima gdje mogu pronaći takve informacije!


Ovdje ste pronašli nekoliko uzoraka: http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0024320503008142-gr2.gif ">


Crveno svjetlo noću dopušta noćni porast proizvodnje melatonina kod konja

Crveno svjetlo niskog intenziteta noću dopušta noćni porast serumskog melatonina u konja.

Slični 24-satni obrasci proizvodnje melatonina primijećeni su kod konja koji su noću držani u mraku ili crvenom svjetlu.

Crveno svjetlo noću omogućuje vidljivost i alternativa je bijelom svjetlu kako bi se izbjegao poremećaj cirkadijskog ritma kod konja.

Noćna upotreba crvenog svjetla u staji za konje može pružiti važne zdravstvene prednosti za konje.


Predmeti i materijali

Sudionici

Zdravi istraživački volonteri (n = 116) u dobi od 18 do 30 godina bili su uključeni u jedno od dva stacionarna studija (vidi dolje) u Općem kliničkom istraživačkom centru (GCRC), Brigham i Ženskoj bolnici (BWH) (Boston, MA). Tjelesno zdravlje procijenjeno je anamnezom i fizikalnim pregledom, biokemijom krvi i hematologijom te elektrokardiogramom. Poremećaji sna i cirkadijalnog ritma bili su isključivi. Mentalno zdravlje procijenjeno je intervjuom sa psihologom ili psihijatrom, a normalni vid potvrđen je oftalmološkim pregledom i/ili Ishiharinim testom na daltonizam. Najmanje 2 tjedna prije bolničkog ispitivanja, sudionici su morali držati fiksni raspored spavanja i budnosti (8 sati u snu, 16 sati u budnom stanju) po svom izboru, a usklađenost je provjeravana stalnim praćenjem aktigrafije (Actiwatch-L Minimitter, Inc. , Savijte, ILI). Kako bi se osiguralo da su se sudionici suzdržali od upotrebe lijekova, na dan prijema u GCRC proveden je opsežan toksikološki pregled. Informirani pristanak pribavljen je od svih volontera, a postupke istraživanja odobrilo je Odbor za institucionalnu reviziju u BWH i bili su u skladu s propisima HIPAA -e i Helsinškom deklaracijom.

Opći stacionarni postupci

Volonteri istraživači živjeli su pojedinačno u laboratoriju bez znakova vremena. Tijekom prva 3 d svake studije, sudionici su trebali spavati i buditi se u uobičajeno vrijeme za buđenje prije spavanja (8 sati u snu, 16 sati u budnom stanju). Ambijentalno svjetlo osiguravalo je stropno montirane 4100K fluorescentne svjetiljke (Philips Lighting, Eindhoven, Nizozemska) i prenosilo se kroz UV-stabilan filter (Lexan, General Electric Plastics, Pittsfield, MA). Osvijetljenost je mjerena radiometrom IL1400 opremljenim SEL-033/Y/W detektorom (International Light Inc., Peabody, MA). Za postavke ispod 200 luksa i ispod 3 luksa, razine osvjetljenja definirane su najvećom osvijetljenošću izmjerenom u vodoravnoj ravnini, pri čemu je detektor usmjeren izravno na stropne svjetiljke na visini od 187 cm. Za svjetlo ispod 200 luksa, osvjetljenje u vodoravnom kutu pogleda bilo je manje od 150 luksa (tj. mjereno u okomitoj ravnini), a tipično osvjetljenje očiju kretalo se od 60–130 luksa, kako je ranije objavljeno (25, 30). Za svjetlosnu postavku od približno 200 luksa, osvjetljenje je bilo podešeno tako da su sudionici u krevetu dobili približno 200 luksa osvjetljenja rožnice (28).

Drugog početnog dana svake studije, umetnuti iv kateter umetnut je u venu podlaktice kako bi se omogućilo kontinuirano prikupljanje krvne plazme svakih 30-60 minuta za analizu melatonina. U ovom istraživanju, podaci o melatoninu analizirani su samo u studiji d 2-5. Tijekom epizoda spavanja i stalnog rutinskog postupka (vidi dolje), krv se vadila izvan istraživačkog prostora kroz otvor na zidu spavaće sobe. Koncentracija melatonina određena je standardnim RIA -om u laboratorijima koji su bili slijepi za eksperimentalnu intervenciju (Pharmasan, Osceola, WI BWH GCRC Core Laboratory, Boston, MA). Koeficijenti varijacije intraatestnih i međuanaliza plazma melatonina za svaku od studija navedeni su u izvornim izvješćima (28, 30–32).

Dizajn protokola

Studija 1

Melatonin u plazmi ispitan je u 104 dobrovoljca koji su sudjelovali u istraživanju od 9 do 10 dana (31, 32). Sudionici su spavali u mraku i bili izloženi sobnoj svjetlosti (<200 luksa) sve do sredine ispitivanja d 3, nakon čega je svjetlo prigušeno na manje od 3 luksa. Sljedećeg jutra sudionici su se probudili prema stalnom rutinskom postupku koji se sastojao od budnosti koju su provodili tehničari monitori (30–50 sati), poluležećeg odmora u krevetu, konzumacije jednakih grickalica po satu i stalne izloženosti prigušenom svjetlu (& lt3 luksa) (33).

Studija 2

Dvanaest dobrovoljaca završilo je 14-d istraživački protokol (28), uključujući jednu osobu koja je dva puta završila studiju pod različitim svjetlosnim uvjetima (vidi dolje). Analizirali smo 4-d segment protokola koji je randomiziran da se pojavi bilo u studiji d 6–9, bilo u studiji d 10–13. Tijekom prva 3 dana, sudionici su spavali u mraku i bili izloženi sobnoj svjetlosti danju (& lt200 lux, n = 5 ∼200 lux, n = 8). Nakon 8 sati predviđenog sna u mraku, sudionici su prošli 40-satni stalni rutinski postupak pri sobnoj svjetlosti. Razine melatonina pri sobnoj svjetlosti tijekom uobičajenih sati spavanja uspoređene su s razinama melatonina tijekom sna prethodne noći. Kako bi se odredio postotak supresije melatonina, izračunano je područje ispod krivulje (AUC, trapezoidna metoda) za izlaganje sobnoj svjetlosti (AUCRL) i u usporedbi s AUC za ritam melatonina tijekom prethodne epizode sna u mraku (AUCD) u istim relativnim vremenima. Stoga je postotak supresije melatonina izračunat kao [1 - (AUCRL) × (AUCD) −1] × 100, s većim vrijednostima koje ukazuju na snažniju supresiju melatoninskog ritma.

Određivanje faze, trajanja i faznog kuta melatonina

Za svakog ispitanika u studiji 1, ritam melatonina tijekom stalne rutinske procedure prilagođen je troharmoničnim regresijskim modelom za procjenu amplitude. Početak melatonina prigušenog svjetla (DLMOn25%) i pomak (DLMOff25%) definirana su kao vremena u kojima je ritam melatonina prelazio graničnu vrijednost od 25% prilagođene amplitude od vrha do korita (polovica standardne amplitude). Isti prag od 25% korišten je za određivanje početka i pomaka melatonina na d 2–3, tijekom kojeg su pojedinci bili izloženi sobnoj svjetlosti ili prigušenom svjetlu okoline. Trajanje melatonina definirano je kao broj uzastopnih sati u kojima je razina melatonina prelazila prag od 25% između početka i pomaka melatonina. Fazni kut definiran je kao razlika u vremenu između početka ili pomaka melatonina vs. prije spavanja, s pozitivnim vrijednostima koje ukazuju na to da se događaj dogodio prije uobičajenog vremena za spavanje svakog sudionika. Kako bi se odredio postotak smanjenja koncentracije melatonina zbog izloženosti sobnoj svjetlosti prije spavanja, AUC je izračunat između početka melatonina i vremena za spavanje na d 3 (& lt3 lux) i uspoređen s AUC prethodnog dana (& lt200 lux) na istom relativnom vremena sata. Lokalno vrijeme spavanja i budnosti tijekom bolničkih studija raspoređeno je na temelju uobičajenih sati spavanja svakog ispitanika tijekom postupaka pregleda prije studije. Radi ilustracije, podaci su poravnani prema rasporedu mirovanja na Sl. 1 2 3 - 4 i iscrtano vs. relativno vrijeme sata. Postavili smo relativno vrijeme spavanja od 2400 do 0800 sati. Raspodjela vremena buđenja, početka melatonina i pomaka melatonina vs. lokalno vrijeme prikazano je na Dodatnoj slici 1 (objavljeno na web stranici The Endocrine Society's Journals Online web stranici na http://jcem.endojournals.org).

Do početka melatonina dolazi kasnije na sobnom svjetlu nego pri prigušenom. O: U studiji 1, sudionici su živjeli pri sobnoj svjetlosti (& lt200 lux) i spavali u mraku prva dva osnovna dana. Nakon buđenja ujutro d 3, sudionici su bili izloženi 8 h sobne svjetlosti, nakon čega je uslijedilo 8 h prigušenog svjetla (& lt3 lux) prije spavanja. Pojedinci su nakon sna podvrgnuti stalnom rutinskom postupku pri slabom svjetlu. B, Ritam melatonina prikazan je za reprezentativnog subjekta kroz tri uzastopna ciklusa (d 2–5). Kod ovog ispitanika, početak melatonina dogodio se oko 2 sata ranije na d 3 i 4 pri slabom svjetlu, u usporedbi s d 2 na sobnom svjetlu. Vrijeme početka i pomaka melatonina prikazano je strelice označene sivom bojom. Bijele i sive trake kod vrh svake plohe označavaju izlaganje sobnoj svjetlosti i prigušeno svjetlo, odnosno crne trake ukazuju na spavanje u mraku.

Do početka melatonina dolazi kasnije na sobnom svjetlu nego pri prigušenom. O: U studiji 1, sudionici su živjeli pri sobnoj svjetlosti (& lt200 lux) i spavali u mraku prva dva osnovna dana. Nakon buđenja ujutro d 3, sudionici su bili izloženi 8 h sobne svjetlosti, nakon čega je uslijedilo 8 h prigušenog svjetla (& lt3 lux) prije spavanja. Pojedinci su nakon sna podvrgnuti stalnom rutinskom postupku pri slabom svjetlu. B, Ritam melatonina prikazan je za reprezentativnog subjekta kroz tri uzastopna ciklusa (d 2–5). Kod ovog ispitanika, početak melatonina dogodio se oko 2 sata ranije na d 3 i 4 pri slabom svjetlu, u usporedbi s d 2 na sobnom svjetlu. Vrijeme početka i pomaka melatonina prikazano je strelice označene sivom bojom. Bijele i sive trake kod vrh svake plohe označavaju izlaganje sobnoj svjetlosti i prigušeno svjetlo, odnosno crne trake ukazuju na spavanje u mraku.

