Informacija

Može li se RNA ekstrahirati iz tkiva suspendiranog u formalinu?

Može li se RNA ekstrahirati iz tkiva suspendiranog u formalinu?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dva uzorka tumora plutaju u 10% -tnoj otopini formaldehida (tj. Formalinu). Postoji li protokol za ekstrakciju RNA pod ovim okolnostima? Zabrinut sam da će korištenje protokola za tkivo ugrađeno u formalinski fiksirani parafin (FFPE) oštetiti RNK, budući da ne postoji parafin za uklanjanje ksilena.

Ako bih koristio protokol FFPE bez ksilena, trebam li homogenizirati tkivo prije uklanjanja formalina ili nakon toga?


Formaldehid tvori adukte s RNA, a može ga učiniti i osjetljivijim na razgradnju. Također može uzrokovati stvaranje unakrsnih veza između RNA i proteina (ili eventualno drugih RNA). Iz svih ovih razloga ekstrakcija visokokvalitetne RNA iz fiksnih uzoraka formaldehida vrlo je teška i prinosi su niski (Howat i Wilson, 2014.).

Pogledajte ovaj članak Evers i sur. (2011) koja istražuje optimalne uvjete za uklanjanje formaldehidnih adukata. Međutim, ovo istraživanje ne uključuje stvarnu ekstrakciju RNK iz fiksnih tkiva, što bi bilo još teže.

RNeasy FFPE Kit iz Qiagena tvrdi da je posebno dizajniran za ekstrakciju RNA iz fiksnih uzoraka formaldehida. Opis proizvoda kaže da pufer za lizu sadrži tvari koje poništavaju modifikacije nastale zbog formaldehida. Postoji sličan komplet tvrtke Thermo-Fisher. Russel i sur. (2013), izvijestili su da je prinos RNK bio sličan između fiksnih (korištenjem Qiagen RNeasy FFPE kompleta) i nefiksiranih uzoraka (koristeći Qiagen RNeasy Plus mini komplet za ekstrakciju ukupne RNA).

trebam li homogenizirati tkivo prije uklanjanja formalina ili nakon toga?

Homogenizirajte nakon uklanjanja formalina. Budući da su tkiva već krhka zbog fiksiranja formaldehida, ne morate koristiti oštre postupke homogenizacije. Lagano pipetirajte. Možete upotrijebiti proteinazu-K i DNAse za uklanjanje proteina i DNA (RNeasy kit uključuje ove korake).

Za buduće pokuse tkiva možete pohraniti u RNKkasnije otopina (Thermo-Fisher; ili slične formulacije drugih dobavljača/laboratorija). Pohranite jedan dio tkiva u formaldehid za IHC/ISH, a drugi u RNAkasnije za ekstrakciju RNA/DNA.


Primjena RT-PCR-a u tkivima raka pluća fiksiranim formalinom i parafinom

Za analizu ekspresije gena u tkivima raka pluća fiksiranih formalinom, parafinom ugrađenim modificiranom metodom.

Metode:

Ukupna RNA iz smrznutog tkiva ekstrahirana je reagensom TRIZOL. RNA je ekstrahirana iz tkiva fiksiranih formalinom, parafinom ugrađenih u probavu s proteinazom K prije kiselo-fenola: ekstrakcija kloroformom i taloženje nosača. Ovu smo metodu izmijenili korištenjem veće koncentracije proteinaze K i duljeg vremena probave, optimiziranog na 16 sati. RT-PCR i RT-PCR u stvarnom vremenu korišteni su za provjeru ponovljivosti i podudarnosti između smrznutih i parafinskih uzoraka.

Rezultati:

Rezultati su pokazali da je RNA ekstrahirana iz plućnih tkiva ugrađenih u parafin imala visoku kvalitetu s najvećom dužinom fragmenata između 28S i 18S traka (oko 1000 do 2000 baza). Domaćinski gen GUSB pokazao je niske varijacije ekspresije u smrznutim i parafinom ugrađenim plućnim tkivima, dok je PGK1 imao najmanju varijaciju u tkivima limfoma. Nadalje, PCR analiza u stvarnom vremenu ekspresije poznatih prognostičkih gena u karcinomu pluća nemalih stanica (NSCLC) pokazala je iznimno visoku korelaciju (r& gt0.880) između uparenih smrznutih i formalin-fiksiranih uzoraka, ugrađenih u parafin.

Zaključak:

Ova poboljšana metoda ekstrakcije RNA prikladna je za kvantitativnu RT-PCR u stvarnom vremenu i može se koristiti za globalno profiliranje ekspresije gena u tkivima ugrađenim parafinom.


