Informacija

1.18: Serijska razrjeđenja i standardne krivulje s čitačima mikroploča - Biologija

1.18: Serijska razrjeđenja i standardne krivulje s čitačima mikroploča - Biologija



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ciljevi učenja

Ciljevi:

  • Izvršite nekoliko serijskih razrjeđenja.
  • Za mjerenje apsorbancije otopina upotrijebite spektrofotometriju.
Ishodi učenja učenika:

Po završetku ovog laboratorija studenti će moći:

  • Napravite niz otopina za smanjenje koncentracija serijskim razrjeđivanjem.
  • Izmjerite apsorbanciju otopina čitačem mikroploča.
  • Generirajte standardne krivulje u Excelu.
  • Ocijenite kvalitetu standardnih krivulja prema njihovoj R2 vrijednosti.

Dio I: Serijske razrjeđenja

Uvod

A serijsko razrjeđivanje je niz razrjeđenja napravljenih uzastopno, koristeći isti faktor razrjeđivanja za svaki korak. The faktor koncentracije je početni volumen podijeljen s konačnim volumenom otopine; the faktor razrjeđenja bila bi obrnuta faktoru koncentracije. Na primjer, ako uzmete 1 dio uzorka i dodate 9 dijelova vode (otapala), tada ste napravili razrjeđenje 1:10; ovo je 1/10 (0,1) koncentracije izvorne otopine i ima faktor razrjeđivanja 10. Ova serijska razrjeđenja često se koriste za određivanje približne koncentracije enzima (ili molekule) koju treba kvantificirati u testu. Serijska razrjeđenja omogućuju razrjeđivanje malih alikvota umjesto trošenja velikih količina materijala, isplativa su i laka za pripremu.

Jednadžba 1.

[faktor koncentracije = frac {volumen_ {početni}} {volumen_ {konačan}} bez broja ]

[faktor razrjeđenja = frac {1} {faktor koncentracije} bez broja ]

Dijagram serijskih razrjeđenja 1: 2

U bilježnici nacrtajte dijagram koji prikazuje serijska razrjeđenja za 6 KMnO4 rješenja koja pripremate. Na dijagramu navedite volumen koji se izvlači iz koncentrirane otopine, volumen dodane vode, koncentraciju nove otopine i ukupni volumen.

Vježbajte izračune

Problem 1. Pretpostavimo da izvorni uzorak upotrijebljen na slici 1 sadrži 400 g/L reagensa X.

  1. Tada bi prva epruveta za razrjeđivanje 1:10 imala koncentraciju 400/10 = __________
  2. Tada bi drugo razrjeđivanje 1:10 imalo koncentraciju ____________

Problem 2. Pretpostavimo da se izvorni uzorak koji se koristi na slici smatra 100% koncentracijom.

  1. Tada bi prva epruveta za razrjeđivanje 1:10 imala koncentraciju _____ %.
  2. Druga epruveta za razrjeđivanje 1:10 imala bi _____ % koncentraciju.

Problem 3. Da biste napravili serijsko razrjeđivanje s faktorom razrjeđenja 5, trebate dodati 1 dio reagensa plus ___ dijelova vode kako biste dobili ukupno 5 dijelova. Ovo peterostruko serijsko razrjeđivanje imalo bi koncentracije od 100%, ______% u prvoj razrijeđenoj epruveti, _____% u drugoj razrijeđenoj epruveti, ________% u trećoj razrijeđenoj epruveti.

Problem 4. Pretpostavimo da treća razrijeđena epruveta dvostrukog serijskog razrjeđenja ima koncentraciju od 300 g/L.

  1. To znači da druga razrijeđena epruveta ima koncentraciju _________
  2. Prva razrijeđena epruveta ima koncentraciju ________
  3. Originalna cijev ima koncentraciju _______
  4. Kojom formulom biste mogli izračunati koncentraciju izvorne epruvete iz problema?

1. dio: Izrada serijskih razrjeđenja

Materijali

Reagensi

  • Plava boja za hranu
  • DI H2O.
  • Mikroploča sa 96 jažica (suha)

Pribor

  • P200 Mikropipeta
  • Kutija sa nastavcima za pipete P200

Bilješka

Za svako serijsko razrjeđivanje upotrijebite jedan vrh pipete.

Postupak

Priprema dvoslojnog serijskog razrjeđivanja (faktor razrjeđivanja dva)

  1. Nabavite čistu, suhu mikropločicu sa 96 jažica, uvijek dodirujući samo rubove. Suhim, čistim papirnatim ručnikom obrišite otiske prstiju na dnu ploče.
  2. Držite ploču do svjetla i provjerite nema li prljavih mrlja na tri reda koja ćete koristiti.
  3. (Izborno) Možete skenirati ploču bez tekućine kako biste saznali osnovnu apsorpciju plastike.
  4. Ispipetirajte 100 µL DI-vode u prvih 5 jažica reda A (A1-A5).
  5. Ispipetirajte 100 µL izvorne plave boje u prvu jažicu (A1). Pažljivo pipetom dvaput gore -dolje promiješajte.
  6. Ne morate mijenjati vrh pipete. No, provjerite jeste li pustili svu tekućinu u prvu jažicu.
  7. Prenesite 100 µL smjese u sljedeću jažicu (A2). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  8. Prenesite 100 µL smjese u sljedeću jažicu (A3). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  9. Prenesite 100 µL smjese u sljedeću jažicu (A4). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  10. Prenesite 100 µL smjese u sljedeću jažicu (A5). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  11. Prenesite 100 µL smjese u sljedeću jažicu (A6). Fotografirajte bušotine na vrhu bijelog papira.