Izlaganje sobnoj svjetlosti prije spavanja skraćuje trajanje melatonina (MLT). A, histogrami prikazuju vrijeme početka melatonina (sive trake) i pomak (bijele trake) kod sudionika (n = 104) koji žive pri sobnoj svjetlosti vs. prigušeno svjetlo. Bijele i sive trake kod vrh za svaku plohu označite izlaganje sobnoj svjetlosti (& lt200 luksa), odnosno prigušenom svjetlu (& lt3 luksa), i crne trake ukazuju na zakazani san u mraku. B, histogrami prikazuju trajanje melatonina kod istih sudionika tijekom tri uzastopna ciklusa koji odgovaraju A. Srednje trajanje melatonina označeno je okomita linija s oznakom. Trajanje melatonina je najduže kada se početak i pomak dogode pod prigušenim svjetlom. C, vodoravna trakasta karta koja prikazuje promjenu vremena početka melatonina kod pojedinačnih sudionika s d 2 pri sobnom svjetlu do d 3 pri prigušenom svjetlu. U 99% pojedinaca početak melatonina dogodio se ranije pri prigušenom svjetlu u odnosu na sobnu svjetlost. Podaci su poredani uzlazno. D – F, Slični grafikoni prikazani su za promjene u vremenu pomaka melatonina od jutra d 3 pri sobnoj svjetlosti do d 4 pri prigušenom svjetlu (D), početka melatonina od d 3 pri prigušenom svjetlu do d 4 pri prigušenom svjetlu ( E) i melatonin pomaknut od jutra d 4–5 pri slabom svjetlu (F).

Izlaganje sobnoj svjetlosti prije spavanja skraćuje trajanje melatonina (MLT). A, histogrami prikazuju vrijeme početka melatonina (sive trake) i pomak (bijele trake) kod sudionika (n = 104) koji žive pri sobnom svjetlu vs. prigušeno svjetlo. Bijele i sive trake kod vrh za svaku plohu označite izlaganje sobnoj svjetlosti (& lt200 luksa), odnosno prigušenom svjetlu (& lt3 luksa), i crne trake ukazuju na zakazani san u mraku. B, histogrami prikazuju trajanje melatonina kod istih sudionika tijekom tri uzastopna ciklusa koji odgovaraju A. Srednje trajanje melatonina označeno je okomita linija s oznakom. Trajanje melatonina je najduže kada se početak i pomak dogode pod prigušenim svjetlom. C, vodoravna trakasta karta koja prikazuje promjenu vremena početka melatonina kod pojedinačnih sudionika s d 2 pri sobnom svjetlu do d 3 pri prigušenom svjetlu. U 99% pojedinaca početak melatonina dogodio se ranije pri prigušenom svjetlu u odnosu na sobnu svjetlost. Podaci su poredani uzlazno. D – F, Slični grafikoni prikazani su za promjene u vremenu pomaka melatonina od jutra d 3 pri sobnoj svjetlosti do d 4 pri prigušenom svjetlu (D), početka melatonina od d 3 pri prigušenom svjetlu do d 4 pri prigušenom svjetlu ( E) i melatonin pomaknut od jutra d 4–5 pri slabom svjetlu (F).

Izloženost sobnom svjetlu prije spavanja smanjuje razinu melatonina (MLT). A, Histogram koji prikazuje postotak smanjenja melatonina od početka melatonina do spavanja kada su sudionici bili izloženi sobnoj svjetlosti (& lt200 luksa) vs. prigušeno svjetlo (& lt3 lux) do predviđenog sna. AUC profila melatonina određena je pri slabom svjetlu i uspoređena s AUC prethodnog dana u isto relativno vrijeme. Srednji postotak smanjenja melatonina naznačen je okomita linija s oznakom. B, Ritam melatonina prikazan je za tri reprezentativna dobrovoljca izložena sobnoj svjetlosti (○) prije i poslije predviđenog sna u mraku (zatvoreno okomite isprekidane linije) vs. izlaganje prigušenom svjetlu (●) u isto relativno vrijeme sljedećeg dana.

Izloženost sobnom svjetlu prije spavanja smanjuje razinu melatonina (MLT). A, Histogram koji prikazuje postotak smanjenja melatonina od početka melatonina do spavanja kada su sudionici bili izloženi sobnoj svjetlosti (& lt200 lux) vs. prigušeno svjetlo (& lt3 lux) do predviđenog sna. AUC profila melatonina određena je pri slabom svjetlu i uspoređena s AUC prethodnog dana u isto relativno vrijeme. Srednji postotak smanjenja melatonina naznačen je okomita linija s oznakom. B, Ritam melatonina prikazan je za tri reprezentativna dobrovoljca izložena sobnoj svjetlosti (○) prije i poslije predviđenog sna u mraku (zatvoreno okomite isprekidane linije) vs. izlaganje prigušenom svjetlu (●) u isto relativno vrijeme sljedećeg dana.

Izlaganje sobnoj svjetlosti izaziva snažnu supresiju melatonina tijekom uobičajenih sati sna. O: Sudionici su živjeli pri sobnoj svjetlosti (& lt200 lux) i spavali u mraku 3 osnovna dana, nakon čega su podvrgnuti stalnoj rutinskoj proceduri pri sobnoj svjetlosti (& lt200 lux). Podaci su prikazani iz d 6–9 ili 10–13 14-d protokola istraživanja (vidi Predmeti i metode). B, Ritam melatonina prikazan je za pet osoba izloženih sobnoj svjetlosti (○) tijekom stalne rutine vs. tama tijekom sna (●) prethodnog dana. Postotna supresija melatonina sobnim svjetlom naznačena je na vrh svake plohe tijekom 8 sati koje odgovaraju uobičajenom snu (ograđeno okomite isprekidane linije).

Izlaganje sobnoj svjetlosti izaziva snažnu supresiju melatonina tijekom uobičajenih sati sna. O: Sudionici su živjeli pri sobnoj svjetlosti (& lt200 lux) i spavali u mraku 3 osnovna dana, nakon čega su podvrgnuti stalnoj rutinskoj proceduri pri sobnoj svjetlosti (& lt200 lux). Podaci su prikazani iz d 6–9 ili 10–13 14-d protokola istraživanja (vidi Predmeti i metode). B, Melatoninski ritam prikazan je za pet osoba izloženih sobnoj svjetlosti (○) tijekom stalne rutine vs. tama tijekom sna (●) prethodnog dana. Postotna supresija melatonina sobnim svjetlom naznačena je na vrh svake plohe za 8 sati koje odgovaraju uobičajenom snu (ograđeno okomite isprekidane linije).

Analiza podataka i statistika

Razlike unutar ispitanika u vremenu početka melatonina, pomaku, trajanju i faznom kutu uspoređene su s Friedmanovim ponovljenim mjerenjima ANOVA na rangu (SigmaPlot 11 Systat Software, Inc., San Jose, CA). Odlučili smo se koristiti neparametarskom statistikom jer raspodjela melatoninskih nalaza i pomaka nije uvijek prošla Kolmogorov-Smirnov test za normalnost (P & lt 0,05). U svakoj usporedbi, ishod melatonina (početak, pomak, trajanje ili fazni kut) bila je ovisna varijabla, a ambijentalno osvjetljenje, koje je variralo tijekom tri uzastopna dana, bio je ponovljeni faktor (tj. terapijska skupina). Za one usporedbe u kojima je razlika u srednjim vrijednostima među tretiranim skupinama bila veća od one koja se slučajno očekivala (P & lt 0,05), sve parne višestruke usporedbe ispitane su na značajnost pomoću Tukeyjeve metode (α = 0,05). Razlike u AUC unutar ispitanika za razinu melatonina pri prigušenom svjetlu (& lt3 luksa) vs. sobna svjetlost (& lt200 lux) uspoređena je pomoću Wilcoxonovog ranga testa. Srednje vrijednosti ishoda melatonina navedene su u tekstu s interkvartilnim rasponom (IQR), 25. i 75. percentil prikazan je u tablici 1.

Melatonin reagira na sobnu svjetlost vs. prigušeno svjetlo u studiji 1 (n = 104)

. Medijan (25%, 75%).
Svjetlo (& lt200 lux), d 2-3. Dim (& lt3 lux), d 3-4. Dim (& lt3 lux), d 4-5.
Početak MLT -a (h min) 23 39 (22 18, 00 55) 21 54 (20 58, 23 14) a22 09 (21 13, 23 21) a, b
MLT pomak (h min) 08 16 (07 20, 09 34) 08 23 (07 12, 09 22) 08 26 (07 17, 09 30) b
Trajanje MLT -a (h) 8.75 (8.25, 9.42) 10.28 (9.68, 10.85) a10.13 (9.68, 10.60) a
Fazni kut MLT početak (h) 0.38 (−0.32, 1.22) 1.95 (1.37, 2.63) a1.68 (1.07, 2.45) a, b
MFT pomak faznog kuta (h) −8.52 (−8.92, −7.55) −8.33 (−8.87, −7.50) −8.38 (−8.87, −7.77) b
. Medijan (25%, 75%).
Svjetlo (& lt200 lux), d 2-3. Dim (& lt3 lux), d 3-4. Dim (& lt3 lux), d 4-5.
Početak MLT -a (h min) 23 39 (22 18, 00 55) 21 54 (20 58, 23 14) a22 09 (21 13, 23 21) a, b
MLT pomak (h min) 08 16 (07 20, 09 34) 08 23 (07 12, 09 22) 08 26 (07 17, 09 30) b
Trajanje MLT -a (h) 8.75 (8.25, 9.42) 10.28 (9.68, 10.85) a10.13 (9.68, 10.60) a
Početak faznog kuta MLT (h) 0.38 (−0.32, 1.22) 1.95 (1.37, 2.63) a1.68 (1.07, 2.45) a, b
MFT pomak faznog kuta (h) −8.52 (−8.92, −7.55) −8.33 (−8.87, −7.50) −8.38 (−8.87, −7.77) b

Rezultati melatonina (MLT) prijavljeni su za sudionike tijekom tri uzastopna dana. Pojedinci su živjeli pri sobnoj svjetlosti (& lt200 luksa) i spavali u mraku do sredine d 3 (stupac 2). U sljedeća 24 sata sudionici su živjeli pri slabom svjetlu (vs. predviđeno vrijeme za spavanje. Pozitivni fazni kut ukazuje na to da se događaj dogodio prije zakazanog sna, dok negativne vrijednosti ukazuju na to da se događaj dogodio nakon spavanja.

Značajne razlike za usporedbe s prvim ciklusom melatonina (stupac 2 d 2-3)

Značajne razlike za usporedbe s drugim ciklusom melatonina (stupac 3 d 3-4).

Melatonin reagira na sobnu svjetlost vs. prigušeno svjetlo u studiji 1 (n = 104)

. Medijan (25%, 75%).
Svjetlo (& lt200 lux), d 2-3. Dim (& lt3 lux), d 3-4. Dim (& lt3 lux), d 4-5.
Početak MLT -a (h min) 23 39 (22 18, 00 55) 21 54 (20 58, 23 14) a22 09 (21 13, 23 21) a, b
MLT pomak (h min) 08 16 (07 20, 09 34) 08 23 (07 12, 09 22) 08 26 (07 17, 09 30) b
Trajanje MLT -a (h) 8.75 (8.25, 9.42) 10.28 (9.68, 10.85) a10.13 (9.68, 10.60) a
Fazni kut MLT početak (h) 0.38 (−0.32, 1.22) 1.95 (1.37, 2.63) a1.68 (1.07, 2.45) a, b
MLT pomak faznog kuta (h) −8.52 (−8.92, −7.55) −8.33 (−8.87, −7.50) −8.38 (−8.87, −7.77) b
. Medijan (25%, 75%).
Svjetlo (& lt200 lux), d 2-3. Dim (& lt3 lux), d 3-4. Dim (& lt3 lux), d 4-5.
Početak MLT -a (h min) 23 39 (22 18, 00 55) 21 54 (20 58, 23 14) a22 09 (21 13, 23 21) a, b
MLT pomak (h min) 08 16 (07 20, 09 34) 08 23 (07 12, 09 22) 08 26 (07 17, 09 30) b
Trajanje MLT -a (h) 8.75 (8.25, 9.42) 10.28 (9.68, 10.85) a10.13 (9.68, 10.60) a
Fazni kut MLT početak (h) 0.38 (−0.32, 1.22) 1.95 (1.37, 2.63) a1.68 (1.07, 2.45) a, b
MLT pomak faznog kuta (h) −8.52 (−8.92, −7.55) −8.33 (−8.87, −7.50) −8.38 (−8.87, −7.77) b

Rezultati melatonina (MLT) prijavljeni su za sudionike tijekom tri uzastopna dana. Pojedinci su živjeli pri sobnoj svjetlosti (& lt200 luksa) i spavali u mraku do sredine d 3 (stupac 2). U sljedeća 24 sata sudionici su živjeli pri slabom svjetlu (vs. predviđeno vrijeme za spavanje. Pozitivni fazni kut ukazuje na to da se događaj dogodio prije zakazanog sna, dok negativne vrijednosti ukazuju na to da se događaj dogodio nakon spavanja.