Sažetak

Tkiva ugrađena u formalin fiksirana parafinom (FFPE) izvor su biološkog materijala za molekularna istraživanja. Zabilježeno je nekoliko metoda za ekstrakciju DNA iz tkiva FFPE. Ovaj je proces izazovan zbog formaldehidno induciranog umrežavanja proteina i DNA, kao i fragmentacije molekula kada se za fiksaciju koristi nebuferirani formalin. Ovdje su 2 metode za ekstrakciju DNA iz tkiva FFPE, temeljene na stupcima sa kelatnom smolom i membranama silicijevog dioksida, modificirane i uspoređene u njihovoj sposobnosti otkrivanja humanog citomegalovirusa (HCMV) u kongenitalnim infekcijama. Obje metode testirane su na 121 uzorku mozga, pluća, slezene i jetre izvedenih od 36 umrlih nedonoščadi. Odabrano je 12 pacijenata, a geni UL55 i UL75 HCMV otkriveni su lančanom reakcijom polimeraze u 16/36 uzoraka. Ove 2 metode predstavljaju koristan alat za oporavak DNK iz tkiva FFPE-a i molekularnu identifikaciju HCMV-a s prednošću niske cijene, minimalnih koraka, minimalne upotrebe uzoraka, bez otapala i jednostavne provedbe u laboratoriju.


Rezultati

Količina i kvaliteta aRNA dobivenih iz uzoraka FFPE u usporedbi s uzorcima FF. RNA iz uzoraka FF ili FFPE ekstrahirana je nakon struganja ili nakon hvatanja stanica pomoću mikrorodisekcije laserskog hvatanja (slika 1A). Prinos RNA nakon ekstrakcije bio je veći nakon struganja, što se i očekivalo na temelju broja stanica (slika 1B). Kako bismo utvrdili utječe li količina početnog materijala na prinos, radili smo amplifikacije koristeći raspon od 5 do 30 ng početne RNA. Za uzorke FFPE -a, ukupni prinos aRNA kretao se od 20 do 40 μg nakon dva kruga amplifikacije i na njega nije utjecala količina početnog RNA materijala. Za uzorke FF prinos se kretao od 60 do 200 μg i povećavao se s povećanjem količine početnog RNA materijala (slika 1B). aRNA iz oba tipa uzorka pokazala je sličan uzorak nakon elektroforetske separacije (slika 1C).

A, mikrodissekcija laserskog hvatanja. Uzorci FFPE pGBM obrađeni su za H & ampE bojenje radi identifikacije tumorskih stanica. Reprezentativne slike s pGBM snimljene su prije i nakon hvatanja tumorskih stanica iz istog presjeka, a prikazane su i snimljene stanice. B, Prinos RNK prije i poslije linearne amplifikacije u uzorcima FF i FFPE. RNA je ekstrahirana sa stakalca nakon mikrodisekcije struganjem ili laserskim zahvatom, a 5 do 10 ng je podvrgnuto dva kruga amplifikacije T7 RNA polimeraze. Prinos RNA bio je veći nakon struganja, a koeficijent amplifikacije konstantno je bio veći u FF u usporedbi s uzorcima FFPE. C, Ektroforetsko odvajanje aRNA iz uzoraka FF i FFPE. aRNA (2 μg) iz reprezentativnog broja uzoraka iz uzoraka FF i FFPE pGBM podvrgnuta je elektroforezi kako bi se procijenila prisutnost i veličina pojačanog materijala. Veličina aRNA bila je između 300 i 600 bp i slična je u oba izvora materijala. D, RT-PCR detekcija β-aktina, YB-1 i PDGFRβ gena na RNA ekstrahiranoj iz uzoraka pararafina. RT-PCR je učinjen korištenjem nasumičnih početnica i počevši od 200 ng aRNA. Referentni gen (β-aktin) koamplificiran je s PDGFRβ i YB-1 korištenjem gena specifičnih prajmera dizajniranih unutar posljednjih 300 baza svakog gena. Prikazani su svi uzorci od 16 pGBM FFPE i CB. β-aktin izražen je u svim uzorcima kako se očekuje, dok PDGFRβ i ekspresija YB-1 detektiraju se samo u nekim uzorcima. E, obrazac ekspresije YB-1 u FFPE pGBM. Imunohistokemijsko bojenje za YB-1 provedeno je na 14 pGBM i 2 CB. Bojenje protutijela na kraj protiv YB-1 COOH i bodovanje dijapozitiva izvedeno je kako je prethodno opisano (47). Bojenje potvrđuje rezultate dobivene RT-PCR-om na istim uzorcima.

Za procjenu kvalitete aRNA ekstrahirane iz bilo kojeg izvora materijala koristili smo Agilent Bioanalyzer 2100 Picochip. Oštri vrhovi 18S i 28S rRNA dobiveni su iz tkiva FF, a samo 18S ribosomski vrhovi dobiveni su iz tkiva FFPE u kombinaciji s karakterističnom promjenom profila RNA koja ukazuje na razgradnju (podaci nisu prikazani). Još uvijek smo radili RT-PCR testove koristeći prajmere dizajnirane za 3 ′ kraj gena koji su uključivali kućni gen, β-aktin i gene za koje smo ranije pokazali da su prekomjerno eksprimirani u podskupu smrznutog pGBM, PDGFRβ, i YB-1 (31). RT-PCR je učinjen na RNA nakon ekstrakcije te nakon prvog i drugog koraka amplifikacije. β-aktin bio prisutan u svim uzorcima, dok PDGFRβ transkript je viđen u nekim uzorcima u svim koracima (slika 1D). Podaci su u korelaciji s prethodnim nalazima dobivenim iz FF pGBM gdje PDGFRβ samo je u određenom broju uzoraka regulirano samo gore. YB-1 također je izražen u nekim uzorcima (slika 1D). Ono što je važno, rezultati za YB-1 u korelaciji s imunohistokemijskom analizom koja se radi paralelno na stakalcima iz istih uzoraka FFPE, pri čemu uzorci negativni RT-PCR-om ne pokazuju bojenje za YB-1, a pozitivni uzorci pokazuju povećanu ekspresiju proteina imunohistokemijom (slika 1E).

