Informacija

Dodamo li samo 1 primer u PCR

Dodamo li samo 1 primer u PCR



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Što bi se dogodilo ako PCR -u dodamo samo jedan primer, recimo prednji premaz?

(Zasluge za sliku: Wikipedia) Kao što je iz slike jasno, potrebni su nam i početni i obrnuti početni premazi kako bismo uspjeli (osim ako nemamo takav slijed da jedan osnovni premaz može raditi i naprijed i natrag). Ovdje sam na internetu pročitao da će uključivanje jednog primera rezultirati linearnim pojačanjem, ali mislim da pojačanja uopće ne bi trebalo biti. Možete li mi pomoći riješiti moju sumnju?


Mislim da bi se trebalo dogoditi sljedeće: Ne bi bilo pojačanja, ali dobit ćemo n kopija jednolančane DNA nakon n ciklusa i jedinu dvolančanu DNA s započetom, ali s novom komplementarnom niti.


Korištenje 1 temeljnog premaza rezultirat će linearnim pojačavanjem izvornog niza u svakom ciklusu: temeljni premaz će voditi jedan niz polimeraze. Za razliku od "lančane reakcije" u PCR -u koja je eksponencijalna. Stoga s jednim primerom linearno pojačavate recimo x40 puta veći izvorni broj molekula s kojima ste započeli, dok s dva primera dobivate eksponencijalnu vrijednost (~ 240) pojačanje. U pravu ste da je s jednim primerom pojačanje zanemarivo, gotovo nevidljivo.


Lančana reakcija polimeraze

David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, u Molekularna biologija (drugo izdanje), 2013

Modificirane PCR tehnike rješavaju probleme

Degenerirani početnici se koriste kada je poznat samo dio ciljnog niza. U tim je temeljnim premazima mješavina baza prisutna u zadanom položaju na temeljnim premazima. Na taj način postoji šansa da u smjesi degeneriranih primera postoji barem jedna sekvenca koja može vezati metu.

DNA početnice za PCR ne moraju biti komplementarne svojim ciljnim sekvencama. Ako većina baza u temeljnom premazu može vezati metu, to je obično dovoljno za PCR. Zbog toga se početnici često konstruiraju tako da sadrže mjesta restrikcijskih enzima ili druge sekvence na svom 5´ kraju. Krajnji rezultat toga je da proizvodi PCR -a sadrže mjesta restrikcijskih enzima (na primjer), koja se mogu koristiti u sljedećim tehnikama.

Dulji ciljni nizovi mogu se pojačati promjenom vremena produženja i vrste DNA polimeraze.

PCR dugog dometa varijacija je normalne amplifikacijske metode PCR-a koja se koristi kada su ciljne sekvence iznimno dugačke. U PCR je učinjeno nekoliko jednostavnih izmjena tako da se ti ciljevi mogu pojačati.

Taq polimeraza ne lektorira. Kod dužih meta, ako je Taq polimeraza jedini enzim koji se koristi, mogućnost akumulacije mutacija je veća. Međutim, Pfu i druge polimeraze rade lekture. Dakle, upotrebom mješavine Taq i Pfu povećava se vjernost konačnog PCR proizvoda.

Dodatne promjene u reakcijskim vremenima procesa također su najvažnije u proizvodnji dugačke mete. Vrijeme produženja često se produžuje s 1-2 minute na 10-20 minuta svakog ciklusa. To omogućuje polimerazi da se nastavi duž cijele duljine dugačke mete. Dodatno, korak denaturacije se smanjuje na samo nekoliko sekundi kako bi se zaštitile neke dušične baze od stalne izloženosti toplini, koja bi mogla oštetiti purine (gvanin i adenin).

Inverzni PCR pojačava nepoznate sekvence stvaranjem kružnog DNA uzorka.

Tijekom inverznog PCR -a restrikcijski enzim reže se s obje strane poznate sekvence. Dva ljepljiva kraja zatim se ponovno povežu kako bi nastala kružna molekula. Primeri za ovu varijaciju PCR -a dizajnirani su tako da se protežu jedan prema drugom prema van, za razliku od produženih jedan prema drugom. Posljedično, tijekom PCR -a polimeraza se proteže jedna u smjeru kazaljke na satu, a druga u smjeru kazaljke na satu. Na taj se način nepoznata područja mogu pojačati.