Značajne razlike za usporedbe s prvim ciklusom melatonina (stupac 2 d 2-3)

Značajne razlike za usporedbe s drugim ciklusom melatonina (stupac 3 d 3-4).


Metode

Uzgoj životinja i eksperimentalni dizajn

Odrasla osoba N. vectensis (duljine između 2 i 5 cm) držane su u 12-satnom: 12-satnom ciklusu svjetlo-mrak (svjetla uključena u 7:00 h (standardno vrijeme na Havajima) Zeitgeber Time ZT = 0 svjetla isključeno u 19:00 h Zeitgeberovo vrijeme ZT = 12 - pod svjetlima punog spektra, (žarulja Corallife 50/50, približno 3.600 luksa), u staklenim zdjelama s 13 promila (‰) filtrirane lokalne morske vode (razrijeđene destiliranom vodom, naziva se '1/3X morske vode ') u inkubatoru s kontroliranom temperaturom (17 ° C). Voda se mijenjala svaki dan (ZT = 0), a životinje su se hranile dvaput tjedno sa svježe izleženim račićima. Druga skupina odraslih jedinki držana je u stalnom mraku 20 dana pod istim uvjetima, pri čemu se promjene vode događaju i pri ZT = 0. Za drugi pokus, za mjerenje disipacije transkripcijskih oscilacija kod životinja uklonjenih iz ciklusa svjetla, grupe životinja držane su u stalnom mraku 24 sata, 48 sati i 96 sati i inače pod istim uvjetima.

Za tretmane melatoninom, odrasle životinje su držane u konstantnoj tami 5 dana, a zatim izložene 0,1 μM melatonina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) sljedećih 15 uzastopnih dana u stalnom mraku. Egzogeni dodatak melatonina primijenjen je u vrijeme prijelaza u subjektivnu noć (ZT = 12), što odgovara vremenu najveće proizvodnje melatonina (vidi rezultate). Nakon 12 sati inkubacije, životinje su isprane u svježoj 1/3X morskoj vodi i stavljene u nove posude za ostatak pokusa.

Kako bi se odredila vremenska proizvodnja melatonina u odraslih, embrija (48-satna post-oplodnja) i maloljetnika (1-tjedna i 2-tjedna post-oplodnja), životinje su pojedinačno prikupljene nakon odgovarajućeg liječenja svaka 3 sata i stavljene u 1,5 ml epruvete za mikrocentrifugu i zamrznuti tekućim dušikom. Zametci i mladunci također su držani iz stadija jaja pod istim uvjetima kao i odrasli u 12-satnom ciklusu svjetlo-mrak. Jaja su oplođena u ZT = 6. Pojedinci za ekstrakciju RNA pojedinačno su stavljeni u epruvetu od 1,5 ml s TriPure reagensom (Roche Inc, SAD), zatim zamrznuti.

In situ hibridizacije

In situ hibridizacije provedene su kako je prethodno opisano [40]. Zametci su prikupljeni u određeno vrijeme nakon oplodnje (24, 48, 96, 144 i 168 sati - polipi nisu hranjeni tijekom faza). Jaja su oplođena u ZT = 6. Skupljanje životinja također je bilo na ZT = 6, što se dogodilo 24, 48, 96, 144 ili 168 sati nakon oplodnje i odgovaralo razvojnim fazama - blastula, kasna blastula, gastrula, planula i kasna planula, respektivno. Sve faze su fiksirane u svježem ledeno hladnom 3,7% formaldehidu s 0,2% glutaraldehida u 1/3X morskoj vodi 60 sekundi, a zatim su fiksirane u 3,7% formaldehidu u 1/3X morskoj vodi na 4 ° C tijekom 1 sata. Nepomični embriji isprani su pet puta u PBS puferu plus 0,1% Tween 20 (PTw) i jednom u deioniziranoj vodi, te prebačeni u 100% metanol za skladištenje na -20 ° C. Rani zametci uklonjeni su iz mliječa iz mase jaja tretiranjem svježe napravljenim 2% cisteinom u 1/3X morskoj vodi (pH 7,4 do 7,6) tijekom 10 minuta. Planula i kasna planula su opuštene u 7% MgCl2 u 1/3X morskoj vodi 10 minuta prije fiksacije. In situ hibridizacija pomoću 1 do 2 kb riboproba označenih digoksigeninom za Sat, Pauza, i Kriptokromi provedene su kako bi se odredila prostorna i vremenska raspodjela transkripata u svakoj fazi. Koncentracija sonde bila je u rasponu od 0,5 do 1,0 ng ml -1, a hibridizacije su provedene na 70 ° C 40 sati u 50% formamidu. Otkrivanje sonde postignuto je inkubacijom s antidigoksigenin antitijelom konjugiranim na alkalnu fosfatazu (Roche, Inc). Nakon toga, prisutnost alkalne fosfataze detektirana je kolorimetrijskom reakcijom detekcije pomoću supstrata NBT-BCIP. Uzorci su fotografirani na Axioskopu II sa Zeiss Zxiocam HRc.

Analize melatonina

Utvrđene su razine melatonina (nanograma) N. vectensis (odrasli i embriji) modificiranom i visoko osjetljivom enzimski imunosorbentnom metodom (ELISA) (IBL International, Hamburg, Njemačka). Melatonin je ekstrahiran iz tkiva s 0,6 ml 0,6% perklorne kiseline. Za normalizaciju ispitivanja, 2 μl svakog uzorka korišteno je za mjerenje proteina. Količina ukupnog proteina (u miligramima) određena je spektrofotometrijski pri 280 nm s NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Inc.). Uzorci su zatim propušteni kroz C18 kolonu sa obrnutom fazom, ekstrahirani metanolom, upareni do suhog i rekonstituirani s vodom. Svaki uzorak je dodan u mikroploču dobro obloženu anti-melatoninskim antitijelom koza-zec. Nepoznata količina antigena prisutna u uzorku i fiksna količina enzima obilježenog antigena natjecali su se za mjesta vezanja antitijela prekrivenih jažicama. Nakon dva sata inkubacije, jažice su isprane kako bi se zaustavila reakcija natjecanja. Dodan je supstratni p-nitrofenil fosfat (PNPP) i koncentracija antigena je određena kao obrnuti udio optičke gustoće izmjerene fotometrom. Za izradu standardne krivulje prema kojoj su izračunati nepoznati uzorci korišteni su standardi melatonina. Specifičnost metode je blizu 100% gdje koncentracije melatonina prelaze 3 pg ml-1, granicu osjetljivosti za ovaj test. (Priručnik za komplet IBL ELISA). Prethodno ispitivanje dodaje poznate koncentracije melatonina u N. vectensis uzorci su pokazali da je oporavak od našeg izolacijskog protokola bio približno 85% (podaci nisu prikazani).

Za dodatnu provjeru, prisutnost bona fide melatonin je potvrđen tekućinskom kromatografijom visokih performansi (HPLC) s elektrokemijskom detekcijom (Chromeleon ™ 7.1, Dionex System, Sunnyvale, CA, SAD). Melatonin je odvojen na koloni Acclaim C18 (2,2 μM 2,1 × 100 mm, Dionex System, Sunnyvale, CA, SAD). Kromatografski sustav je bio izokratski upravljan (tj. Sustav postavljen da ne mijenja sastav otopine tijekom rada) sa sljedećom mobilnom fazom: 0,1 M natrijevog acetata, 0,1 M limunske kiseline, 0,15 mM EDTA, 32% metanola, pH 3,7, pri protoku od 0,120 mlmin -1. Potencijal elektrokemijskog detektora podešen je na +750 mV. Vrijeme elucije melatonina bilo je približno 10 minuta. Svaki uzorak tkiva je ultrazvučno obrađen (Microson XL 2005, Heat System Inc., Farmingdale, NY, USA) u otopini 0,1 M perklorne kiseline (200 μl) koja sadrži 0,02% EDTA i 0,02% natrijevog bisulfata. Nakon centrifugiranja (2 min, 13.000 g, Eppendorf 5415C Centrifuge, Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY, USA), 40 μl supernatanta je ubrizgano u kromatografski sustav s automatskim injektorom. Osnovna otopina melatonina pripremljena je u 0,1 M HCL s 0,02% EDTA i 0,02% natrijevim metabisulfitom, a zatim su razrjeđenja sa standardnom krivuljom (0,145 do 4,64 ng 20 μl -1) pripremljena s klorovodičnom kiselinom neposredno prije izvođenja ispitivanja. Slepi testovi koji ne sadrže melatonin korišteni su kao negativne kontrole.

Analize serotonina

Sadržaj serotonina (5HT) kvantificiran je pomoću osjetljive enzimske imunološke metode (IBL International, Hamburg, Njemačka). Uzorci embrija (približno 60 embrija po uzorku) centrifugirani su (3.000 × g 2 minute) i uklonjena je morska voda. Uzorci su rekonstituirani u 120 μl pufera za ispitivanje u kompletu. Za normalizaciju ispitivanja, 2 μl svakog uzorka upotrijebljeno je za mjerenje proteina. Ukratko, test je izveden na sljedeći način: 20 μl uzoraka i standardna razrjeđenja 5HT primijenjena su na mikrotitarske ploče sa 96 jažica prethodno obložene kozjim protutijelom na zečeve, nakon čega slijedi 50 μl 5HT obilježenog biotinom i 50 μl zečjeg antitijela protiv 5HT. Nakon inkubacije preko noći na 4 ° C i ispiranja puferom za ispiranje, dodano je 150 μl svježe pripremljenog konjugiranog enzima. Uzorci iz razvojnih faza, standarda, pozitivnih i negativnih kontrola inkubirani su 1 sat na sobnoj temperaturi uz lagano miješanje, ponovno isprani, zatim je dodano 200 μl supstrata p-nitrofenilfosfata, a enzimska je reakcija prekinuta nakon 60 minuta dodavanjem 50 μl stop-otopine p-nitrofenilfosfata. Apsorpcija je mjerena pri 405 nm u spektrofotometru i koncentracija 5HT je izračunata iz referentne krivulje. Prethodno ispitivanje dodaje poznate koncentracije serotonina u N. vectensis uzorci su nam pokazali da je oporavak približno 90% (podaci nisu prikazani).