Ovi rezultati pokazuju da su prinos RNK, kao i kvaliteta ekstrahirane RNK, niži u uzorcima FFPE. Međutim, kao što je prethodno pokazano, čak i ako je RNA iz uzoraka FFPE razgrađena, analiza RNA se i dalje može obaviti na ovom izvoru materijala.

Profiliranje ekspresije gena iz uzoraka FFPE. Omjer 28S/18S, mjeren s pikočipom Bioagilent, može dati pogrešnu kategorizaciju prije analize mikrosreza (34). Na temelju rijetkosti uzoraka FF -a iz pGBM -a, odlučili smo provesti analizu mikro -niza na aRNA izdvojenoj iz uzoraka pFFM -a FFPE -a kako bismo dodatno potvrdili neovisni skup podataka o profilima ekspresije gena pGBM koje smo dobili na 14 uzoraka FF pGBM (27). Prilikom hibridizacije humanih 19K cDNA pjegavih nizova s ​​5 μg cDNA, uočeno je nekoliko specifičnih mrlja, u izrazitoj suprotnosti s uzorcima FF, pri čemu je broj pjega visokog intenziteta uvijek bio zadovoljavajući za visokokvalitetne hibridizacije. Stoga smo napravili hibridizacije koristeći raspon od 10, 15 i 20 μg cDNA za isti uzorak pGBM i kontrolu. S većim koncentracijama cDNA (15 ili 20 μg), dobiveno je više pozadinske buke, dok se broj mrlja koje pokazuju specifičnu hibridizaciju na stakalcu nije povećao (podaci nisu prikazani). Optimalni rezultati i ponovljivi rezultati na 13 od 16 uzoraka pFMP FFPE -a dobiveni su za 10 μg pojačane cDNA, čak i ako je, u usporedbi s aRNA iz uzoraka FF -a, pozadinska buka bila veća i vidljiv je znatno manji broj mrlja na stakalcima.

GeneSpringov alat Filter on Confidence identificirao je popis transkripata sa statistički značajnim promjenama u broju uzoraka FFPE pGBM u usporedbi s skupljenim kontrolama (Welch t test, P & lt 0,05 višestruka korekcija ispitivanja: Benjamini i Hochsberg, stopa lažnog otkrivanja od 3,4%). Ostali statistički algoritmi (Wilcoxon-Mann-Whitneyjev test značajne analize mikrosreza) testirani su sa sličnim rezultatima. Za uzorke FF ili FFPE pGBM dobiveni su različito izraženi transkripti između pGBM i CB. Analiza podataka pokazala je da je 777 transkripata različito izraženo u uzorcima FFPE-a u usporedbi s objedinjenom kontrolom i 3.647 moduliranih transkripata u uzorcima FF-a u usporedbi s CB-om skupljenim FF-om. Dvodimenzionalni graf i dvodimenzionalno hijerarhijsko grupiranje organizirali su i vizualizirali profile ovih različito reguliranih transkripata (Y os) iz svakog od 13 uzoraka FFPE pGBM i prethodno prijavljenih 14 uzoraka pFMF FFPE (x osi sl. 2B i C, ref. 27). I grafikon koji predstavlja različito izražene transkripte između uzoraka pGBM i združenih kontrola i stablo klastera ovih različito izraženih transkripata pokazuju da se značajan broj transkripata gubi u FFPE -u u usporedbi s uzorcima FF -a. Također, kao što je prikazano na dvodimenzionalnom grafikonu, stablu grupiranja i grafikonu raspršenosti svih uzoraka iz oba izvora materijala, transkripti iz uzoraka FFPE ukazuju na smanjenu promjenu nabora u odnosu na CB u usporedbi s istim transkriptima iz FF uzorci (slika 2A). Unatoč tim razlikama u broju različito izraženih transkripata i promjeni nabora te upotrebi različitih kontrola, ipak smo pronašli razumnu povezanost R 2 = 0,649 između oba tipa uzorka. Ono što je važno, sličan uzorak profila ekspresije gena održan je između uzoraka pGBM FF i FFPE: transkripti koji su bili prekomjerno izraženi (boja označena crvenom bojom) u uzorcima FF također su bili prekomjerno eksprimirani u FFPE, i obrnuto, transkripti koji su bili niže regulirani u oba tipovi uzoraka bili su slični (boja označena zelenom slikom 2B i C). To ukazuje na to da, čak i ako gubimo brojne različito regulirane transkripte u uzorcima FFPE -a u usporedbi s uzorcima FF -a, kao i opseg promjene nabora, zadržavamo sličan obrazac izraza za značajne različito regulirane transkripte u FFPE -u uzorci.