PCR početnice su dizajnirane samo za replikaciju sekvence gena N virusnog genoma. Dio N slijeda koji želimo pojačati prikazan je dolje. Obično dizajnirate dva primera, jedan koji se veže za svaki lanac dsDNA. Kopije se izrađuju od svakog lanca tako da dobijete dvostruko više DNK iz procesa PCR -a. Potencijalna mjesta primera zabilježena su dolje prikazanim nukleotidnim nizovima. PCR mora napraviti kopije nukleotida prikazanih u sredini ("87 nukleotida"). Sjetite se smjera u kojem DNA polimeraza sintetizira nove niti DNK. Odaberite dva mjesta na koje se početnice vežu, a zatim ispunite ispravan slijed ispod prikazanog slijeda DNA. Trebali ste odabrati jedno mjesto na svakoj niti. Navedite smjer u kojem će se kretati DNA polimeraza (Taq polimeraza) nakon vezanja za početnike na priloženoj slici

PCR početnici su dizajnirani samo da repliciraju sekvencu gena N virusnog genoma. Dio N slijeda koji želimo pojačati prikazan je dolje. Obično dizajnirate dva primera, jedan koji se veže za svaki lanac dsDNA. Kopije se izrađuju od svakog lanca tako da dobijete dvostruko više DNK iz procesa PCR -a.

Potencijal lokacije primera označene su nukleotidnim sekvencama prikazanim u nastavku.

PCR mora napraviti kopije nukleotida prikazanih u sredini ("87 nukleotida").

Sjetite se smjera u kojem DNA polimeraza sintetizira nove niti DNK. Odaberite dva mjesta za vezivanje početnica, a zatim ispunite ispravan slijed ispod prikazanog slijeda DNA. Trebali ste odabrati jedno mjesto na svakoj niti.

Navedite smjer u kojem DNK polimeraza (Taq polimeraza) će se pomaknuti nakon vezanja za početne slojeve na priloženoj slici

puni zaslon

PROJEKTIRANJE I PROVEDBA

Kako bi se maksimalno iskoristili resursi poslužitelja, PCRTiler je implementiran kao višenavojna aplikacija koja istodobno dizajnira onoliko parova primera koliko poslužitelj ima procesore. Neovisni zahtjevi popločavanja čekaju se u redu dok se trenutno izvršavanje posla popločavanja ne dovrši. Korisnici koji dostave adresu e -pošte bit će obaviješteni kada obrada njihova zahtjeva završi. Ostali će morati upotrijebiti vezu na stranici za potvrdu predaje da bi vidjeli svoj rezultat.

Kako bi se promicala poštena upotreba sustava, ukupan broj parova temeljnih premaza koji se mogu oblikovati u jednom zahtjevu ograničen je na 200, a maksimalno trajanje popločavanja postavljeno je na tri sata. Korisnici koji premašuju ta ograničenja i dalje mogu koristiti PCRTiler, bilo instaliranjem samostalne aplikacije PCRTiler na svoje osobno računalo, instaliranjem verzije poslužitelja i onemogućivanjem ograničenja, ili podjelom velikog zahtjeva na manje regije.

PCRTiler će se ljupko oporaviti od ponovnog pokretanja poslužitelja. Čim se novi zahtjevi za popločavanje dostave poslužitelju, oni se komprimiraju i zatim spremaju na disk. U slučaju da se poslužitelj ponovno pokrene, PCRTiler će transparentno oporaviti zahtjeve popločavanja u redu, čuvajući njihov izvorni redoslijed i nastaviti s izvršavanjem prekinutog izvođenja.

Softverski i hardverski zahtjevi

PCRTiler zahtijeva Java Runtime Environment (JRE) v1.6.0 i Tomcat 6 koji rade na računalu s operacijskim sustavom Linux. Teoretski bi se također trebao izvoditi na bilo kojoj kombinaciji platformi i operacijskih sustava za koje postoje implementacije za binarne datoteke JRE, Tomcat 6, Primer3 i BLAST, ali to nije testirano i stoga nije podržano. Tijekom testiranja potvrdili smo da se ispravno ponaša kada se gleda s najnovijim verzijama Firefoxa, Safarija i Internet Explorera.