Priprema četverostrukog serijskog razrjeđivanja (faktor razrjeđivanja četiri)

  1. Koristeći novi vrh pipete, pipetirajte 150 µL DI-vode u prvih 5 jažica reda B (B1-B5).
  2. Ne morate mijenjati vrh pipete. Ispipetirajte 50 µL izvorne plave boje u prvu jažicu (B1). Pažljivo pipetom dvaput gore -dolje promiješajte. Zatim provjerite jeste li pustili svu tekućinu u prvu jažicu.
  3. Prenesite 50 µL smjese u sljedeću jažicu (B2). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  4. Prenesite 50 µL smjese u sljedeću jažicu (B3). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  5. Prenesite 50 µL smjese u sljedeću jažicu (B4). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  6. Prenesite 50 µL smjese u sljedeću jažicu (B5). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  7. Prenesite 50 µL smjese u sljedeću jažicu (B6). Time se osigurava da sve jažice B1-B5 imaju isti volumen.
  8. Fotografirajte bušotine na vrhu bijelog papira.

Priprema petostrukog serijskog razrjeđivanja (faktor razrjeđivanja pet)

  1. Koristeći novi vrh pipete, pipetirajte 160 µL DI-vode u prvih 5 jažica reda C (C1-C5).
  2. Ne morate mijenjati vrh pipete. Ispipetirajte 40 µL izvorne plave boje u prvu jažicu (C1). Zatim provjerite jeste li pustili svu tekućinu u prvu jažicu.
  3. Prenesite 40 µL smjese u sljedeću jažicu (C2). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  4. Prenesite 40 µL smjese u sljedeću jažicu (C3). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  5. Prenesite 40 µL smjese u sljedeću jažicu (C4). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  6. Prenesite 40 µL smjese u sljedeću jažicu (C5). Pažljivo promiješajte i pustite svu tekućinu.
  7. Prenesite 40 µL smjese u sljedeću jažicu (C6). Time se osigurava da sve jažice C1-C5 imaju isti volumen.
  8. Fotografirajte bušotine na vrhu bijelog papira.

Dio II: Mjerenje apsorbancije

Čitač mikroploča je spektrofotometrijski instrument koji može mjeriti apsorbanciju 96 različitih uzoraka u isto vrijeme. Štedi li to vrijeme u usporedbi s radom s pojedinačnim kivetama i spektrofotometrom? Koristit ćemo mikroploču sa 96 jažica, tako da možete izvesti sva serijska razrjeđenja na jednoj ploči i jednom skenirati čitavu ploču čitačem mikroploča. Mikroploča ima redove označene A-H i stupce označene #1-12. Pomoću plave boje napravite serijsko razrjeđivanje 1: 2 u retku A, napravite 1: 4 serijsko razrjeđivanje u retku B i 1: 5 serijsko razrjeđivanje u retku C.

Materijali:

  • Oprema
  • Čitač mikroploča i kabeli
  • Prijenosno računalo s instaliranim programom za pokretanje čitača mikroploča

Postupak:

  1. Priključite kabel prijenosnog računala u čitač mikroploča.
  2. Uključite "ON" prijenosno računalo i čitač mikroploča.
  3. Otvorite računalni program za pokretanje čitača mikroploča.
  4. Pritisnite gumb za otvaranje čitača mikroploča i otkrivanje platforme za učitavanje mikroploča.
  5. Čvrsto postavite mikropločicu u držač, pazeći da se otvor A1 nalazi u gornjem lijevom kutu.
  6. Pritisnite gumb za zatvaranje čitača mikroploča.
  7. Na računalnom programu počnite "čitati novu ploču" pomoću valne duljine 595 nm (za plavo bojilo).
  8. Računalnim mišem označite ćelije koje odgovaraju udubljenjima mikroploča koje ste koristili. Snimite zaslon računala i zabilježite podatke apsorpcije u donjim tablicama.
  9. Izračunajte koncentraciju boje za svaku jažicu dijeljenjem faktora razrjeđenja za svaki korak serijskog razrjeđivanja. Izvorna boja je 100% koncentracija.
Tablica podataka 1. Mjerenja apsorbancije dvostrukog serijskog razrjeđivanja s čitačem mikroploča

Dobro

A1

A2

A3

A4

A5

Apsorpcija @ 595 nm

Koncentracija bojila

Tablica podataka 2. Mjerenja apsorpcije četverostrukog serijskog razrjeđivanja s čitačem mikroploča

Dobro

A1

A2

A3

A4

A5

Apsorpcija @ 595 nm

Koncentracija bojila

Tablica podataka 3. Mjerenja apsorbancije peterostrukog serijskog razrjeđivanja s čitačem mikroploča

Dobro

A1

A2

A3

A4

A5

Apsorpcija @ 595 nm

Koncentracija bojila

Dio III: Standardne krivulje

Uvod

Standardne krivulje (poznate i kao kalibracijske krivulje) pokazuju odnos između dvije veličine. Standardne krivulje najčešće se koriste za određivanje koncentracije "nepoznatih" uzoraka usporedbom s referentnim uzorcima s "poznatim" koncentracijama. Kasnije u tečaju koristit ćemo standardne krivulje za mjerenje količina ekstrahiranog proteina i za određivanje veličine molekula DNA. U današnjem laboratoriju napravili ste tri serijska razrjeđenja i trebali biste moći izračunati koncentracije za svako razrjeđivanje. Pomoću programa Excel pripremit ćete standardne krivulje za svako serijsko razrjeđivanje i utvrditi je li vaša standardna krivulja točna. Zatim ćete pomoću standardnih krivulja odrediti koncentraciju nepoznatih uzoraka.

R-kvadrat vrijednost (R2) je koeficijent korelacije ili kvadrat korelacije. Za standardnu ​​krivulju, ova vrijednost mjeri koliko je jak linearni odnos između koncentracije reagensa (os X) i vrijednosti apsorbancije (os Y). Ako je vrijednost R2 = 1, to pokazuje savršen pozitivan odnos. Budući da se vaše standardne krivulje generiraju iz serijskog razrjeđivanja koje ste pipetirali, vrijednosti R2 mogu također pokazati koliko su vaše vještine pipetiranja točne.