Profiliranje ekspresije gena uzoraka FFPE reproducira obrazac profila ekspresije dobiven na uzorcima FF pGBM. A, profilne sličnosti između različitih podskupina GBM -a. Raspršeni dijagrami uspoređuju promjenu u broju transkripata između parova podskupina pGBM: FF pGBM (lijevo), FFPE (srednji), i FFPE u odnosu na FF (pravo). Transkripti obojeni crvenom bojom (regulirano prema gore) i plavo (prema dolje regulirano) pokazuju statističku promjenu u broju između para podskupina GBM analiziranih u odnosu na kontrolu (velški t test, Podrezati & lt 0,05 ispravak višestrukog testiranja: Benjamini i Hochsberg False Discovery Rate). Grafikoni raspršenja intenziteta Log 2 generirani su pomoću neobrađenih podataka o intenzitetu, a Pearsonovi koeficijenti korelacije izračunati su za uzorke FF u odnosu na uzorke FFPE (lijevo r = 0.649). B, hijerarhijsko grupiranje sondi bez nadzora sa statistički značajnom promjenom u broju transkripata (velški t test, P & lt 0,05 Benjamini i Hochsberg) između FF pGBM, FFPE pGBM i bazena normalnog moždanog tkiva (x osi) pokazuje smanjenje broja i promjenu profila transkripta u uzorcima FFPE (sonde na Y os). Svaka eksperimentalna točka podataka obojena je prema promjeni omjera fluorescencije: obilnija u pGBM (Crvena) i manje obilne boje (zelena). C, dvodimenzionalno hijerarhijsko grupiranje 486 sondi koje pokazuju najveću statistički značajnu promjenu u broju transkripata između parova uzoraka u uzorcima FF (Welsch t test, P & lt 0,05 Benjamini i Hochsberg, vidjeti Dodatne popise gena) pokazuje da je uzorak prekomjerno eksprimiranih/sniženih gena sličan u uzorcima FFPE. Svaka eksperimentalna točka podataka obojena je prema promjeni omjera fluorescencije: obilnija u pGBM (Crvena) i manje obilne boje (zelena). D, Vennov dijagram različito reguliranih transkripata u odnosu na skupljeni CB u uzorcima FFPE pGBM (n = 777) i u uzorcima FF (n = 3847 Welch t test, P & lt 0,05) pokazuje značajno preklapanje (n = 606) između oba popisa transkripata (dopunski popisi gena).

Analiza profila ekspresije gena iz uzoraka FFPE odražava rezultate dobivene iz uzoraka FF. Zatim smo upotrijebili Vennove dijagrame za usporedbu popisa značajno moduliranih transkripata za oba skupa uzoraka koje smo generirali pomoću P-granična vrijednost od 0,05. Ova granica je izabrana jer je mnogo transkripata na rubu statističke značajnosti propustio strožiji P vrijednost, kao što je prethodno opisano u studijama koje uspoređuju različite platforme ili RNK iz različitih materijalnih izvora s promjenjivom osjetljivošću za otkrivanje transkripata, uključujući slabo izražene gene (34–38). Vidjeli smo preklapanje između oba popisa gena od 606 gena koje dijele dvije podskupine uzoraka pGBM, što daje značaj preklapanja od 1,0e -09 prema Fischerovom točnom testu (slika 2D dopunski popisi gena). Analizirali smo skup podataka pomoću prikaza na razini modula dobivenog iz „zbirke karcinoma“ (39), a također smo organizirali genske skupove koristeći GoMiner, računalni resurs koji uključuje hijerarhijsku strukturu konzorcija genske ontologije (2) za automatiziranje funkcionalnosti kategorizacija popisa gena na temelju bioloških procesa. Obje metode imaju za cilj destilirati viši red s velikog popisa gena. Oni su dali slične rezultate, pokazujući da se moduli i termini ontologije gena preklapaju za prvih 15 kategorija dobivenih na značajno moduliranim transkriptima iz skupova podataka FF i FFPE (Tablica 2). Korištenje različitih CB moglo bi djelomično objasniti nedostatak potpunog preklapanja između obje vrste uzoraka na popisima gena. Prethodno smo za uzorke FF -a utvrdili da različiti CB imaju slične, ako ne i potpuno preklapajuće profile ekspresije gena (Pearsonova korelacija, r = 0,93). Prilikom kategorizacije prirode ovih 171 gena prema ontološkim procesima gena, oni su uglavnom grupirani u kataboličke transkripte (dopunski popisi gena). Kad smo pogledali statistički značajne transkripte prisutne na oba popisa gena, većina gena koje smo potvrdili qRT-PCR-om u uzorcima FF-a i odlučili nastaviti na temelju njihovog potencijalnog sudjelovanja u onkogenezi pGBM-a također je bila prisutna pri analizi značajno moduliranih transkripti u uzorcima FFPE (Tablica 3 Dodatni popisi gena).