Ekstrakcija ukupne RNA, reakcija reverzne transkripcije i PCR

Ukupna RNA ekstrahirana je iz uzoraka pomoću TriPure reagensa (Roche Inc, SAD) prema specifikacijama proizvođača. Ukratko, odrasle životinje/embriji lizirani su u 0,5 ml TriPure reagensa i inkubirani 5 minuta na sobnoj temperaturi. Dvjesto μl 1-brom-3-kloropropana (BCP) dodano je u epruvete i centrifugirano na 12 000 x g 15 minuta. Vodena faza je prenesena u svježu epruvetu, obrađena s DNAzom (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY, USA), a ukupna RNA je granulirana taloženjem s izopropilnim alkoholom i centrifugiranjem (12.000 × g tijekom 10 minuta). RNA pelet je ispran etanolom (75%) i granuliran pri 7.500 × g kroz 5 min i osušen na zraku pri sobnoj temperaturi. RNA kuglice rekonstituirane su u vodi bez RNaze. RNA je kvantificirana spektrofotometrijski na 260 nm s omjerima 260/280 između 1,8 i 2,0. Kvaliteta RNA također je provjerena elektroforezom od 1,4% agaroznog gela obojenog s 5 μg ml -1 etidij bromida. Komplementarna DNA (cDNA) sintetizirana je s Advantage RT-for-PCR Kit protokolom (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, SAD) prema uputama dobavljača. cDNA je pohranjena u vodi na -20 ° C.

Primeri za kvantitativni PCR dizajnirani su za gene od interesa za amplifikaciju fragmenata gena duljine 75 do 150 bp [vidi Dodatnu datoteku 1] pomoću MacVector -a (MacVector, Inc, Sjeverna Karolina, SAD). Proučeni geni uključuju pretpostavljene gene cirkadijskog sata koji su prethodno izvijestili Reitzel i sur. [35], kao i identificirani geni koji su vjerojatno uključeni u put sinteze melatonina [39]. Ribosomalni protein P0 [XM_001626244.1] korišten je kao gen za normalizaciju u svim pokusima. Prethodni qPCR testovi pokazali su da ovaj gen nema varijacije u transkripciji, bilo između različitih vremenskih točaka unutar tretmana ili između različitih tretmana. Korišteni parametri ciklusa bili su 10 sekundi pri 95 ° C, 20 sekundi pri specifičnoj temperaturi žarenja za svaki temeljni premaz [vidi Dodatnu datoteku 1] i 20 sekundi pri 72 ° C tijekom 45 ciklusa. qPCR je proveden na LightCycler ™ 480 PCR sustavu u stvarnom vremenu (Roche, Inc.) koristeći SYBR Green I Master mix (Roche, Inc.).

Analize aktivnosti enzima

Aktivnost triptofan hidroksilaze (TPH) kvantificirana je kako je prethodno opisano [41]. Ukratko, svaki uzorak tkiva je ultrazvučno obrađen u puferu natrijevog fosfata (2 mM, pH 7, 100 μL), a u svaki uzorak dodana je sljedeća smjesa: HEPES (50 mM, pH 7), katalaza (100 μg ml -1), triptofan (50 μM), ditiotreitol (5 mM), Fe (NH4) 2 (TAKO4) 2 (10 μM), 6 -MPH4 (500 μM) i 1 μL [3 H] triptofana (1 mCi ml -1 -prethodno osušeno pod dušikom). Materijal je inkubiran na 37 ° C 10 minuta. Dodana je otopina aktivnog ugljena (7,5% u 1 M HCl) za prekid reakcije. Dvjesto μL supernatanta preneseno je u scintilacijske bočice, a radioaktivnost je određena Beckmanovim LS6500 β brojačem (Beckman Coulter Inc., CA, SAD). Pozitivne (pinealne žlijezde štakora) i negativne (voda) kontrole uključene su u svaki test.

Aktivnost hidroksiindol-O-metiltransferaze (HIOMT) ispitivana je kako je prethodno opisano [22]. Uzorci su ultrazvučno obrađeni u fosfatnom puferu (0,05 M, pH 7,9, 50 μL). Zatim je dodano sto pedeset μL otopine koja sadrži 14 C-S-adenozil-L-metionin (specifična aktivnost 43,8 mCi-Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SAD) i N-acetilserotonin (1 mM). Homogenati su inkubirani 30 minuta na 37 ° C. Reakcija je završena dodavanjem 200 μL pufera natrijevog borata (12,5 mM, pH 10) i 1 ml pufera zasićenog kloroforma. Epruvete su centrifugirane na 13 000 x g 5 minuta na 4 ° C. 14 [C] melatoninski produkt ekstrahiran je u 800 μL kloroforma, sušen na zraku, a radioaktivnost je određena Beckmanovim LS6500 β brojačem (Beckman Coulter Inc., CA, SAD). U svaki test uključeni su pozitivni (pinealne žlijezde štakora) i negativni (voda). Za normalizaciju testova TPH i HIOMT, 2 μl svakog uzorka korišteno je za kvantificiranje koncentracije proteina u TPH i u pokusima HIOMT. Rezultati su prikazani kao omjer aktivnosti po miligramu proteina.

Statistička analiza

Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost četiri nezavisne replike ± SEM. Sadržaj melatonina i serotonina izražen je kao ng mg-1 proteina. Statističke analize (GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SAD) provedene su pomoću ANOVA (jednosmjerne ili dvosmjerne, prema potrebi), nakon čega je uslijedio Bonferronijev post-hoc test.

Jednosmjerna ANOVA korištena je za procjenu utjecaja varijable "doba dana" na svaki vremenski niz. S obzirom na sveukupno značajnu jednosmjernu ANOVA-u, metoda cosinor korištena je za procjenu prisutnosti dnevnog 24-satnog ritma. Teoretsko prilagođavanje kosinusne krivulje primijenjeno je u svakom vremenskom nizu pomoću izračuna najmanje kvadrata. Krivulja koja najbolje pristaje za svaki dan određena je F-statistikom. Testirana nulta hipoteza bila je nulta amplituda, odnosno bez ritmičnosti na 24-satnoj frekvenciji. Za svaki vremenski niz izračunana su tri parametra prilagođene krivulje: akrofaza (vrijeme najveće vrijednosti prilagođene krivulje), mezor (vrijednost srednje razine prilagođene krivulje) i amplituda (udaljenost između mezora i maksimalne ili minimalna vrijednost prilagođene krivulje). Ti su ritmički parametri uspoređeni između skupina pomoću Studentovih t-test [42]. Sve statističke analize smatrane su značajnima za P ≤0.05.


Rezultati

Sudionici

Dva su sudionika isključena tijekom prve stalne rutine zbog nepoštivanja protokola, a treći ispitanik je nenamjerno dobio polikromatsku izloženost svjetlu zbog tehničkog kvara na monokromatskom izvoru svjetla, a također je isključen iz ove analize. Od preostalih 18 sudionika (9 žena, prosječna dob ± SD: 23,72 ± 3,3 godine), dvoje sudionika nije imalo dovoljno podataka tijekom jednog od CR -a za točnu faznu procjenu pomoću melatonina (29P9V 26T2V9T2) ili temperature (29K6V , 26T2V9T2), a jedan sudionik nije imao dovoljno podataka za izračun supresije melatonina (26T2V9T2).

Resetiranje faze

Izlaganje monokromatskom svjetlosnom impulsu od 6,5 sati rezultiralo je konvencionalnim PRC -om tipa 1 (slika 2). Primjenom dvoharmoničnog uklapanja, PRC je pokazao amplitudu od vrha do korita od 3,8 h s maksimalnim uklopljenim pomakom od 1,3 h i maksimalnim uklopljenim kašnjenjem od 𢄢,6 h (prilagođeno R 2 = 0,88) (slika 2B ). Intervali pouzdanosti od 95% pokazuju da su se fazni pomaci značajno razlikovali od nule u svim cirkadijskim fazama bez dokaza o mrtvoj zoni (slika 2C ). Postojala je značajna korelacija između faznih pomaka u DLMO -u i CBT -umin (N = 15 Pearson R = 0.69 P = 0,004) (SPSS, verzija 15 IBM, Armonk, NY, SAD).

Na slici 3, 480 nm PRC je iscrtan zajedno s prethodno objavljenim PRC -om za bijelo svjetlo, koji je koristio ekspoziciju �.000 luksa u sličnom eksperimentalnom protokolu (4100K, Philips Lighting, Nizozemska) (Khalsa et al. 2003.). Bijelo svjetlo PRC pokazuje magnitudu od vrha do korita od 5,5 h s maksimalnim pomacima i kašnjenjima od 2,0 h odnosno 𢄣,4 h (prilagođeno R 2 = 0,89) (slika 3B ). Slika 3C prikazuje intervale pouzdanosti od 95% za monokromatske 480 nm i polikromatske bijele svjetlosti od 10 000 luksa. Dva PRC -a se značajno ne razlikuju, osim malog prozora oko područja maksimalnog kašnjenja (tj. Početka svjetla 𢏂 h prije DLMO -a) i maksimalnog područja napredovanja (tj. Početka svjetla između 3 i 6 h nakon DLMO -a).

Krivulja faznog odziva do 6,5 h 480 nm svjetla i 6,7 h bijelog svjetla od 10 000 luksa za fazne pomake izračunate tijekom tri cirkadijalna ciklusa pomoću DLMO procjene iz CR1. Sirovi podaci (A) i dvoharmonična uklapanja (B) za monokromatsko 480 nm svjetlo (crni kvadrati, crna linija) i 6,7 h polikromatsko bijelo svjetlo (otvoreni sivi krugovi, siva linija) prikazani su PRC -i. Intervali pouzdanosti od 95% generirani iz odgovarajućih dvoharmoničnih funkcija (jednobojna plava, isprekidana crna linija polikromatska bijela, isprekidana siva linija, C) pokazuju da se dva PRC -a ne razlikuju značajno, osim malog prozora oko područja maksimalnog kašnjenja i unaprijed. Fazni pomaci izračunati su pomoću plazme (otvoreni simboli) ili slinovnice (ispunjeni simboli) melatonina za 6,7 ​​h polikromatski bijeli PRC. Konvencija o iscrtavanju opisana je u legendi za sliku 2.

Svojstven svakom odzivu pomaka faze doprinos je 𠆍rift ’ zbog unutarnjeg razdoblja endogenog cirkadijalnog pacemakera, koji je jednak pomaku od 𢄠.54 h tijekom tri ciklusa (isprekidana vodoravna linija, slike 2 i ​ i3) 3) na temelju objavljenih prosjeka (24,18 h Czeisler et al. 1999.). Kako bi se smanjila varijacija zbog vlastitog cirkadijskog razdoblja, dva PRC -a također se iscrtavaju na temelju faznog pomaka izračunatog u dva cirkadijalna ciklusa (Lockley et al. 2003.). Intervali pouzdanosti od 95% dva PRC -a preklapaju se u svim cirkadijskim fazama, pa se stoga PRC ne mogu razlikovati (slika 4).