Aktivnost A: Izrada standardne krivulje za svako serijsko razrjeđivanje

  1. Unesite podatke u Excel.
  2. Odaberite vrijednosti podataka mišem. Na kartici Umetanje kliknite ikonu Scatter i s padajućeg izbornika odaberite Scatter with Straight Lines and Markers kako biste generirali standardnu ​​krivulju.
  3. Svakako dodajte naslov grafikona i oznake za osi X i Y.
  4. Da biste grafikonu dodali liniju trenda, desnom tipkom miša kliknite standardnu ​​liniju krivulje na grafikonu za prikaz skočnog izbornika radnji povezanih s crtom. Na ovom izborniku odaberite Dodaj liniju trenda.
  5. Odaberite "prikaz jednadžbe na grafikonu" i "prikaz R-kvadrata vrijednosti na grafikonu". U idealnom slučaju, vrijednost R2 trebala bi biti veća od 0,99.
  6. Ispišite standardne krivulje i dodajte ih u bilježnicu.

Aktivnost B: Određivanje koncentracije "nepoznatih" uzoraka

  1. Vaš će instruktor imati nekoliko nepoznatih uzoraka.
  2. Odredite vrijednosti apsorbancije svakog uzorka.
  3. Na svojoj standardnoj krivulji upotrijebite jednadžbu grafa za rješavanje odgovarajuće koncentracije ovih uzoraka. Ili procijenite iz linijskog grafikona.
Tablica podataka 4. Koncentracija u usporedbi sa grafikonima serijskog razrjeđivanja
Nepoznati uzorakUpijanje2-puta4 puta5 puta

Studijska pitanja

  1. Pomoću serijskog razrjeđivanja opišite kako biste pripremili 10 ml 1,0%, 0,1% i 0,01% otopine NaOH. Osnovna otopina je 10% NaOH. Nacrtajte dijagrame kao dio svojih opisa/protokola.
  2. Pomoću prikazane standardne krivulje izračunajte koncentraciju nepoznate otopine ako je njezina vrijednost apsorbancije 0,55.
  3. Procijenite kvalitetu standardne krivulje (vidi dijagram) pomoću vrijednosti R2.

Okarakterizirajte biološke lijekove za blokadu imunoloških kontrolnih točaka pomoću reporterskih biotestova pomoću čitača mikroploča SpectraMax

Receptori imunoloških kontrolnih točaka obećavaju imunoterapijske ciljeve za liječenje raznih bolesti, uključujući rak i autoimune poremećaje. Nekoliko ko-inhibitornih receptora, poput proteina programirane stanične smrti 1 (PD-1), proteina 4 povezanog s citotoksičnim T-limfocitima (CTLA-4), imunoreceptora T stanica s imunoglobulinom i inhibitornog motiva na bazi tirozina (TIGIT), imunoglobulina T stanica i mucin-domena koja sadrži-3 (TIM-3) i gen-3 za aktivaciju limfocita (LAG-3) identificirani su kao mete za monoklonska protutijela da blokiraju ko-inhibitorne signale, tako da se pokreće aktivna imunoterapija protiv raka.

Nadalje, pretkliničke studije koje uključuju kombinaciju ciljeva imunoterapije sugeriraju da one mogu imati sinergijski učinak na aktivaciju T stanica, antitumorske odgovore i preživljavanje pacijenata. Razvoj lijekova koji inhibiraju jedan ili dva receptora imunološke kontrolne točke istovremeno predstavlja izazov za in vitro testiranje. Trenutne metode koje se koriste za mjerenje aktivnosti lijekova koji ciljaju imunološke kontrolne točke oslanjaju se na primarne humane T stanice i mjerenje funkcionalnih krajnjih točaka, poput proliferacije stanica, ekspresije staničnih površinskih markera i proizvodnje interferona gama i interleukin-2. Ti su testovi naporni i vrlo varijabilni zbog oslanjanja na primarne stanice donatora, složenih protokola ispitivanja i nekvalificiranih reagensa za ispitivanje.

Promega je razvila paket funkcionalnih reporterskih biotestova kako bi omogućila istraživanje i razvoj lijekova za različite ciljeve imunosnih kontrolnih točaka, uključujući dvije navedene u ovoj bilješci o prijavi, TIGIT i CTLA-4. Svaki komplet nudi stanice za odmrzavanje i upotrebu koje eliminiraju potrebu za primarnom staničnom kulturom i omogućuju kraće vrijeme za dobivanje rezultata.

Biološki test blokade TIGIT/CD155 sastoji se od dvije genetski modificirane stanične linije: TIGIT efektorske stanice, Jurkat T stanice koje eksprimiraju ljudski TIGIT s reporterom luciferaze kojeg pokreće nativni promotor koji može reagirati i na TCR aktivaciju i na ko-stimulaciju CD226 i na CD155 aAPC/CHO -K1 stanice, CHO-K1 stanice projektirane za ekspresiju humanog CD155 s inženjeriranim proteinom na staničnoj površini koji je dizajniran za aktiviranje TCR kompleksa na antigen neovisan način. Kada se dva tipa stanica zajedno uzgajaju, TIGIT inhibira aktivaciju CD226 i promotor posredovanu luminescenciju. Dodavanje protutijela protiv TIGIT-a blokira interakciju TIGIT-a s CD155 ili inhibira sposobnost TIGIT-a da spriječi homodimerizaciju CD226, što rezultira luminiscencijom posredovanom promotorom (slika 1).

Slika 1. Princip biotesta blokade TIGIT/CD155. Biotest se sastoji od dvije genetski modificirane stanične linije, TIGIT Effector Cells i CD155 aAPC/CHO-K1 stanice. Lijevo: Kada se uzgaja zajedno, TIGIT inhibira luminiscenciju aktiviranu putem CD226. Dodavanjem protutijela protiv TIGIT-a blokira se interakcija TIGIT/CD155, čime se ponovno uspostavlja luminiscencija aktivirana putem CD226, koja se može otkriti na način ovisan o dozi dodavanjem BIo-Glo ™ reagensa i kvantifikacijom s luminometrom. Sredina: Kada se uzgaja zajedno s efektorskim stanicama koje ne eksprimiraju TIGIT, CD155 inducira luminescenciju aktiviranjem CD226 puta. (Grafikon ljubaznošću Promega Corporation)

Biološki test blokade CTLA-4 sastoji se od dvije genetski modificirane stanične linije: CTLA-4 efektorske stanice, Jurkat T stanice koje stabilno eksprimiraju ljudski CTLA-4 i reportera luciferaze kojeg pokreće nativni promotor koji reagira na aktivaciju TCR/CD28 i aAPC/Raji stanice , Raji stanice koje eksprimiraju inženjerirani protein stanične površine dizajniran za aktiviranje srodnih TCR-a na antigen neovisan način i endogeno eksprimirajući CTLA-4 ligande CD80 i CD86. Kada se dva tipa stanica zajedno uzgajaju, CTLA-4 se natječe s CD28 za njihove zajedničke ligande, CD80 i CD86, i na taj način inhibira aktivaciju CD28 puta i luminiscenciju posredovanu promotorom. Dodavanje protutijela protiv CTLA-4 blokira interakciju CTLA-4 s njegovim ligandima CD80 i CD86 i rezultira luminiscencijom posredovanom promotorom (slika 2).