Performanse PCRTilera prvenstveno ovise o raspoloživoj memoriji. Prema našem iskustvu, za prihvatljive performanse potrebno vam je dovoljno memorije za bazu podataka BLAST (800 MB za Homo sapiens, 5 MB za većinu bakterija), plus najviše 1 GB za PCRTiler. Stoga bi 2 GB memorije trebalo biti dovoljno. Ova količina memorije obično je uključena u novija računala i prijenosna računala. PCRTiler je aplikacija s više niti, pa će koristiti sva dostupna CPU jezgra, ubrzavajući dizajn primera proporcionalno broju jezgri. Poslužitelj PCRTiler trenutno pokreće Mandriva Linux 2010 na namjenskom četverojezgrenom Intelovom stroju takta 2,4 Ghz s 4 GB RAM-a. Uključujući BLAST baze podataka od svih 1169 genoma, PCRTiler zahtijeva & lt15 GB prostora na tvrdom disku.

Samostalna verzija

Osim verzije poslužitelja, nudimo i samostalnu aplikaciju temeljenu na Javi, koja uključuje grafičko korisničko sučelje i istu značajku upravljanja genomom jednim klikom kao i verzija poslužitelja. Također se bavi svim aspektima preuzimanja genoma iz GenBanke i stvaranja BLAST baza podataka. Budući da samostalne i poslužiteljske verzije dijele većinu iste baze koda, obje pružaju istu funkcionalnost. Međutim, samostalna verzija koristi resurse klijentskog računala. Korištenje samostalne verzije najjednostavnija je opcija za većinu korisnika koji žele pokrenuti PCRTiler lokalno. Imajte na umu da za samostalnu verziju nije potreban Tomcat. Do danas se pokazalo da radi ispravno na Linux i386, Windows Vista i Windows XP.

Zadržavanje podataka

Rezultati PCRTilera čuvaju se na poslužitelju 14 dana. Međutim, korisnici imaju mogućnost da odmah izbrišu datoteku rezultata s poslužitelja pomoću odgovarajućeg gumba na stranici s rezultatima. Korisnici koji bi htjeli zadržati rezultat PCRTilera duže vrijeme mogu preuzeti sirovu datoteku rezultata s web stranice, koju se može vidjeti pomoću samostalne verzije PCRTilera.


Zašto koristimo negativnu kontrolu u PCR -u?

PCR djeluje na uzorku DNK. Recimo da se testirate na HIV (HIV je RNA virus, ali kada uđe u stanicu, pretvara se u DNK. Pa će u zaraženoj stanici biti DNK HIV -a). Grundirice koje koristite napravit će proizvod (amplikon) koji odgovara dijelu HIV DNA. Ako vidite ovaj amplikon, znači da je prisutna sekvenca HIV -a. ali ako nemate negativnu kontrolu, možda imate zagađenje.

PCR je iznimno osjetljiv. U PCR -u se koristi mnogo otopina (voda, pufer, dNTP, enzim). i svi oni mogu lako biti kontaminirani DNK iz drugih uzoraka, ili čak iz amplikona koji je nastao u reakciji koju ste učinili jučer. Dakle, ako imate uzorak DNK pacijenta X i provjeravate HIV putem PCR -a, PCR početnici mogu napraviti proizvod od DNK HIV -a u uzorku DNK pacijenta X (ako ta osoba ima HIV), ili ga mogu učiniti onečišćenje. Ali ne možete reći je li to iz kontaminacije ili iz HIV -a u DNK pacijenata.

Dakle, vodite kontrolu vode. U epruvetu 1 stavljate sve komponente reakcije, a za DNK dodajete samo vodu. Ovo je negativna kontrola. NIŠTA se ovdje ne bi trebalo pojačati. U epruvetu 2 stavite sve reakcijske komponente i DNA pacijenta X. Ako ovdje nabavite proizvod (a u Tube 1 nema ništa), pacijent X vjerojatno ima DNK HIV -a u svojoj DNK. Ako dobijete proizvod i u epruveti 1 i u epruveti 2, imate problem kontaminacije i ne možete reći je li HIV u uzorku pacijenta uzrokovan bolešću ili je kontaminiran.


The Lančana reakcija polimeraze (PCR) je metoda replikacije DNA koja se izvodi u epruveti (tj. in vitro). Ovdje se "ldquopolymerase" rdquo odnosi na enzim DNA polimeraze ekstrahiran i pročišćen iz bakterija, a "ldquochain reakcije" rdquo se odnosi na sposobnost ove tehnike proizvesti milijune kopija molekule DNA, koristeći svaku novo repliciranu dvostruku spiralu kao predložak za sintezu dvije nove dvostruke spirale DNA . PCR je stoga vrlo učinkovita metoda amplifikacije DNA.