Krivulja faznog odziva do 6,5 h svjetlosti 480 nm i 6,7 h bijele svjetlosti od 10 000 luksa za fazne pomake izračunate tijekom dva cirkadijalna ciklusa. Sirovi podaci (A) i dvoharmonična uklapanja (B) za monokromatsko plavo svjetlo (crni kvadrati) i 6,7 h polikromatsko bijelo svjetlo (otvoreni sivi krugovi) prikazani su PRC -i. Oba PRC-a opremljena su dvoharmoničnom funkcijom (jednobojna plava, kontinuirana crna linija polikromatska bijela, kontinuirana siva linija, B).Zbog nedostatka podataka za procjenu DLMO -a, jedan je subjekt uklonjen iz 6.7 h PRC -a za ovu analizu. Intervali pouzdanosti od 95% generirani iz ugrađenih funkcija s dva harmonika (jednobojna plava, isprekidana crna linija polikromatska bijela, isprekidana siva linija, C) pokazuju da se dva NRK -a ne razlikuju značajno. Konvencija o iscrtavanju opisana je u legendi za sliku 2.

Suzbijanje melatonina

Deset sudionika bilo je izloženo svjetlu tijekom biološkog dana, a sedam tijekom biološke noći. Slika 5A ilustrira pojedinačni i prosječni postotak supresije melatonina tijekom 6,5 sati plavog svjetla koje se javlja tijekom biološke noći (N = 10) uređeno prema vremenu početka izloženosti svjetlosti. Kad je izloženost svjetlu započela rano u biološkoj noći, blizu DLMO -a, najveća količina supresije melatonina postignuta je pri čemu je supresija ostala prilično dosljedna tijekom cijele noći (slika 5A, a i d). Kako je početak izloženosti svjetlosti napredovao prema ranim jutarnjim satima, količina supresije melatonina se smanjuje jer se izloženost svjetlosti javlja samo na zadnjem dijelu prozora za proizvodnju melatonina (slika 5Bb).

A prikazuje pojedinačni i prosječni postotak supresije melatonina tijekom 6,5 sati plavog svjetla poredanog prema vremenu izloženosti svjetlu u odnosu na vrijeme CR1 DLMO (brojevi u gornjem retku predstavljaju vrijeme LE, donji brojevi predstavljaju vrijeme CR1 DLMO u decimalnim satima). Supresija melatonina izražava se kao površina ispod krivulje (AUC) tijekom izloženosti svjetlu izražena kao razlika od AUC tijekom CR1 za odgovarajuća vremena sata za pojedince (otvorene trake N = 10) i kao skupina (ispunjena traka: srednja vrijednost ± SD). Okomita linija označava izloženost svjetlosti koja počinje nakon ponoći. B prikazuje četiri pojedinačna profila melatonina udaljena približno 90 ° (𢏆 h) tijekom CR (ispunjeni simboli) i svjetlosne izloženosti (otvoreni simboli). Otvoreni okvir označava vrijeme izloženosti svjetlosti od 6,5 sati. U B, a, b i d odgovaraju istom pojedincu navedenom u A.


MATERIJALI I METODE

Studirati dizajn. Spektar djelovanja određen je usporedbom broja fotona potrebnih za isti biološki učinak na različitim valnim duljinama (Lipson, 1994. Coohill, 1999.). Ovdje opisani spektar djelovanja suzbijanja melatonina formiran je iz krivulja fluence -response na osam valnih duljina između 440 i 600 nm. Za svaku krivulju fluence-odziva korišten je dizajn unutar ispitanika. Za svaku proučenu valnu duljinu, skup od osam dobrovoljaca bio je izložen najmanje osam različitih svjetlosnih zračenja u zasebnim noćima s najmanje 6 d između ekspozicija. Po završetku tog rada utvrđeno je da je potrebna sonda osjetljivosti na monokromatsko svjetlo ispod 440 nm. Slijedom toga, skupina od osam ispitanika bila je izložena jednoj noći bez izlaganja svjetlosti i jednoj noći izlaganja jednom zračenju svjetlosti od 420 nm.

Predmeti. Volonteri koji su bili uključeni u rad u smjenama, planirali su putovanja mlaznim avionom na daljinu prije ili tijekom razdoblja istraživanja ili su imali nepravilan raspored spavanja isključeni su iz ove studije. Stopa napuštanja ispitanika bila je 7,9%. Etnička raspodjela 72 ispitanika koji su završili ovo istraživanje uključivalo je 55 bijelaca, 9 azijata, 4 afroamerikanca, 3 latinoamerikanca i 1 osobu nepoznate nacionalnosti. Ispitanici koji su imali relativno stabilan dnevni režim spavanja, položili su fizički ispit za opće i očno zdravlje i potpisali odobreni dokument o odobrenju Institucionalnog odbora za pregled prihvaćeni su u ovu studiju. Ukupno 37 žena i 35 muškaraca u dobi od 18 do 30 godina (prosječna ± SEM dob, 24,5 ± 0,3) završilo je istraživanje. Samoprijavljeno prosječno ± SEM tjedno vrijeme buđenja među ispitanicima bilo je 7:06 ujutro. ± 18 min. Svi ispitanici bili su normalni na ispitivanjima boje za vid Ishihara i Farnsworth Munsell D-100 (srednja vrijednost ± SEM Farnsworth Munsell rezultat, 51,4 ± 4,3).

Protokol izlaganja svjetlosti. Svaki je eksperiment započeo u ponoć kada su ispitanici ušli u slabo osvijetljenu prostoriju (10 luksa ili manje). Jedna kap 0,5% ciklopentolatne HCl stavljena je u svako oko kako bi se proširile zjenice ispitanika, a preko očiju su im stavljeni povezi preko očiju. Ispitanici su 120 minuta sjedili uspravno i slušali glazbu u slušalicama ili se bavili tihim razgovorom. Dok su još uvijek imali povez preko očiju i nešto prije 2:00 ujutro, venepunkcijom antekubitalne vene uzet je uzorak krvi od 10 ml. Subjektima su zatim uklonjeni povezi s očiju, a subjekti su bili izloženi monokromatskom svjetlosnom podražaju od 2:00 do 3:30 ujutro. Tijekom izlaganja svjetlu, glava svakog ispitanika počivala je u oftalmološkom držaču glave okrenutom prema ganzfeldovom aparatu koji je pružao konkavnu reflektirajuću površinu bez uzorka koja obuhvaća cijelo vidno polje svakog subjekta (Sl.1). Tijekom ove izloženosti od 90 minuta, ispitanici su mirno sjedili, držali oči otvorene i gledali u fiksnu ciljnu točku u središtu ganzfeld kupole. Usklađenost subjekata radi držanja očiju otvorenom i veličina zjenica ispitanika nadzirana je minijaturnom video kamerom unutar ganzfeld kupole. Ako su ispitanici počeli zatvarati oči tijekom razdoblja izlaganja, eksperimentatori su ih podsjetili da drže oči potpuno otvorene. U 3:30 ujutro venepunkcijom je uzet drugi uzorak krvi od 10 ml, a ispitanicima je tada dopušteno napustiti laboratorij. Za ovaj spektar djelovanja proučavano je osam valnih duljina (440, 460, 480, 505, 530, 555, 575 i 600 nm). Na tim valnim duljinama svaki je subjekt bio izložen potpunom mraku od 2:00 do 3:30 ujutro. u njihovoj kontrolnoj noći i na skup zračenja koja pokrivaju 4 log log jedinice gustoće fotona od 10 10 do 10 14 fotona/cm 2 u noćima izlaganja. Za ispitivanje osjetljivosti na monokromatsko svjetlo na 420 nm, grupa od osam subjekata bila je izložena jednoj noći bez izlaganja svjetlosti i jednoj noći izlaganju svjetlosti 420 nm pri 31,8 μW/cm 2 (5,58 × 10 13 fotona/ cm 2).

Ovaj dijagram ilustrira eksperimentalni elektronički, optički i ganzfeldov niz ekspozicije kupole. Ovaj aparat pruža jednoličan poticaj bez uzorka koji obuhvaća cijelo vidno polje subjekta. Radi jasnoće, glava subjekta je prikazana blago povučena iz otvora ganzfeld kupole. Tijekom svih izloženosti svjetlu, koštane orbite subjekata potpuno su zatvorene u zidovima kupole, pružajući potpunu ekspoziciju njihovih vidnih polja.

Proizvodnja i mjerenje svjetlosti. Kao što je prikazano na slici 1, eksperimentalni svjetlosni podražaji proizvedeni su ksenonskom lučnom svjetiljkom od 450 ili 1200 W (Photon Technology Inc., Princeton, NJ). Svaka je svjetiljka bila zatvorena u svjetlootpornu komoru i hlađena cirkulacijom vode. Izlazni snop svjetlosti iz svakog izvora usmjeravao je parabolični reflektor, a za žarulje od 1200 W višak topline u svjetlosnom snopu smanjen je filterom za vodu. Monokromatske valne duljine (polu-vršne širine 10-14,5 nm) proizvedene su monokromatorom s rešetkom, a zračenje svjetlosti kontrolirano je ručnom membranom. Dobiveni svjetlosni snop usmjeren je u gornje područje ganzfeldovog aparata i ravnomjerno se reflektirao od stijenki ganzfeldove kupole u oči dobrovoljaca. Cijela reflektirajuća površina kupole bila je presvučena bijelim materijalom (Spectralite) s 95-99% učinkovitošću refleksije u rasponu 400-760 nm. Rutinsko mjerenje svjetlosne iradijacije (u mikrovatima po kvadratnom centimetru) provedeno je s radiometrom/fotometrom Tektronix J16 sa sondom za zračenje J6512 (Tektronix, Beaverton, OR). Eksperimentalni svjetlosni podražaji reflektirani od ganzfeld kupole mjereni su u razini očiju dobrovoljaca neposredno prije i nakon 90 -minutne izloženosti. Preduzete su dodatne mjere svakih 0,5 sati izloženosti kako bi se osigurala stabilnost podražaja i omogućilo ponovno podešavanje intenziteta ako je varirao. Ove mjere na licu mjesta poduzete su pomoću metra ft-1 ° (Minolta, Osaka, Japan). Spektroradiometrijska procjena monokromatskih valnih duljina na razini rožnice ispitanika provedena je prijenosnim spektroradiometrom sa optičkim senzorom (model S2000 Ocean Optics, Dunedin, FL). Ova je oprema kalibrirana standardnom svjetiljkom koja se može pratiti do Nacionalnog instituta za standarde i tehnologiju.

U akcijskoj spektroskopiji ključno je da izmjereni svjetlosni podražaji budu reprezentativni za podražaje koji zapravo dopiru do fotoreceptora koji posreduju fotobiološki odgovor. U studijama o regulaciji svjetlosti cirkadijskog sustava, čimbenici koji mogu izmijeniti izmjereni podražaj prije nego što dosegne fotoreceptore uključuju kretanje glave i oka, žmirkanje i zatvaranje oka, zjenične reflekse i prijenos svjetlosti kroz očne medije (Gaddy i sur., 1993. Brainard i sur., 1997.). Većina ovih čimbenika kontrolira se gore opisanom eksperimentalnom tehnikom. Što se tiče prijenosa svjetlosti kroz okularne medije, rožnica i vodeni i staklasti humori obično prenose gotovo 100% vidljivih valnih duljina na mrežnicu i ne mijenjaju se bitno s starenjem očiju (Boettner i Wolter, 1962.). Nasuprot tome, starenje ljudske leće razvija pigmentaciju koja umanjuje prijenos kraćih vidljivih valnih duljina na mrežnicu (Lerman, 1987. Brainard i sur., 1997.). U ovoj studiji ograničavanje dobi dobrovoljaca na 18-30 godina kontroliralo je ovaj faktor. Mjerenja srednje propusnosti 36 postmortalnih ljudskih leća u ovom dobnom rasponu pokazala su relativno ravnomjeran prijenos od 440 do 600 nm. Nasuprot tome, došlo je do srednjeg 45% smanjenja propuštanja leće pri 420 nm u usporedbi s 460 nm (Brainard i sur., 1997.). Slijedom toga, izmjerena zračenja svjetlosti rožnice na 420 nm morala su se prilagoditi kako bi se kompenzirao smanjeni prijenos podražaja na mrežnicu čak i u ovoj relativno mladoj studijskoj skupini.