Slika 2. Načelo biološkog testa blokade CTLA-4. Biotest se sastoji od dvije genetski modificirane stanične linije, CTLA-4 Effector Cells i aAPC/Raji Cells. Lijevo: Kada se uzgaja zajedno, interakcija CTLA-4/CD80 i CD86 inhibira luminiscenciju aktiviranu putem CD28. Dodavanje protutijela protiv CTLA-4 blokira interakciju CTLA-4/CD80 i CD86, čime se ponovno uspostavlja luminiscencija aktivirana putem CD28, koja se može otkriti na način ovisan o dozi dodatkom Bio-Glo ™ reagensa i kvantifikacijom s luminometrom. Sredina: Kada se uzgaja zajedno s efektorskim stanicama koje ne eksprimiraju CTLA-4, aktivacija također inducira luminescenciju aktivacijom CD28 puta, ali na način neovisan o antitijelima protiv CTLA-4. (Grafikon ljubaznošću Promega Corporation)

Zahvaljujući njihovom robusnom luminiscentnom očitanju, oba se testa lako otkrivaju na čitaču mikroploča s načinom detekcije luminiscencije. Ovdje smo usporedili više čitača mikroploča iz Molecular Devices s ova dva testa. Uključuju SpectraMax® iD3 višenamjenski čitač mikroploča, čitač mikroploča SpectraMax® L, čitač mikroploča sa više načina SpectraMax® i3x i čitač mikroploča SpectraMax® M5. Svim čitačima upravljalo se softverom SoftMax® Pro, koji također ima ugrađenu analizu podataka i prilagođavanje krivulja za automatski izračun EC50 vrijednosti odgovora i jednostavna usporedba skupova podataka.

Materijali

TIGIT/CD155 test

  • Biološki test blokade TIGIT/CD155 (Promega kat. #J2201, J2205)
  • Control Ab, Anti-TIGIT (Promega kat. #J2051)

CTLA-4 test

  • Biološki test blokade CTLA-4 (Promega kat. #JA3001, JA3005)
  • Control Ab, Anti-CTLA-4 (Promega kat. #JA1020)

Ostali materijali i oprema

  • Bijele ploče s 96 udubljenja, tretirane kulturom tkiva, ravnog dna s ravnim dnom (Corning cat. #3917)
  • CO2 Inkubator, 37 ° C, 5% CO2, navlaženo
  • SpectraMax® iD3 višenamjenski čitač mikroploča (kat. #ID3-STD)
  • SpectraMax® i3x višenamjenski čitač mikroploča (kat. #I3X)
  • SpectraMax® M5 Višenamjenski čitač mikroploča (kat. #M5)
  • SpectraMax® L čitač mikroploča (kat. #SpectraMax L Config)

Metode

Biološki test blokade TIGIT/CD155

Dan prije ispitivanja pripremljen je pufer za ispitivanje kako je opisano u tehničkom priručniku za proizvod. Jedna bočica stanica TIGIT Effector za odmrzavanje i upotrebu odmrznuta je i resuspendirana u mediju za oporavak stanica. Stanična suspenzija dodana je u unutarnjih 60 udubljenja bijele ploče za ispitivanje s 96 udubljenja. Ploča je inkubirana preko noći u CO2 inkubator na 37 ° C.

Na dan ispitivanja, pripremljeno je serijsko razrjeđivanje Control Ab, Anti-TIGIT, kako bi se napravila puna krivulja doza-odgovor u deset točaka. Jedna bočica stanica za odmrzavanje i upotrebu CD155 aAPC/CHO-K1 je odmrznuta i resuspendirana u puferu za ispitivanje. Zatim su ploče za ispitivanje koje sadrže stanice TIGIT Effector uzete iz inkubatora. Serijska razrjeđenja kontrolnog protutijela dodana su u unutarnje jažice koje sadrže stanice TIGIT Effector, nakon čega je uslijedilo dodavanje stanica CD155 aAPC/CHO-K1. Ploča je zatvorena i inkubirana šest sati u 5% CO2 vlažni inkubator na 37 ° C.

CTLA-4 test

Na dan ispitivanja pripremljen je pufer za ispitivanje prema uputama u umetku proizvoda. Pripremljeno je serijsko razrjeđivanje Control Ab, Anti-CTLA-4 kako bi se napravila potpuna krivulja doza-odgovor. Razrjeđenja protutijela ostavljena su za kasnije dodavanje u stanice. Bočica sa stanicama-efektorima CTLA-4 za odmrzavanje i upotrebu odmrznuta je i resuspendirana u puferu za ispitivanje. Stanična suspenzija dodana je u unutarnjih 60 jažica bijele ploče za ispitivanje sa 96 udubljenja, ravnog dna, nakon čega je dodano serijsko razrjeđivanje kontrolnog antitijela.

Bočica otopljenih aAPC/Raji stanica odmrzavanja i upotrebe tada je odmrznuta i resuspendirana u puferu za ispitivanje. Stanična suspenzija dodana je u unutarnjih 60 jažica testne ploče koja već sadrži CTLA-4 Effector Cells i mješavinu antitijela. Ploča je zatvorena i inkubirana 16 sati na 37 ° C u inkubatoru ovlaženom 5% CO2.