Klasifikacija ontologije gena pomoću onkološkog kopača gena različito izraženih transkripata u odnosu na skupljene CB -ove uzoraka FF i FFPE pGBM

Popis 100 najboljih različito izraženih transkripata u odnosu na skupljene CB -ove zajedničke za FF i FFPE pGBM

Ranije smo pomoću FF uzoraka pokazali da postoje najmanje dvije prognostičke podskupine pGBM koje se mogu molekularno odvojiti na temelju njihove povezanosti ili ne s dokazima koji su u skladu s aberantnim Ras aktivnim putem. Prisutnost fosforiliranih efektora Ras, uključujući pErk1/pErk2, fosforiliranu MAP/ERK kinazu 1/MAP/ERK kinazu 2 i fosforilirani Raf, ispitana je Western -om u uzorcima FF -a i pozitivno obojenje pErk1/pErk2 imunohistokemijom u uzorcima FFPE -a smatra se u skladu s aktivacijom Ras (slika 3A, ref. 27, 32). Kako bi se ovi nalazi dodatno potvrdili, ista je analiza provedena na uzorcima FFPE -a koristeći PCA, metodu smanjenja podataka u kojoj se visoka dimenzionalnost podataka smanjuje na dvije do tri vidljive dimenzije koje predstavljaju linearne kombinacije gena koje čine većinu varijance skupa podataka i koji omogućuje vizualizaciju sličnosti unutar uzoraka. Slično našim nalazima u uzorcima FF (27), PCA je razdvojila oba skupa uzoraka FFPE i FF pGBM u dvije skupine, što ukazuje na prisutnost najmanje dvije različite populacije pGBM (slika 3B). Dvije populacije pGBM segregirane pomoću PCA povezane su s dokazima u skladu s različitom aktivnošću Ras u uzorcima (slika 3B). Također, ANOVA testiranje uspjelo je identificirati transkripte koji su mogli razlikovati tumore povezane s različitom aktivnošću Ras u uzorcima FF i FFPE, dok je pokazao značajan stupanj korelacije između zamrznutog i FFPE (linearna korelacija na dijagramima raspršenja, slika 3C).

Uzorci tumora pokazuju različite profile ekspresije koji koreliraju s aktivacijom Ras puta. A, imunohistokemijske analize za pErk, glijalni fibrilarni kiseli protein (astrocitni marker) provedene su za 16 uzoraka pGBM uključenih u ovu studiju. Uzorci su numerirani kao u tablici 1 i na slici 1D. B, 13 uzoraka FFPE i 14 FF pGBM podvrgnuto je PCA na temelju profila ekspresije izmjerenog na 15.068 pojedinačnih sondi. Trodimenzionalni prikaz PCA komponenti 1, 2 i 3 razlikovao je Ras rezultate pedijatrijskih tumora bez obzira na prirodu izvora uzorka. Uzorci su kodirani bojama radi jasnoće: pGBM uzorci povezani s aktivnim Ras putem (Crvena, FFPE tamno plava, FF) pGBM uzorci nisu povezani s aktivnim Ras (žuta boja, FFPE svijetlo plava, FF). Tri uzorka FFPE s aktivnim Ras putem za koji smo imali dovoljno materijala tretirani su u dva primjerka s odvojenom ekstrakcijom, amplifikacijom i hibridizacijom RNA. Slično su migrirali na PCA grafikonu, dodatno potvrđujući ponovljivost analize ekspresije gena na uzorcima FFPE. C, ANOVA je identificirala različito izražene transkripte u oba izvora uzorka na temelju njihove povezanosti/nedostatka povezanosti s aktivnim putem Ras. Grafikoni raspršenja intenziteta Log 2 generirani su pomoću neobrađenih podataka o intenzitetu, a Pearsonovi koeficijenti korelacije izračunati za FF u odnosu na uzorke FFPE povezane s aktivacijom Ras (r = 0,651) i uzorci pGBM koji nisu povezani s aktivacijom Ras (r = 0.712).


Rasprava

Od njihovog otkrića, analiza miRNA općenito se provodila na smrznute ili svježe uzorke, koristeći varijabilne tehnike, uključujući mikročip, analizu sjevernog blota i PCR [2]. Tkiva FFPE -a, kao lako dostupan izvor, mogla bi biti neprocjenjiva u izvođenju analize ekspresije miRNA da se njihova ekspresija zadržala nakon obrade. U ovom smo istraživanju usporedili profiliranje miRNA provedeno na svježim uzorcima i FFPE koristeći tehnike kvantifikacije RT-PCR matične petlje u modelu stanične linije. Otkrili smo da se profiliranje miRNA može izvesti na rutinski fiksiranim FFPE blokovima.