Uzorci krvi i analiza melatonina. Uzorci krvi prikupljeni su u staklenim vakuinima koji su sadržavali EDTA. Plazma je odvojena rashladnim centrifugiranjem, alikvotirana u kriogene bočice i pohranjena na -20 ° C do testa. Koncentracije melatonina ispitane su radioimunološkim ispitivanjem pomoću antiseruma opisanog od strane Rollaga i Niswendera (1976.). Radioaktivno obilježeni ligand pripravljen je dodavanjem 10 μl otopine dioksana koja sadrži 1 μmol 5-metoksitriptamina i 1 μmol tri-N-butilamin do 250 μCi (0,1 nmol) osušeni Bolton -Hunter reagens (NEN, Boston, MA). Reakcija je ostavljena 1 sat prije dodavanja 50 μl vodene saharoze (16 gm/ml pufera za elektroforezu) i pročišćavanja proizvoda elektroforezom u gel disku. Dvostruki alikvoti od 200 μl svakog nepoznatog i kontrolnog uzorka ekstrahirani su u 2 ml kloroforma. Kloroform je uklonjen u centrifugi SpeedVac (Savant Instruments, Holbrook, NY) i resuspendiran u 200 μl pufera za ispitivanje (PBS, pH 7,4, koji sadrži 0,1% želatine sa 100 mg/l timerosala kao konzervansa). Ekstrakti su isprani dva puta s 3 ml petroletera, a zatim upareni do suhog u SpeedVac -u prije ponovne suspenzije u 200 μl deionizirane vode. Približno 50.000 cpm radioaktivno obilježenog liganda i razrjeđenje antiseruma u omjeru 1: 256.000 (datum krvarenja R1055 16. rujna 1974.) dodano je svakoj nepoznatoj i trostruki dvostruki geometrijski niz standarda u koncentraciji od 0.201 do 200 pg po 200 μl tampon testa. Konačni testni volumen pufera u svakoj epruveti bio je 400 μl. Na kraju razdoblja inkubacije od 48 sati, 3 ml 95% -tnog etanola (4 ° C) dodano je u svaku epruvetu za ispitivanje, a vezana radioaktivnost je istaložena centrifugiranjem na 2000 × g 30 min. Supernatant je dekantiran, a radioaktivnost u talogu je kvantificirana. Količina imunoreaktivnosti melatonina u uzorcima izračunata je pomoću računalnog programa (M. L. Jaffe i suradnici, Silver Spring, MD) (Davis i sur., 1980.). Sve otopine su održavane na 4 ° C tijekom cijelog postupka radioimunog testa. Rezultati ispitivanja nisu korigirani za oporavak (što se pokazalo> 95% u neovisnim ispitivanjima). Minimalna granica detekcije testa je 0,5-2,0 pg/ml.

Statistika. Dvostrani, upareni Studentski t testovi su korišteni za procjenu statističke značajnosti promjene sirovog melatonina od 2:00 do 3:30 ujutro. Postotak rezultata promjene melatonina određen je sljedećom formulom: Postoci ocjene promjene melatonina zatim su normalizirani na postotke rezultata prilagođenih kontroli prilagođenih oduzimanjem postotaka ocjena promjene kontrolnog stanja (bez svjetla) za svakog ispitanika od ocjene izloženosti svjetlosti tog istog subjekta. Ova tehnika objašnjava normalni pojedinačni porast ili pad razine melatonina u plazmi s obzirom na promjene izazvane svjetlošću (Gaddy i sur., 1993. Brainard i sur., 1997.). Za podatke sa svake valne duljine analizirani su kompletni setovi vrijednosti melatonina prije izlaganja, postotak promjena u melatoninu i postotak promjena u melatoninu prilagođen kontrolom s jednosmjernom ANOVA-om s ponovljenim mjerenjima. Značajne razlike među skupinama ocijenjene su spost hoc Scheffe Ž testovi s α postavljenim na 0,05. Skupina pojedinačnih krivulja fluence -response (po jedna za svaku valnu duljinu) prilagođena je parametarskom modelu u kojem je odgovor melatonina (Y) do doze fotona (x) predviđa se slijedećim: teorijskim početnimY-odgovor (0 doza) za krivulju (A1) teorijsko finale Y-odgovor ("beskonačna" doza) za krivulju (A2) doza koja proizvodi odgovor na pola puta između A1 i A.2 (X50 ili ED50) i procjenjivač nagiba (str) za nagib krivulje između A1 i A.2. Jednadžba je sljedeća: Računalni program Origin 6.0 (Microcal, Northampton, MA) korišten je za prilagodbu krivulja fluence – response podacima. Iz dugogodišnjeg iskustva u našem laboratoriju, zasićena svjetlosna izloženost od 90 minuta proizvodi maksimalni prosječni postotak suzbijanja melatonina u plazmi prilagođen kontroli, koji se kreće od 60 do 80%, ovisno o određenoj skupini ispitanika koji se testiraju (Gaddy i sur., 1993. Ruberg i sur. , 1996. Wang i sur., 1999. Brainard i sur., 2000.a, 2001.). Da bi se formirao analitički spektar djelovanja, potrebno je utvrditi mogu li se sve krivulje fluence -response prilagoditi univarijantnoj sigmoidnoj krivulji (Coohill, 1991 Lipson, 1994, 1999). Da bi se to učinilo, sigmoidne krivulje su postavljene na pet krivulja fluence – response između 440 i 530 nm, koje su dosegle srednji postotak suzbijanja melatonina prilagođen kontrolom od 60–80% ograničavanjem A1 faktor (teorijski početni Y-odgovor) na 0 jer nikakva izloženost svjetlu ne bi trebala dovesti do 0% kontrole prilagođene supresije plazma melatonina. Iz ovog skupa krivulja, srednja vrijednost A2(teorijsko finale Y-odziv ili "beskonačna" doza za krivulju) i srednju vrijednost str (procjena nagiba) je izračunata. Zatim je svih osam skupova podataka (uključujući skupove podataka koji nisu dosegli zasićenje) zatim ugrađeno u sigmoidne krivulje koje su ograničavale A2 i str ovim sredstvima i ograničenim A1 do 0. Svaka izračunata krivulja testirana je na prikladnost podataka pomoću koeficijenta korelacije.

Spektar djelovanja melatonina. Ovaj spektar djelovanja formiran je iz gustoće fotona, koja je izazvala konstantu poluzasićenja (ED50) postotka supresije melatonina prilagođene kontrolom za svaku od osam valnih duljina. Ove konstante poluzasićenja izvedene su iz osam gore opisanih univarijantnih krivulja fluence-response. Konstante poluzasićenja tada su normalizirane do maksimalnog odziva i iscrtane kao relativna osjetljivost. Relativna kvantna osjetljivost svake skupine ispitanika tada je grafički prikazana (kvanti/valna duljina) kako bi se ilustrirali rezultirajući akcijski spektri za suzbijanje melatonina kod ljudi. Predviđena najveća osjetljivost za ovaj spektar djelovanja određena je ugradnjom vitamina A1-retinaldehid fotopigmentni predložak u podatke modifikacijom metode koju su opisali MacNichol i sur. (1983.). Točnije, vitamin A dugačke valne duljine1-fotopigmenti na bazi slike mogu se smatrati linearnima unutar raspona osjetljivosti 10–90% kada se iscrtaju na frekvenciji apscisa. Za odabir vitamina A koji najbolje odgovara1predložak, normalizirani melatonin ED duge valne duljine 10–90%50 podaci su uklopljeni u niz vitamina A1predlošci na temelju unutar 10–90% osjetljivog područja udova dugovalne duljine šablona (Partridge i De Grip, 1991). Pearsonovi koeficijenti korelacije izvedeni iz uklapanja podataka o melatoninu u predloške pokazali su optimalno uklapanje predloška.


Rezultati

Studije su pokazale da su određeni cirkadijski geni promijenjeni u određenom raku [11 �]. Međutim, obrasci ekspresije gena sata nisu proučavani u PCa. Stoga smo prvo procijenili razinu ekspresije proteina u jezgri gena sata Clock, Bmal1 i Per2 u ljudskim PCa stanicama LNCaP, 22R 㯑, DU145 i PC3, u usporedbi s normalnim epitelnim stanicama prostate PREC. Kao što je prikazano na slici 1, otkrili smo da su razine endogenog sata i Per2 proteina smanjene, dok su razine proteina Bmal1 povećane u stanicama PCa u usporedbi s normalnim stanicama PrEC (slike 1A i 1B), što sugerira da su obrasci ekspresije gena za cirkadijalni ritam izmijenjen u stanicama PCa u usporedbi s normalnim stanicama prostate. Nadalje, kao što je prikazano na dodatnoj slici, naši podaci također su pokazali vezivanje između sata i Bmal1 u svim stanicama PCa (dopunske slike 1A i B), što sugerira da su, unatoč promijenjenom profilu ekspresije gena jezgre cirkadijalnog ritma u ljudskom PCa, oni još uvijek u mogućnosti da se slože sa svojim kolegama.

Razine endogene ekspresije proteina Clock, Per2 i Bmal1 u PCa protiv normalni uzorci prostate. A) Western blot analiza sata, Per2 i Bmal1: Razine proteina sata, Per2 i Bmal1 određene su Western blot analizom. Jednako opterećenje potvrđeno je ponovnim ispitivanjem mrlje za β-aktin B) Kvantifikacija razine proteina sata, Per2 i Bmal1: Western blot analiza kvantificirana je denzitometrijskom analizom proteinskih traka. Podaci su normalizirani na β-aktin. C) Automatizirana kvantitativna analiza (AQUA) sata, Per2 i Bmal1 u mikro nizu tkiva prostate kod ljudi (TMA). Razine Per2, Sat i Bmal1 određene su u humanom TMA pomoću AQUA. D) Reprezentativno imunofluorescentno bojenje za Per2, Sat i Bmal1 u humanoj TMA prostate: Epitel prostate označen je Alexa Fluor 555 (zelena). DAPI je identificirao nuklearni odjeljak (plavo). Ciljani markeri, Per2, Clock i Bmal1, vizualizirani su pomoću Alexa Fluor 647 (crveno). Složene slike prikazuju mete i njihovu lokalizaciju unutar jezgre tkiva. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD tri eksperimenta (*p ≤ 0,01 u usporedbi s odgovarajućim kontrolama). Pojedinosti o pokusima navedene su u “Materijali i metode.