Bio-Glo analiza detekcije luciferaze

Tijekom indukcijskog razdoblja za ispitivanja, Bio-Glo ™ pufer za ispitivanje luciferaze zagrijan je na sobnu temperaturu. Bio-Glo ™ sustav za ispitivanje luciferaze rekonstituiran je prenosom jedne boce Bio-Glo pufera u bocu koja sadrži Bio-Glo ™ supstrat.

Nakon 6- ili 16-satne indukcije, ploča za ispitivanje je uravnotežena na sobnu temperaturu 10-15 minuta. Jednaki volumen rekonstituiranog Bio-Glo ™ reagensa dodan je u svaku jažicu koja sadrži stanice. Ploče su inkubirane 5-10 minuta na sobnoj temperaturi. Luminescencija je mjerena u čitačima mikroploča Molecular Devices sa načinom detekcije luminiscencije koristeći vrijeme integracije od jedne sekunde.

Analiza podataka

Normalizirane vrijednosti RLU -a izračunate su postavljanjem maksimalne vrijednosti RLU -a dobivene za svaki instrument na 100%, a zatim sukladno tome povećane preostale vrijednosti RLU -a. Podaci su prikazani kao sirovi RLU ili normalizirani RLU u odnosu na koncentraciju antitijela. EC50 vrijednosti su dobivene ugrađenom analizom podataka i četveroparametarskim prilagođavanjem logističke krivulje softverom SoftMax Pro.

Rezultati

Nakon 6- ili 16-satne indukcije, aktivnost luciferaze mjerena je na čitačima SpectraMax s načinom detekcije luminiscencije. Sirove RLU i normalizirane RLU vrijednosti iscrtane su u softveru SoftMax Pro pomoću uklapanja krivulje s 4 parametra (slike 3A i 3B, 4A i 4B). Za oba testa čitač SpectraMax L dao je najveće vrijednosti RLU -a, dok je čitač SpectraMax M5 dao najniže vrijednosti RLU -a (Tablica 1). Normalizacija vrijednosti RLU -a pokazala je da su podaci iz svih instrumenata slični. Za sve čitatelje, promatrane vrijednosti EC50 bile su vrlo dosljedne, u rasponu od 1,05 do 1,31 μg/mL za anti-TIGIT antitijela, te u rasponu od 1,69 do 1,82 μg/mL za antitijela protiv CTLA-4 (Tablica 1).

Slika 3. Odgovor testa na Control Ab, Anti-TIGIT u testu blokade TIGIT/CD155. Stanice TIGIT Effector za odmrzavanje i upotrebu su stavljene i inkubirane preko noći. Sljedećeg dana dodana je titracija Control Ab, anti-TIGIT, nakon čega je uslijedilo dodavanje stanica CD155 aAPC/CHO-K1. Nakon šest sati indukcije na 37 ° C, dodan je Bio-Glo luciferazni testni reagens i mjerena je luminiscencija. RLU vrijednosti (A) i normalizirane vrijednosti RLU -a (B) dobiveni pomoću SpectraMaxa prikazani su čitači (narančasta, SpectraMax L plava, SpectraMax iD3 crvena, SpectraMax i3x zelena, SpectraMax M5). Analiza logističke krivulje s četiri parametra izvedena je sa SoftMax Pro softverom.

Slika 4. Odgovor testa na Control Ab, Anti-CTLA-4 u testu blokade CTLA-4. Stanice s efektom odmrzavanja i upotrebe CTLA-4 stavljene su u bijelu testnu ploču sa 96 jažica. Serijska razrjeđenja kontrolnog antitijela, Anti-CTLA-4, dodana su u CTLA-4 efektne stanice. Stanice aAPC/Raji su zatim dodane stanicama CTLA-4 Effector i antitijelima na test ploči. Nakon inkubacije 16 sati na 37 ° C/5% CO2, Bio-Glo Luciferase Test Reagens je dodan i mjerena je luminescencija. RLU vrijednosti (A) i normalizirane vrijednosti RLU -a (B) dobiveni pomoću SpectraMaxa prikazani su čitači (narančasta, SpectraMax L plava, SpectraMax iD3 crvena, SpectraMax i3x zelena, SpectraMax M5). Analiza logističke krivulje s četiri parametra izvedena je sa SoftMax Pro softverom.

Zaključak

Testiranje blokade TIGIT/CD155 i CTLA-4 nudi korisnicima biološki relevantan način mjerenja biološkog mehanizma djelovanja. Ovi biotestovi kombiniraju jednostavan tijek rada s dodavanjem i miješanjem čitanja s projektiranim efektorskim stanicama i aAPC stanicama. Biološki testovi su jednostavni, robusni i pretkvalificirani u skladu sa smjernicama Međunarodnog vijeća za usklađivanje tehničkih zahtjeva za lijekove za ljudsku uporabu (ICH) i pokazuju preciznost, točnost i linearnost potrebnu za rutinsku uporabu u studijama potencije i stabilnosti. Vremenski okvir testa može se mijenjati, a odluka o tome koje vrijeme testa koristiti će djelomično ovisiti o osjetljivosti čitača luminiscencije, osim o preferencijama tijeka rada. S formatom stanica Thaw-and-Use ne zahtijeva se kultura stanica, a testovi se lako provode u formatu sa 96 ili 384 jažica. Robusno i ponovljivo očitavanje testova zasnovano na luminiscenciji čini ih idealnim za upotrebu s raznim čitačima SpectraMax®. Brz i prikladan tijek rada nadopunjuje SoftMax Pro Software automatskom analizom podataka i grafičkim prikazom.

Tablica 1. EC50 odgovori utvrđeni na čitateljima SpectraMaxa. Prikazani su rezultati i za biološke testove blokade TIGIT/CD155 i CTLA-4 izračunate pomoću softvera SoftMax Pro.