Brojnost miRNA u FFPE

Neki su laboratoriji ispitivali profile ekspresije gena mRNA koristeći RT-PCR u stvarnom vremenu u uparenim uzorcima tkiva zamrznutim i FFPE [7-10]. Opći je konsenzus da je detekcija mRNA iz arhivskog materijala ograničena zbog labilne prirode mRNA i štetnih učinaka enzimske fragmentacije tijekom dugih razdoblja skladištenja i modifikacije RNA inducirane fiksacijom formalina. Nakon toga, predloženo je da mali amplikoni [11] (kraći od

130 [7, 9] nukleotida) mogli bi biti korisni kao robusni markeri u studijama ekspresije gena pomoću tkiva FFPE. Doista, naši vlastiti pokusi (podaci nisu prikazani) potvrdili su ovaj fenomen koristeći mRNA mete u rasponu veličina amplikona u ovom modelu stanične linije. Na primjer, ekstrakti FFPE proizveli su Cts 4 do 10 ciklusa više od njihovih zamrznutih kolega, ovisno o veličini amplikona koji se koriste (62 do 164 bp). Ctovi između FFPE -a i snap zamrznutog bili su bliži za male amplikone od onih za velike amplikone. Na primjer, analiza GAPDH -a pomoću ciljnog amplikona od 67 bp pokazala je srednju razliku od 4,28 ciklusa, dok je test dizajniran za isti gen (GAPDH) koristeći ciljanu veličinu amplikona od 122 bp pokazao srednju razliku od 6,51 Cts između FFPE -a i snapa smrznuti materijal.

miRNA imaju prednost male veličine, jer su dugačke samo približno 20 do 22 nukleotida. Osim toga, proteini su zaštićeni kompleksom RISC. Posljedično, oni možda nisu tako osjetljivi na razgradnju RNA kao mRNA u tkivima FFPE. Naši su rezultati pokazali da je količina miRNA u ukupnoj RNA ekstrahiranoj iz FFPE -a bila veća od one ekstrahirane iz snap smrznutih stanica kada su ulazne količine ukupne RNA bile identične. Prosječna količina miRNA izvedenih iz ukupne RNA ekstrahirane iz FFPE-a bila je dvostruko veća (za jedan Ct niža) nego u snažno smrznutim stanicama, što je najvjerojatnije posljedica metilolskih unakrsnih veza između RNA i proteina unesenih tijekom obrade.

Za analizu smo izdvojili identične količine ukupne RNA (10.000 ng). U praktičnom smislu, to je zahtijevalo unos gotovo deset puta većeg broja ćelija FFPE (2 × 10 6 ćelija) u usporedbi sa zamrznutim zamrzavanjem (1,7 × 105 ćelija). Ova razlika u izvađenim prinosima bila je u skladu s prethodnim izvješćima. To sugerira da količina RNA koja se može ekstrahirati iz tkiva FFPE predstavlja samo dio onoga što se može dobiti iz svježe smrznutog tkiva [9]. Zaostale umrežene veze u svakoj molekuli RNA koje nisu uklonjene probavom proteinaze K sprječavaju ekstrakciju ove RNA (slika 3). Što je molekula RNK dulja, veća je vjerojatnost da će unakrsna veza i dalje postojati nakon postupka probave proteinaze K. Stoga su male molekule RNA podložnije ekstrakciji od većih molekula mRNA što rezultira većom ekspresijom miRNA u FFPE u usporedbi s onom u "snap smrznutom".

Shematski prikaz utjecaja unakrsnih veza na ekstrakciju RNK. U materijalima od FFPE-a, RNA je kemijski modificirana metilolnim skupinama kako bi stvorila umrežene veze s proteinima. Digestija s proteinazom K [6], nakon koje slijedi ispiranje stupca, uobičajena je metoda koja se koristi za ekstrakciju RNA iz FFPE. Međutim, dio RNA ostaje nepropustan za ekstrakciju zbog neuklonjenih poprečnih veza. Što je dulja molekula RNA, veća je vjerojatnost da će unakrsne veze ostati nakon postupka probave. Stoga je lakše izdvojiti male molekule RNA od većih iz arhivske građe.

Pouzdanost miRNA u FFPE

Vjerojatno je pretpostaviti da su vrste miRNA manje osjetljive na razgradnju RNA povezane s obradom tkiva nego što se to događa s mRNA, a to je formiralo hipotezu koju će se ispitati u ovoj studiji. Našli smo dobru korelaciju razine ekspresije miRNA između FFPE i snap smrznutih stanica s R2> 0,95. Naši su podaci pokazali da je za većinu miRNA ekspresija u FFPE -u usporediva sa snap -zamrznutim stanicama. 65,58% miRNA pokazalo je ΔΔCts u rasponu između +/- 1 što ukazuje da su ti normalizirani profili u biti identični između dva uzorka.