Zatim smo procijenili obrasce ekspresije gena Clock, Bmal1 i Per2 u tkivima ljudske prostate koristeći AQUA. AQUA sustav kvantificira ekspresiju proteina unutar substaničnih odjeljaka u presjecima tkiva.Ova platforma za proteomsku analizu s više tkiva kombinira analizu slike temeljenu na fluorescenciji s automatiziranom mikroskopijom i visokopropusnim tehnologijama mikromreža tkiva [25,26]. U tu smo svrhu upotrijebili prilagođeni tkivni mikro niz (TMA) koji sadrži 336 mrlja koje su sastavljene od benigne prostate, benigne hiperplazije prostate (BPH), intraepitelijalne neoplazije visokog stupnja (HGPIN), lokaliziranog karcinoma prostate (lokalno PCa), agresivnog rak prostate s metastazama (PCa ispunjen) i metastatski PCa iz limfnih čvorova, debelog crijeva ili tkiva mozga (Met). Validacija TMA i AQUA sustava već je izvršena i opisana je na drugom mjestu [23].

Kao što je pokazalo AQUA, otkrili smo da su razine ekspresije Per2 bile značajno niže u svim proliferativnim bolestima prostate (BPH, HGPIN, PCa lokalna, PCa met, Met), (AQUA rezultati, 126,6 ± 11,7, 9,92 ± 12,9 , 71,4 ± 12,0, 77,0 ± 7,99, 96,0 ± 17,99) u usporedbi s benignim tkivom prostate (AQUA rezultat, 186,8 ± 10,8) (slika 1C). Dodatno je utvrđeno da su razine ekspresije sata smanjene i kod svih proliferativnih bolesti prostate (BPH, HGPIN, PCa lokalna, PCa ispunjena, Met AQUA rezultati, 321,7 ± 106,6, 436,2 ± 88,2, 304,5 ± 33,4, 378,1 ± 51,2, 446,2 i#x000b1 77,5) u usporedbi s benignim tkivom prostate (AQUA rezultat, 521,7 ± 71,1) (slika 1C). Nadalje, utvrđeno je da je razina ekspresije Bmal1 značajno povećana u svim proliferativnim bolestima prostate (BPH, HGPIN, PCa lokalna, PCa ispunjena, Met AQUA rezultati, 156.3 ± 26.0, 138.4 ± 28.8, 97.2 ± 19.8, 134,3 ± 44,7, 209,8 ± 56,7, respektivno) u usporedbi s benignim tkivom prostate (ocjene AQUA, 49,1 ± 9,1) (slika 1C). Epitel prostate razlikovao se od strome koktelom protutijela pan-citokeratina i E-kadherina označenim Alexa Fluor 555 (zeleno). Nuklearni odjeljak unutar epitelne maske vizualiziran je s DAPI (plava). Ciljevi (Per2, Sat i Bmal1) vizualizirani su pomoću Alexa Fluor 647 (crveno). Složene spojene slike prikazuju mete u membranskom/citoplazmatskom odjeljku ili nuklearnom odjeljku. Urađene su reprezentativne slike kako bi se potvrdilo odgovarajuće bojenje (slika 1D). Ovi rezultati dobiveni u tkivima ljudske prostate potvrdili su rezultate opažene u stanicama humanog PCa i opet sugeriraju da su geni cirkadijalnog ritma, Per2, Sat i Bmal1, promijenjeni u uzorcima PCa u usporedbi s normalnim uzorcima prostate. Ovi rezultati, zajedno s opažanjima u ljudskim stanicama PCa (slike 1A i 1B), ukazuju na to da su geni cirkadijalnog ritma, Per2, Sat i Bmal1, promijenjeni u uzorcima PCa u usporedbi s normalnim uzorcima prostate.

Budući da smo uočili drugačiji profil ekspresije Per2 u stanicama PCa u usporedbi s normalnim stanicama prostate, istražili smo učinak prisilne prekomjerne ekspresije ljudskog Per2 u stanicama ljudskog PCa. Uspješno smo transficirali 22R 㯑, DU145 i PC3 stanice s ljudskim razdobljem 2 (hPer2) ili pCDNA kontrolnim vektorom (slike 2A i B). Nadalje, upotrijebili smo test s tripan plavim za procjenu učinka rasta i vitalnosti stanica s prekomjernom ekspresijom hPer2. Uočili smo značajnu inhibiciju rasta i održivosti stanica PCa sa prekomjernom ekspresijom hPer2 u stanicama 22Rv1, DU145 i PC3 (slike 2C i 2D). To je dodatno potvrđeno mjerenjem smanjenja rasta stanica pomoću MTT testa (slika 2E). Nadalje, apoptoza je mjerena procjenom ekspresije cijepljene poli ADP ribozne polimeraze (PARP). U usporedbi s vektorskim kontrolama, hPer2 transfektirane PCa stanice pokazale su značajno povećanje cijepljenog PARP -a u usporedbi s pCDNA transficiranim stanicama (slike 3A i 3B), što upućuje na indukciju apoptoze stanica PCa kao rezultat prekomjerne ekspresije Per2.

Prekomjerna ekspresija Per2 u stanicama PCa. A) Učinak prekomjerne ekspresije na razinu proteina Per2: Nakon transfekcija hPer2 ili pCDNA posredovanih Lipofectaminom 2000 u 22R 㯑, DU145 i PC3 stanicama, razina proteina Per2 otkrivena je Western blot analizom. Jednako opterećenje potvrđeno je ponovnim ispitivanjem mrlje za β-aktin B) Kvantifikacija razine proteina Per2: Podaci Western blota kvantificirani su denzitometrijskom analizom proteinskih traka. Podaci su normalizirani na β-aktin. C) Učinak prekomjerne ekspresije Per2 na rast stanica PCa, procijenjen analizom Trypan Blue: 22R 㯑, DU145 i PC3 stanice transficirane s hPer2 ili pCDNA analizirane su Trypan Blue testom za procjenu rasta stanica. Rast stanica izražava se kao postotak rasta (od ukupnog broja stanica) D) Učinak prekomjerne ekspresije Per2 na vitalnost stanica PCa, procijenjen analizom Trypan Blue: 22R 㯑, DU145 i PC3 stanice transficirane s hPer2 ili pCDNA analizirane su Trypan Blue testom za procjenu vitalnosti stanica. Stanična vitalnost izražava se kao postotak održivih stanica od ukupnog broja stanica. E) Učinak prekomjerne ekspresije Per2 na rast stanica u stanicama PCa, procijenjen MTT testom: Učinak hPer2 ili pCDNA transfekcija na rast stanica 22R 㯑, DU145 i PC3 procijenjen je kolorimetrijskim testom na temelju MTT-a. Stanice su podvrgnute transfekcijama s pCDNA ili hPer2 kako je opisano, a rast stanica je ocijenjen kako je opisano u protokolu proizvođača. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD tri eksperimenta (*p ≤ 0,01). Pojedinosti eksperimenata date su u “Materijali i metode. ”

Učinak prekomjerne ekspresije Per2 na apoptozu. A) Učinak prekomjerne ekspresije Per2 na razcijepljenu razinu proteina PARP: Nakon transfekcije hPer2 ili pCDNA posredovane lipofektaminom u stanicama 22R 㯑, DU145 i PC3, Western blot analizom otkrivene su razcijepljene razine proteina PARP. Jednako opterećenje potvrđeno je ponovnim ispitivanjem mrlje za β-aktin B) Kvantifikacija razcijepljene razine proteina PARP: Podaci Western blota kvantificirani su denzitometrijskom analizom proteinskih traka. Podaci (relativna gustoća normalizirana na β-aktin) izraženi su kao srednja vrijednost ± SD tri eksperimenta (p-vrijednost ≤ 0,01*).

Pokazali smo da su neki jezgri gena za cirkadijalni ritam promijenjeni u stanicama i tkivima PCa. U sljedećoj seriji eksperimenata procijenili smo učinke hormona melatonina povezanog s cirkadijalnim ritmom na gene sata u ljudskim stanicama PCa. Naši su podaci pokazali da je liječenje melatoninom (1 mM i 2 mM 24 sata) uzrokovalo značajnu regulaciju razine mRNA Sat i Per2 i značajnu regulaciju Bmal1 mRNA u stanicama 22R 㯑, DU145 i PC3 (slika 4A). Nadalje, koristeći Western blot analizu, otkrili smo da su razine proteina Clock i Per2 također povećane u obrascu sličnom onom primijećenom na razini mRNA, uz liječenje melatoninom (100 μM, 1mM i 2mM 48 sati) u stanicama PCa ( Slika 4B). Ovo sugerira da melatonin značajno mijenja ekspresiju gena takta jezgre.

Učinak melatonina na razinu mRNA Per2, Clock i Bmal1 i proteina u stanicama ljudskog PCa. A) Učinak melatonina na razinu mRNA Per2, Clock i Bmal1: Relativne razine izražavanja od Per2, Sat i Bmal1 transkripti u stanicama PCa stanica tretiranih melatoninom (1 mM ili 2 mM 24 sata) određeni su qRT-PCR-om. Podaci (relativna gustoća normalizirana na GAPDH) izraženi su kao srednja vrijednost ± SD tri eksperimenta (*p ≤ 0,01) B) Učinak melatonina na razinu proteina Per2 i sata: Razine proteina Clocka i Per2 određene su u stanicama PCa koje su tretirane melatoninom (100 μM, 1 mM ili 2 mM 48 sati) Western blot analizom. Jednako opterećenje potvrđeno je ponovnim ispitivanjem mrlje za β-aktin. Pojedinosti eksperimenata date su u “Materijali i metode. ”

Zatim smo dodatno istražili utječe li melatonin in vitro ritmičnost cirkadijalno reguliranih gena. Da bismo to postigli, prvo smo sinkronizirali stanice PCa sa 48 -satnim gladovanjem u serumu, što je analizom staničnog ciklusa potvrđeno da uzrokuje G0/G1 zastoj staničnog ciklusa (podaci nisu prikazani). Stanice su zatim oslobođene i tretirane ili kontrolom nosača ili 1mM melatoninom, nakon čega je slijedilo periodično prikupljanje svaka četiri sata tijekom 36 sati. Iz ovih stanica izolirana je RNA i provedena je qRT-PCR. Kako bi se osiguralo da su stanice u optimalnim uvjetima uzgoja, provjeren je pH medija i utvrđeno je da je u skladu s varijansom od samo ± 0,2 u svakom tretmanu (podaci nisu prikazani). Ritmičnost gena identificirana je korištenjem COSOPT algoritma s pMMC-graničnom vrijednosti od 0,05 i ograničenjem razdoblja od 12 � sati. Kako pokazuju podaci, dobro uspostavljeni biciklistički geni, Dbp i Per2 (Slika 5) utvrđeno je da ima ritmičke oscilacije u stanicama PC3 PCa nakon liječenja melatoninom. Zanimljivo je da se oscilacije nisu vidjele u stanicama tretiranim nosačem. Uočili smo vrijednosti pMMC-β od 0,05 za oboje Dbp i Per2 s liječenjem melatoninom i vrijednostima pMMC-β od 0,21 i 0,10 for Dbp i Per2 s tretmanom vozila. Također smo procijenili obrazac oscilacija GAPDH, kao gen koji ne oscilira u domaćinstvu. Naši su podaci pokazali da melatonin ne izaziva nikakvu ritmičnost GAPDH (Slika 5) u stanicama PC3, budući da su vrijednosti pMMC-β bile 0,49 za nosač i 0,38 za liječenje melatoninom. Osim toga, također smo otkrili da su drugi geni koji ne osciliraju, kao npr Rap/Gap, PacS1 i Neud4 imao pMMC-β vrijednosti oko 0,05 uz liječenje melatoninom u stanicama PC3 (podaci nisu prikazani). Ovi podaci sugeriraju da melatonin ima sposobnost ȁkre-sinkronizirati ” gene takta jezgre u stanicama PCa.