Uvod

Usporedna mjerenja su sine qua non i za znanost i za inženjerstvo, a jedno od najčešće potrebnih mjerenja mikroba je broj (ili koncentracija) stanica u uzorku. Najčešća metoda za procjenu broja stanica u tekućoj suspenziji je uporaba mjerenja optičke gustoće (OD) na valnoj duljini od 600 nm (OD600) 1. Dominacija OD mjerenja nije iznenađujuća, osobito kod čitača ploča, jer su ta mjerenja izuzetno brza, jeftina, jednostavna, relativno ne ometaju, imaju visoku propusnost i lako su automatizirana. Alternativna mjerenja broja stanica-mikroskopija (sa ili bez hemocitometra), protočna citometrija, jedinice za stvaranje kolonija (CFU) i druga, npr. Vidi ref. 2,3,4,5 - nedostaju mnoga od ovih svojstava, iako neka nude i druge prednosti, poput razlikovanja održivosti i nepostojanja utjecaja staničnih stanja poput stvaranja inkluzijskog tijela, ekspresije proteina ili vlaknastog rasta 6.

Ključni nedostatak OD mjerenja je što oni zapravo ne pružaju izravno mjerenje broja stanica. Doista, OD nije čak ni linearno povezan s brojem stanica osim u ograničenom rasponu 7. Nadalje, budući da se fenomen temelji na raspršenju svjetlosti, a ne na apsorpciji, on je u odnosu na konfiguraciju određenog instrumenta. Stoga je za uspostavljanje mjerenja vanjskog tlaka s brojem stanica - ili čak samo za usporedbu mjerenja između instrumenata i pokusa - potrebno uspostaviti kalibracijski protokol, poput usporedbe s referentnim materijalom.

Iako su proučavani problemi tumačenja vrijednosti OD (npr., Reference 1,6,7), nijedna prethodna studija nije pokušala uspostaviti standardni protokol za pouzdano kalibriranje procjene broja stanica iz OD. Kako bi se procijenila pouzdanost, poželjno je uključiti veliki broj instrumenata i laboratorija, poput onih koji sudjeluju na međunarodnom natjecanju za genetski modificirane strojeve (iGEM) 8, gdje su organizirane stotine timova na srednjoj, preddiplomskoj i diplomskoj razini prethodno proučavati ponovljivost i umjeravanje za mjerenja fluorescencije u inženjeringu E coli 9,10. Budući da timovi iGEM -a imaju veliku varijabilnost u obuci i dostupne resurse, organiziranje međulaboratorijske studije s iGEM -om također zahtijeva da protokoli budu jednostavni, jeftini i visoko dostupni. Veliki opseg i velika varijabilnost među timovima također dopuštaju ispitivanje robusnosti protokola, kao i to koliko se lako problemi mogu identificirati i otkloniti pogreške u izvođenju protokola.

Tako smo organizirali opsežno međulaboratorijsko istraživanje u okviru iGEM-a za usporedbu triju kandidata protokola kalibracije OD: test jedinice za formiranje kolonija (CFU), de facto standardni test za određivanje usporedbe održivog broja stanica s koloidnim silicijem (LUDOX) i vodom, prethodno koristi se za normalizaciju mjerenja fluorescencije 9 i serijsko razrjeđivanje silicijevih mikrosfera, novi protokol temeljen na nedavnoj studiji rasta mikroba 7. Sveukupno, ova studija pokazuje da je serijsko razrjeđivanje mikrosfera silicijevog dioksida daleko najbolji od ova tri protokola u ispitanim uvjetima, dopuštajući vrlo preciznu, točnu i robusnu kalibraciju koja se lako procjenjuje radi kontrole kvalitete i također može ocijeniti učinkovit linearni raspon instrument. Stoga preporučujemo uporabu kalibracije mikrosfere silicijevog dioksida unutar linearnog raspona OD mjerenja za ćelije kompaktnog oblika i odgovarajućeg indeksa loma. Očekuje se da će usvajanje ove preporuke omogućiti učinkovitu uporabu OD podataka za procjenu broja stanica, usporedbu mjerenja čitača ploča s mjerenjima s jednim stanicama, poput protočne citometrije, poboljšanu replikabilnost i bolju međulaboratorijsku usporedbu podataka.


Uvod

Mjerenje krivulje rasta na temelju optičke gustoće (OD) jedna je od najčešće korištenih metoda u mikrobiologiji za praćenje rasta i proliferacije mikroba u vremenu, što omogućuje jednostavan, pouzdan i rutinski način razumijevanja različitih aspekata mikroba [1– 4]. Na primjer, koristilo se za rutinsko određivanje rasta bakterija i drugih mikroba tretiranih antibiotskim lijekovima i tvarima [5–9], za proučavanje reakcije mikroba na različite promjene okoliša i stresove [10–12] te za praćenje nakupljanje biomase tijekom fermentacije [13–15]. Tradicionalno, mjerenje krivulje rasta provodi se mjerenjem OD bakterije, koje je povezano s brojem stanica, u kivetama na valnoj duljini 600 nm pomoću fotometrije u željenim vremenskim točkama s intervalima od 30–60 min [3, 4] . Najnovije verzije koriste prednosti automatizacije i paralelnih mjerenja za postizanje bolje vremenske razlučivosti i veće propusnosti. Na primjer, u tu su svrhu razvijeni i korišteni turbidostati (ili kemostati ili morbidostati) [16–18]. Osim toga, čitači mikroploča s pločama sa 96 ili 384 jažice bili su sve korisniji za praćenje rasta mikroba [19] i istraživanje antimikrobne aktivnosti i mehanizma različitih lijekova i tvari. Na primjer, čitači mikroploča korišteni su za provjeru nekoliko tisuća E. coli mutanti s delecijama jednog gena i pružaju detaljan uvid u to kako bakterije reagiraju na različite nanočestice srebra (AgNP) [20, 21]. Osim bolje vremenske razlučivosti i veće propusnosti, još jedna prednost čitača mikroploča je ta što obično podržavaju multimodna mjerenja, pružajući prikladan način za praćenje fluorescencije (FL) istovremeno s OD [22, 23].