Međutim, bilo je nekih izdvojenih podataka u kojima je postojala slaba korelacija između profila ekspresije za uparene uzorke smrznute i FFPE. Najznačajniji od njih bio je mir-146 sa smanjenom ekspresijom i mir-302b* s povećanom ekspresijom. Ove bi se promjene mogle dogoditi tijekom postupka fiksacije formalinom ili mogu biti uzrokovane postupkom nakon fiksacije. prekomjerna ekspresija mir-146 pronađena je u PTC tkivima [12], a također se sugerira da je uključena u stanični stres [13] i urođene imunološke odgovore [14]. Zanimljivo je da smo otkrili da je smanjen u stanicama Nthy-ori ekstrahiranim FFPE-om. Za te prekomjerno eksprimirane miRNA moguće je da su prekursori miRNA mogli biti cijepani pomoću RNaze da bi proizveli pozitivne signale jer se blokovi FFPE često skladište na sobnoj temperaturi u odsutnosti okoliša bez RNaze. Alternativno, povećani stanični stres nakon berbe i tijekom procesa fiksacije mogao je pridonijeti promijenjenim obrascima ekspresije u specifičnim miRNA. U tim se slučajevima materijal FFPE još uvijek mogao koristiti za usporedbu relativnih uzoraka ekspresije miRNA ako je niz poznatih blokova fiksiran i rukovan istodobno ili na isti način.


Može li se RNA ekstrahirati iz tkiva suspendiranog u formalinu? - Biologija

Proteomska analiza tkiva ugrađenog u formalin fiksiranog parafinom (FFPE) omogućila bi retrospektivna istraživanja biomarkera ove ogromne arhive patološki okarakteriziranih kliničkih uzoraka koji postoje u cijelom svijetu. Ova FFPE tkiva su, međutim, otporna na proteomska istraživanja koja koriste mnoge najsuvremenije metodologije uglavnom zbog visoke razine kovalentno umreženih proteina koji proizlaze iz fiksacije formalina. Nova tehnika mikrodisekcije tkiva razvijena je i kombinirana s metodom za ekstrahiranje topljivih peptida izravno iz tkiva FFPE za masenu spektralnu analizu raka prostate (PCa) i benigne hiperplazije prostate (BPH). Identificirane su stotine proteina iz tkiva PCa i BPH, uključujući nekoliko poznatih markera PCa, poput antigena specifičnog za prostatu, fosfataze prostate i inhibitora citokina-1 makrofaga. Kvantitativno proteomsko profiliranje pomoću označavanja stabilnih izotopa potvrdilo je slične razine ekspresije prostate-specifičnog antigena i fosfataze prostatične kiseline u BPH i PCa stanicama, dok je ekspresija citokina-1 koja inhibira makrofage veća u PCa u usporedbi s BPH stanicama.


Analiza uzorka FFPE vs FF

Kako bi se procijenila robusnost DASL WG platforme za analizu uzoraka FF i FFPE, izračunata je korelacija između različitih vrsta uzoraka. On se kretao između 0,83 i 0,89 za sve sonde, a poboljšao se na 0,96 𠄰,98 nakon odabira gena koji je proveden kako je opisano u odjeljku o metodama (Sl.   1 i ​ i2, 2, Tablica   1) .

Raspršeni dijagrami koji pokazuju korelacije ekspresije gena između uzoraka FF i FFPE procijenjenih pomoću DASL WG testa, nakon odabira sondi s najboljim učinkom

Hijerarhijsko grupiranje pomoću sondi s najboljim performansama pokazalo je značajnu homogenost, pri čemu su se profili četiri uzorka (99085, 99028, 99066 i 99025) grupirali zajedno, neovisno o podrijetlu (sl.   3). Bilo je izdvajanja, ali to su obično bili uzorci s manjim brojem gena koji su pouzdano otkriveni.

Hijerahijalno grupiranje uzoraka procijenjenih pomoću DASL WG testova. Uzorci FFPE & FF ocijenjeni korištenjem DASL WG testa grupirani zajedno u većini uzoraka (napomena 99028 ਏ je izvanredna vrijednost jer je otkriveno vrlo malo sondi)

DASL WG test i Illumina BeadArray

Za usporedbu dviju platformi procijenjena je korelacija između svih sondi u DASL WG i BeadArray. Korelacija se kretala između 0,80 i 0,82, a poboljšala se na 0,83 𠄰,89 kada su za analizu korištene samo sonde s najboljim učinkom (Tablica   1).

Iako su podaci DASL WG testa (koristeći uzorke FFPE i FF) i BeadArray (koji koriste samo uzorke FF) dvije neovisne platforme, hijerarhijsko grupiranje korištenjem svih sondi pokazalo je da su uzorci grupirani prema izvoru uzorka RNA i korištenoj platformi niza. Zapravo, svi uzorci FFPE -a bili su bliže zajedno u hijerarhijskom stablu grupiranja u usporedbi s uzorcima FF -a ocijenjenim s BeadArray -om. Zanimljivo je da se uzorci FF -a koje su ocijenili Illumina BeadArray i DASL WG nisu grupirali jedan pored drugog, već u dvije različite skupine.