Učinak melatonina na ritmičku ekspresiju gena Dbp, Per2 i GAPDH u stanicama PC3. PC3 stanice sinkronizirane su serumskim izgladnjivanjem, a zatim su sakupljene svaka četiri sata ukupno 36 sati nakon tretmana melatoninom. Relativne razine izražavanja od Dpb, Per2 i GAPDH transkripti su određeni qRT-PCR. Vrijednosti ekspresije za svaki gen ispitane su na cirkadijalne varijacije pomoću COSOPT -a. Nakon analize, ucrtane su relativne vrijednosti Ct i generirana kosinusna krivulja u odnosu na vrijeme (sati) i izračunata je vrijednost pMMC-β za stanice PC3 tretirane nosačem i melatoninom. Podaci predstavljaju tri eksperimenta sa sličnim rezultatima. Pojedinosti eksperimenata date su u “Materijali i metode. ”


Sve analize provedene su pomoću SAS -a (SAS Inst. Inc., Cary, NC USA, 9.4). A str vrijednost ɘ.05 smatrana je značajnom. Razlike među skupinama u pogledu osnovnih demografskih parametara izračunate su pomoću t-test za kontinuirane varijable i hi-kvadrat-test za kategorijalne varijable. Normalno raspoređene kontinuirane varijable izražene su kao srednja ± standardna devijacija (SD). Razine melatonina u plazmi i razine kortizola u serumu nisu normalno raspoređene, stoga su ti podaci izraženi kao medijan i interkvartilni raspon (IQR).

(Kliknite na sliku za povećanje.)

Podaci su logaritamski transformirani prije mješovite analize modela, a zatim su pretvoreni natrag u empirijske fraktile kako bi se postigla parametarska raspodjela, koje su zatim pretvorene u postotnu varijancu ((x-1) * 100). Odstupanje izračunate kosinorske ritmičnosti izraženo je kao standardna pogreška (SE). Cosinor-ova ritmičnost analizirana je uz pretpostavku 24-satnog vremenskog razdoblja [24]. Podaci su uklopljeni u kombiniranu kosinusnu i sinusnu funkciju: y = M + k1COS (2 πt/24) + k2SIN (2 πt/24). 24-satni ritmovi svake skupine dodatno su karakterizirani sljedećim parametrima ritma: mezor (ritam prilagođen prosjek oko kojeg dolazi do oscilacija), amplituda (razlika između najvećih i najnižih vrijednosti prilagođene krivulje kosinor) i vrijeme vrha i nadir [24,25]. Analize podataka provedene su postupkom GPLOT u SAS -u. Analiza mješovitog modela provedena je u SAS-u kako bi se opisala varijacija između vremenskih točaka dnevnog ritma melatonina i kortizola pri uključivanju i ispuštanju u svaku jedinicu.

Veličina infarkta korelirana je sa srednjim vrijednostima melatonina i kortizola pomoću regresijske analize. Mjesto infarkta uključeno je kao zbunjujući element analizom kovarijance. Wilcoxonov test s rangom s potpisom korišten je za opisivanje promjena unutar grupe od uključivanja do otpusta. Prosječne vrijednosti melatonina u plazmi izračunate su iz svih vremenskih točaka zajedno (24 sata). Zbog očuvanog dnevnog ritma, srednje vrijednosti kortizola u serumu nadalje su podijeljene na dnevne (faza visokog lučenja 24-12 h) i noćne (faza niskog lučenja 12-24 h). Razine melatonina u plazmi nisu pokazale dnevni ritam ni u jednoj jedinici, pa podjela srednjih vrijednosti melatonina u daljnje faze nije bila relevantna.


Pozadina

Rak prostate

Rak prostate (PCa) jedan je od najčešće dijagnosticiranih karcinoma kod muškaraca [1]. Američko društvo za borbu protiv raka procijenilo je 191.930 novih slučajeva i 33.330 novih smrti od PCA u 2020. godini [1]. Nažalost, iako postoji trend smanjenja broja novih slučajeva i smrti već nekoliko desetljeća [1], čini se da su se uvjeti pogoršali u posljednje 3 godine (2017. – 2019.) [2,3,4]. Procjenjuje se da se broj novih slučajeva godišnje povećao sa 161.360 u 2017. [2] na 174.650 u 2019. [4], a godišnja smrtnost se povećala sa 26.730 u 2017. [2] na 31.620 u 2019. [4]. Putevi androgena i androgenih receptora (AR) odigrali su bitnu ulogu u patogenezi PCa [5]. Aberantne AR mutacije [6], intratumoralna sinteza androgena [7] i abnormalne varijante spajanja AR [8] negativni su induktori PCa. Trenutačno se najčešće koristi terapija za pacijente s rakom PCa koji se ne liječe hormonima i to je terapija iscrpljivanjem androgena (ADT). ADT bi mogao dovesti pacijente do početno korisne faze s izumiranjem tumora, ali na kraju većina hormonski najivih PCa postaje manje osjetljiva na ADT i napreduje u maligniji stadij, rak prostate otporan na kastraciju (CRPC). CRPC ne samo da je otporan na liječenje kastracijom, već ima i druge negativne značajke kao što su udaljene metastaze [9] i neuroendokrina diferencijacija. Zbog velikog recidiva i mortaliteta od PCA, razvoj novih neinvazivnih terapija postao je fokus istraživanja. Među umjetnim i prirodnim spojevima, melatonin ima veliki potencijal za liječenje PCa.

Melatonin

Melatonin (N-acetil-metoksi-triptamin), neurohormon nalik indolu, prvenstveno se sintetizira u pinealnoj žlijezdi čovjeka. Osim u mozgu, otkriveno je da se melatonin sintetizira i u plućima [10], gastrointestinalnom traktu [11], lećama [12], bubrezima [13] i gušterači [14]. Dnevni cirkadijalni ritam glavni je regulator koji modulira biosintezu melatonina [15]. Optički signali potiču razgradnju melanopsina u retinalnim fotoreceptivnim ganglijskim stanicama, blokirajući tako sintezu melatonina [16]. Posljedično, melatonin u cirkulaciji je nizak ili se čak ne može otkriti tijekom dana [17]. Naprotiv, melatonin se uglavnom proizvodi tijekom tamne faze, a maksimalna razina u plazmi detektira se 4-5 sati nakon početka mraka [18]. Naizmjenični ciklusi svjetlo -mrak ili nepravilno izlaganje svjetlu mogu poremetiti unutarnji cirkadijalni ritam i tako smanjiti noćnu sintezu melatonina [19, 20]. Najvažnija funkcija melatonina je njegova visoka učinkovitost kao skupljača radikala [21]. Amfifilna priroda omogućuje melatoninu da lako uđe u mitohondrije [22,23,24]. Lovljenjem slobodnih radikala, aktiviranjem razdvojenih proteina i održavanjem potencijala mitohondrijske membrane, melatonin bi mogao učinkovito održavati unutarstaničnu redoks homeostazu [25, 26]. Nedavno se ističe da je mitohondrije potencijalno mjesto gdje se izvorno stvara melatonin [27]. Ostale bio-funkcije melatonina uključivale su, ali se nisu ograničavale na regulaciju metabolizma [28], poticanje vaskularne reaktivnosti [29], povišenje imunološkog odgovora [10], sprječavanje oštećenja DNA [30], izazivanje apoptoze [31] i autofagije [32,33 , 34] i inhibiranje proliferacije tumora [34,35,36].

Unos melatonina iz svakodnevne prehrane ili dodataka lijekovima

Dnevna prehrana može osigurati određenu količinu melatonina za ljudsko tijelo, u rasponu od pikograma do miligrama po gramu. Za hranu životinjskog podrijetla, jaja, riba i mlijeko sadržavali su veću koncentraciju melatonina [37]. Zanimljivo je da je vrijeme mužnje ključni faktor koji je odredio koncentraciju melatonina u mlijeku [38]. Prema Milagres i dr. [39], mlijeko proizvedeno noću sadržavalo je relativno veću koncentraciju melatonina od mlijeka proizvedenog danju. Za hranu biljnog ili voćnog podrijetla, generativni organi imaju tendenciju sadržavati veći stupanj melatonina, osobito sjemenke, za koje je predloženo da imaju znatno veću koncentraciju melatonina od ostalih biljnih tkiva [40]. U studiji koja je uključivala 12 zdravih muških dobrovoljaca, od volontera se tražilo da za doručak piju sok ekstrahiran iz 1 kg naranče ili ananasa ili dvije cijele banane, a koncentracija melatonina u serumu dosegla je najveću razinu u drugom satu nakon doručka [41]. Štoviše, očito je poboljšan i antioksidacijski kapacitet seruma dobrovoljaca koji je značajno povezan s koncentracijom melatonina u serumu za sva tri testirana ploda.

Štoviše, melatonin se također može dobiti iz dodataka lijekovima. U Europi i Sjedinjenim Državama lijekovi s dodatkom melatonina mahnito su se koristili za ublažavanje jet-lag-a ili za poboljšanje kvalitete sna. Vrijedno pažnje, tradicionalna kineska medicina također je sadržavala stupanj melatonina u rasponu od nekoliko do nekoliko tisuća nanograma po gramu, otkrivajući da su oni idealno prirodno podrijetlo ovog hormona povoljnog za zdravlje [42].

Jednom riječju, svakodnevna prehrana ljudi ili komercijalni lijekovi s dodatkom melatonina dobri su izvori melatonina, a razumna kombinacija sastojaka hrane mogla bi donijeti dobrobit ljudskom tijelu.

Ciljevi

S obzirom na to da broj pregleda inhibicijskog učinka melatonina na PCa u posljednjih 10 godina nije razmjeran s napretkom postignutim u relevantnim područjima, dopisujemo ovaj pregled literature kako bismo popunili tu prazninu. Ovdje sustavno raspravljamo o anti-PCa svojstvima melatonina kako bismo saželi trenutna shvaćanja o njegovom inhibitornom učinku na humani PCa i otkrili mogućnost prevođenja eksperimentalnih nalaza u kliničko liječenje.


Podaci o autoru

Pripadnosti

Departamento de Química e Ciências Ambientais, IBILCE, UNESP, Rua Cristóvão Colombo 2265, CEP 15054-000, São José do Rio Preto, SP, Brazil

Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, USP Av. Prof. Lineu Prestes, 748, CEP 05513-970, São Paulo, SP, Brazil

Odjel za anatomiju, Medicinski fakultet Asahikawa, Nishikagura, Asahikawa, Japan

323 Brock Ave., Toronto, ON, Kanada, M6K 2M6

Institut za san i umor, 106 Codsell Ave, Toronto, ON, Kanada, M3H 3W1

Johann Friedrich Blumenbach Institut za zoologiju i antropologiju, Sveučilište u Göttingenu, Göttingen, Njemačka

Departamento de Docencia e Investigación, Facultad de Ciencias Médicas, Pontificia Universidad Católica Argentina, 1107, Buenos Aires, Argentina

Centar za ovisnost i mentalno zdravlje, 250 College Street, Toronto, ON, Kanada, M5T 1R8


Gledaj video: ŠOKANTNO! SLEDEĆI CIKLUS UNIŠTENJA STIŽE! (Kolovoz 2022).