Unatoč sve većoj korisnosti, kvantitativne primjene čitača mikroploča za praćenje rasta mikroba opterećene su nekoliko prepreka i problema. Prvo, višestruko raspršivanje mikroba obično je ozbiljno i problematično pri mjerenjima OD-a temeljenim na čitaču mikroploča, budući da su se čitači mikroploča uglavnom koristili pri većoj gustoći kulture [2]. Kao primjer, reprezentativna OD krivulja an E. coli kultura iz čitača mikroploča sa 96 jažica prikazana je na slici 1A (crni krugovi), gdje je višestruko raspršivanje rezultiralo odstupanjima od tradicionalnih sigmoidnih (ili S-oblika) krivulja od mjerenja na bazi kivete. Odstupanja dovode do grešaka pri uklapanju krivulje rasta pomoću sigmoidnih modela (npr. Gompertzov model) [24]. Ovo bi se pitanje moglo potencijalno riješiti dobro osmišljenim, sofisticiranim kalibracijama pomoću čestica različitih veličina u različitim koncentracijama [2], međutim, takve sofisticirane kalibracije zahtijevaju znatne napore. Drugo moguće rješenje je korištenje vremenskog derivata OD krivulje, što je već pokušano [25], međutim sustavna istraživanja i dalje nedostaju, te je nejasno kako se vremenski derivat OD -a povezuje s parametrima rasta bakterija. Drugo važno pitanje je da u nekim studijama u kojima se istražuje odgovor mikroba na reagense, reagensi od interesa mogu značajno pridonijeti raspršenju ili apsorpciji na valnoj duljini na kojoj se mjeri OD i tako iskriviti krivulju OD. Na primjer, dodavanjem kubnih AgNP-a presvučenih polivinilpirolidonom (PVP) bakterijskoj kulturi ne samo da je vertikalno pomaknuta krivulja OD, već su unesene i nedostižne značajke, poput dodatnog vrha, u krivulju OD (slika 1B). Ti bi se problemi mogli djelomično riješiti upotrebom FL reportera u mikroorganizmima, pod pretpostavkom da interesantni reagensi ne ometaju FL reportere. Međutim, ostaje nejasno kako FL krivulje (slika 1A, zeleni kvadrati) izvještavaju o ponašanju rasta bakterija, poput vremena kašnjenja i brzine rasta.

(A) Reprezentativne krivulje optičke gustoće (OD – crni krugovi) i fluorescencije (FL – zeleni kvadrati) bakterijske kulture izmjerene multimodnim čitačem mikroploča sa 96 jažica. Multiple scattering is significant in microplate-reader measurements, resulting in deviations of the OD growth curves from traditional cuvette-based measurements, leading to failures in fitting the growth curve by sigmoid models (such as the Gompertz model, red dashed line). The fluorescent growth curve of the same bacterial culture, which does not show the standard sigmoid shape, is much less studied. (B) Representative OD curves of bacteria measured with a multimode 96-well microplate reader in the absence (black circles) and presence (blue squares) of AgNPs. The AgNPs in the bacterial culture scatter light and interact with growth media and/or bacteria, causing not only a vertical shift in the OD measurements but also elusive features (e.g., a high peak at short time) in the OD growth curve. Error bars (smaller than the symbols) stand for the standard error of the mean.

In this work, we developed a method for evaluating the growth of bacteria measured with multimode microplate readers. This method is based on the time derivatives of the OD and/or FL of the bacteria. Using quantitative models predicting the cell number and the number of fluorescent proteins as functions of time, we characterized the dependence of the first-order time derivative of OD and the second-order time derivative of FL on various parameters of the models, which are related to the commonly used lag time λ and maximum specific growth rate μ in growth curves of microbes. The current method is consistent with traditional mathematical fittings of sigmoid growth curves more importantly, it provides a better way for interpreting OD growth curves when the growth curve does not follow the well-established sigmoid shape due to multiple scattering. In addition, our method provides a framework for understanding the FL growth curves and for extracting the growth properties of bacteria from the FL measurements. The framework is especially useful when other components in the bacterial culture significantly contribute to the scattering and absorption (and therefore the OD). We demonstrated our method by applying it to the investigation of the lag time elongation observed in bacteria subjected to treatment with silver (Ag + ) ions. We observed that the results from our method corroborated very well with the traditional mathematical fittings of the OD curves. In addition, the current method was applied to the growth of bacteria in the presence of AgNPs at various concentrations, where the traditional growth measurements failed due to the high scattering, high absorption, and other interfering processes of the AgNPs. Our method allowed us to successfully extract the growth behavior of the bacteria from the FL measurements and understand how the growth was affected by the AgNPs.


Serial dilutions involve diluting a stock or standard solution multiple times in a row. Typically, the dilution factor remains constant for each dilution, resulting in an exponential decrease in concentration. For example, a ten-fold serial dilution could result in the following concentrations: 1 M, 0.1 M, 0.01 M, 0.001 M, and so on. As is evidenced in this example, the concentration is reduced by a factor of ten in each step. Serial dilutions are used to accurately create extremely diluted solutions, as well as solutions for experiments that require a concentration curve with an exponential or logarithmic scale. Serial dilutions are widely used in experimental sciences, including biochemistry, pharmacology, microbiology, and physics.

Solving Dilution Problems in Solution Chemistry CLEAR & SIMPLE – YouTubeThis video shows how to solve two dilution problems, using the standard dilution formula, M1V.1 = M2V.2.

Boundless vets and curates high-quality, openly licensed content from around the Internet. This particular resource used the following sources:


Understanding Concentration and Measuring Volumes

Solutions are utilized to some degree in almost all biological research applications. Therefore understanding how to measure and manipulate them is imperative to any experiment. In this video, concepts in preparing solutions are introduced. Solutions consist of a solute dissolved in solvent to yield a homogeneous mixture of molecular substances. Solutions are generally identified by their components and corresponding concentrations. Concentrated solutions are diluted through various methods, such as serial dilution. This video also lays a foundation for the accurate preparation of solutions. For example, the video reviews how to measure volumes with precision through use of the appropriate volumetric container as well as how to read the volume when a meniscus is present. Some applications for measuring volumes are then presented. Gel electrophoresis is a commonly used laboratory procedure which requires preparation of a percent weight volume solution as well as parallel dilution of a concentrated stock solution. Use of a serial dilution to prepare standards for generating a standard curve in protein quantitation is also demonstrated.