Kad se analiza ponovila pomoću samo sondi s najboljim učinkom (kako je opisano u Metodama), usklađeni uzorci FF i FFPE grupirani zajedno (slika   4). Ovo je jedno od prvih istraživanja koje je snažno pokazalo ovo značajno preklapanje pomoću DASL -a i BeadArray -a. Četiri od pet tumora u kojima je procijenjena ekspresija gena korištenjem i illumina BeadArray i DASL WG grupirani su zajedno.

Hijerarhijsko grupiranje uzoraka FF i FFPE procijenjenih pomoću DASL WG testa i uzoraka FF procijenjenih pomoću Illumina BeadArray. Ovo pokazuje značajno grupiranje uzoraka FF i FFPE, bez obzira na to koriste li se DASL WG ili BeadArray (naznačeno samo brojem)

Analiza gena ontologije poduzeta je kako bi se procijenile sonde koje su bile diskontinuirane u uzorcima FF i FFPE radi boljeg razumijevanja uključenih bioloških procesa (Dopunska datoteka 1). To je pokazalo da su što se tiče biološkog procesa: primarni metabolički proces i metabolički proces nukleinske kiseline dva najbolja u ovoj kategoriji. Dok su vezanje poli (A) RNK i zgrušavanje hetercikličke RNA bile prve dvije molekularne funkcije obogaćene u ovoj skupini.


Poboljšanje ko-ekstrakcije DNA i RNA iz uzoraka ugrađenih u formalin fiksiranih parafinom (FFPE)

Dobivanje visoke kvalitete i visokog prinosa DNK ili RNK izazov je budući da su nukleinske kiseline u uzorcima tkiva FFPE često fragmentirane i sklone kemijskim modifikacijama. Su-ekstrakcija je korisna jer uzorci mogu biti ograničeni. Iako postoji mnogo setova za pročišćavanje DNK ili RNK iz uzoraka FFPE, samo nekoliko njih može pročistiti i DNK i RNK iz istog uzorka.

Na ovom webinaru promatramo usporedbe triju kompleta za izolaciju nukleinskih kiselina i učimo o različitim metodologijama ekstrakcije nukleinskih kiselina za koekstrakciju DNA i RNA iz istog uzorka FFPE-a te uspoređujemo analizu njihovog prinosa, kvalitete i podataka o NGS-u.

Za pregled ovog videozapisa omogućite JavaScript i razmislite o nadogradnji na web preglednik koji podržava HTML5 video

Predstavio:

Nelson Cotrim

Nelson Cotrim (MSc) is a Product and Application Scientist at Omega Bio-tek, Inc, responsible for providing technical support for customers and distributors as well as installing, validating and training of nucleic acid purification solutions on high throughput automated platforms. Previously, he served as Research Assistant at Oxford Nanoimaging and Development Scientist at Healthcare Diagnostics where he developed the point of care diagnostic devices based on either nucleic acid amplification or using single-molecule fluorescence techniques. Nelson obtained his Masters of Science in Genetics and Molecular Biology from the University of São Paulo, Brazil working with human genetic diseases and population genetics in the African-Brazilian isolated population. He has served as a Genetic Technologist at the Institute of Medical Genetics analyzing results of NGS and Sanger sequencing assays for human genetic disease diagnostics. He has also authored several peer-reviewed journal papers.


Improving DNA and RNA co-extraction from Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples

Obtaining high quality and high yielding DNA or RNA is challenging since nucleic acids in FFPE tissue samples are often fragmented and prone to chemical modifications. Co-extraction is beneficial as samples may be limited. While there are many kits to purify either the DNA or RNA from FFPE samples, only a few can purify both DNA and RNA from the same sample.

In this webinar, we look at comparisons of three nucleic acid isolation kits and learn about the different nucleic acid extraction methodology to co-extract DNA and RNA from the same FFPE sample and comparing analysis of their yield, quality, and NGS data.

To view this video please enable JavaScript, and consider upgrading to a web browser that supports HTML5 video

Presented by:

Nelson Cotrim

Nelson Cotrim (MSc) is a Product and Application Scientist at Omega Bio-tek, Inc, responsible for providing technical support for customers and distributors as well as installing, validating and training of nucleic acid purification solutions on high throughput automated platforms. Previously, he served as Research Assistant at Oxford Nanoimaging and Development Scientist at Healthcare Diagnostics where he developed the point of care diagnostic devices based on either nucleic acid amplification or using single-molecule fluorescence techniques. Nelson obtained his Masters of Science in Genetics and Molecular Biology from the University of São Paulo, Brazil working with human genetic diseases and population genetics in the African-Brazilian isolated population. He has served as a Genetic Technologist at the Institute of Medical Genetics analyzing results of NGS and Sanger sequencing assays for human genetic disease diagnostics. He has also authored several peer-reviewed journal papers.


Dodatne informacije

Autorski prilozi

JL performed the RNA extraction and TaqMan ® analysis and wrote original and final versions of the manuscript. PS, SC helped with the extraction and TaqMan ® analysis. PS, RF, KD helped draft the manuscript. KD, SA carried out cell culture. MP, SG helped with the analysis of the data. JOL and OS conceived the study and helped write the original and final versions of this manuscript. Svi su autori pročitali i odobrili konačni rukopis.