Postupak

Understanding the concepts behind solution concentration and measuring volumes in the lab are two important aspects of nearly every experiment.

Solutions are made up of a solute dissolved in solvent to yield a homogeneous mixture.

Solutions are generally identified by their components and corresponding concentrations.

To correctly arrive at the correct solution concentration, you must be familiar with the many different containers available for volume measurements.

Poor technique when measuring volumes can lead to incorrect concentrations and be the difference between a successful or failed experiment.

When performing experiments, it is imperative to know the exact concentration of solutions used.

Concentration is most commonly expressed as molarity. A one molar solution contains one mol of solute per liter of solution (B+C). When making solutions in the lab, the mols of solute can be determined from the measured mass of the molecule and its molecular weight.

Solutions can also be prepared and quantified as percent concentrations from the weight of solute per unit volume of solvent, known as a percent weight-volume solution.

Keep in mind that the solute is sometimes in liquid form. In this case, the percent concentration can be expressed as the volume of liquid solute per unit volume of solvent, referred to as a percent volume-volume solution.

For frequent use, concentrated solutions of stable compounds, known as stock solutions, can be prepared. Stock solutions may be labeled as a multiple of the concentration in the final working solution. Here you see a 10X solution.

These stock solutions can be diluted as necessary with solvent to achieve the desired concentration.

Alternatively, a dilution can be prepared from a more concentrated solution using a parallel dilution. Using this simple calculation, a solution of desired concentration and desired volume can be prepared from a stock solution of known concentration. The resulting volume can be diluted to the total volume of the solution to achieve the desired concentration.

However, in some situations, the dilution factor, which is equal to the final volume divided by volume of stock solution needed for the dilution, is too large. This makes parallel dilution impractical as the necessary volume of the stock solution would be too small to accurately measure.

With the serial dilution technique, a stock solution can be used to make a dilute solution, which can then be diluted further to make a more dilute solution and so on until the desired concentration is met.

When measuring volumes in the lab you will come across many containers that can hold liquid. However, it is important to realize that not all of these vessels are designed for accurately measuring volume.

Non-volumetric containers, such as beakers and Erlenmeyer flasks, are designed for mixing and storing solutions and are generally not calibrated. Instead, the measurements, or graduations, on the side represent approximations of liquid capacity.

Conversely, volumetric labware is designed to measure exact volumes of liquid substances. Volumetric labware is denoted with the capacity it is calibrated to hold as well as the letters TC or TD.

TC stands for “to contain” and is generally found on volumetric flasks and graduated cylinders, which are calibrated to hold a precise volume of liquid.

TD denotes “to deliver” and is usually found on measuring devices designed to dispense liquid, such as pipettes and syringes.

Volumetric flasks are generally used to prepare solutions of a specific concentration. After dissolving the solute, solvent is added to the flask until the total volume reaches the graduation line. Adding the “quantity sufficient” to reach this volume is known as Q.S.&rsquoing the solution.

When Q.S.&rsquoing the solution, the top of the liquid curves where it meets the flask. This is called the meniscus and is caused by surface tension. In an aqueous solution, the meniscus is concave, and should be read at the lowest point of the curve.

There are several vessels designed to measure and deliver specific volumes of liquid. When choosing volumetric labware, always select the smallest device that will accommodate the desired volume to achieve the highest accuracy.

When measuring volumes of liquid above 50 mL, graduated cylinders are the appropriate choice.

Serological pipettes are generally used to measure and deliver volumes in the range of 0.1 to 50 mL.

For volumes of 0.2 microliters to 5 mL, micropipettors should be used.

When plastic pipette tips are not compatible with the liquid to be measured, glass Hamilton syringes are an alternative for accurate measurement of volumes in the microliter range.

Now that we have covered the basics of working with solutions, we&rsquoll discuss how some of these concepts are applied in research.

DNA Gel electrophoresis is a technique used to separate a mixed population of DNA fragments, to estimate their size, by applying an electric field to move the negatively charged molecules through a gel matrix made of agarose – a carbohydrate from seaweed

In preparing the gel matrix, percent weight/volume solutions are commonly used to make 1% weight/volume agarose gels.

Generally electrophoresis requires large quantities of running buffers. Because of their frequent use and large volumes, these buffers are usually diluted from more concentrated 10x stock solutions.

To achieve the desired 1x buffer, one unit volume of the stock solution is diluted in 9 unit volumes of purified water.

In microplate reader experiments, the concentration of unknown samples of protein are often determined based on a set of samples of known concentrations called standards.

Serial dilutions are often used to generate standards of incrementally-higher concentrations, so that ultimately, a standard curve can be generated and the concentration of unknown sample determined.

You&rsquove just watched JoVE&rsquos introduction to understanding concentration and measuring volumes. In this video we reviewed some basic concepts such as calculating concentration, performing dilutions , and how different types of labware are used to measure volumes. Applications of some of the concepts introduced in this video were also discussed for molecular biology and biochemistry.

Thanks for watching and remember to always use accuracy and precision when measuring volumes.


  • Remove any spaces from catalog numbers. For example, instead of searching for "AZ 12345", try searching for "AZ12345".
  • We recommend using fewer words. For example, instead of searching for "Countess Automated Cell Counter", try searching for "Countess".
  • We recommend using broader or generic terms. You will be able to refine your search by using filters like product category, application, brand, and more.
  • Re-check spelling of search word(s), or use the auto-suggestion feature in the search box.

Detailed Search Tips

To perform a search, enter a few descriptive words, catalog number or product name. Search will return any documents or web pages containing any of the words from your query. You can refine or narrow your search by subtracting words from your query or using filtering within the top or left column.


CETP Activity Assay Standardization

Linear quantitation with Donor Particle from 130 to 8.125 pmoles.

Dispersion of the Donor Particle in isopropanol disrupts the particle core releasing unquenched fluorescent substrate. A serial dilution of the dispersed Donor Particle was added to a microplate and read at excitation 465 nm / emission 535 nm and the fluorescence was plotted as a function of substrate concentration in pmoles/well. The linear relationship between fluorescence and pmoles of substrate in this standard provides a quantitative output for assay results.