Osim sposobnosti stvaranja velike količine DNK, postoji i druga karakteristika PCR -a koja ga čini iznimno korisnim. Podsjetimo da većina DNA polimeraza može dodati samo nukleotide na kraj postojećeg lanca DNA, pa stoga zahtijeva temeljni premaz za pokretanje procesa replikacije. Za PCR se koriste kemijski sintetizirane početnice s oko 20 nukleotida. U idealnom PCR -u, početnice se samo hibridiziraju s njihovom točnom komplementarnom slijedom na nizu predložaka (slika ( PageIndex <3> )).

Slika ( PageIndex <3> ): Dupleks predložaka temeljnog premaza u gornjem dijelu slike savršeno se slaže i bit će stabilan na višoj temperaturi od dupleksa u donjem dijelu slike, koji sadrži mnogo neusklađenosti a time i manje vodikovih veza. Ako je temperatura žarenja dovoljno visoka, samo savršeno usklađeni temeljni premaz moći će pokrenuti proširenje (siva strelica) s ovog mjesta na predlošku. (Izvornik-Deyholos-CC: AN)

Eksperimentator stoga može kontrolirati točno koje područje DNK šablona je pojačano kontroliranjem slijeda početnica korištenih u reakciji.

Za provođenje PCR amplifikacije, eksperimentator kombinira u malu cijev s tankim stijenkama (slika ( PageIndex <4> )) sve potrebne komponente za replikaciju DNA, uključujući DNA polimerazu i otopine koje sadrže nukleotide (dATP, dCTP , dGTP, dTTP), DNK šablon, DNA početnice, pH pufer i ioni (npr. Mg 2+) potrebni polimerazi. Uspješne PCR reakcije provedene su koristeći samo jednu molekulu DNK kao predložak, ali u praksi većina PCR reakcija sadrži više tisuća molekula šablona. Predložak DNK (npr. Ukupna genomska DNA) obično je već pročišćen iz stanica ili tkiva pomoću gore opisanih tehnika. Međutim, u nekim je situacijama moguće staviti cijele stanice izravno u PCR reakciju za upotrebu kao predložak.

Slika ( PageIndex <4> ): Traka od PCR cijevi (Wikipedia-madprime-GFDL)

Bitni aspekt PCR -a je termički ciklus, što znači izloženost reakcije nizu točno definiranih temperatura (slika ( PageIndex <5> )). Reakcijska smjesa se najprije zagrije na 95 ° C. To uzrokuje topljenje vodikovih veza između lanaca molekula DNK šablona, ​​ili denaturirati. Time nastaju dvije jednolančane molekule DNK iz svake dvostruke spirale (slika ( PageIndex <6> )). U sljedećem koraku (žarenje), smjesa se ohladi na 45-65 ° C. Točna temperatura ovisi o korištenom slijedu temeljnog premaza i ciljevima pokusa. To omogućuje stvaranje dvolančanih spirala između komplementarnih molekula DNA, uključujući žarenje prajmera na šablonu. U posljednjem koraku (produžetak) smjesa se zagrije na 72 ° C. To je temperatura na kojoj je određena DNA polimeraza korištena u PCR -u najaktivnija. Tijekom produženja, novi lanac DNA se sintetizira, počevši od 3 'kraja primera, duž duljine lanca šablone. Cijeli proces PCR -a vrlo je brz, pri čemu svaka temperaturna faza obično traje 30 sekundi ili manje. Svaki ciklus od tri temperature (denaturacija, žarenje, produženje) obično se ponavlja oko 30 puta, pojačavajući ciljano područje približno 2 30 puta. Primijetite sa slike da većina novosintetiziranih lanaca u PCR -u započinje i završava sa sekvencama koje su identične ili komplementarne s početnim nizovima, iako je nekoliko niti duljih od ovoga, oni su u tako maloj manjini da se gotovo uvijek mogu zanemariti .

Slika ( PageIndex <5> ): Primjer termičkog ciklusa, u kojem je temperatura žarenja 55 & degC. (Izvornik-Deyholos-CC: AN)

Slika ( PageIndex <6> ): PCR s tri faze termičkog ciklusa numerirane. Predložak (plavi) replicira se iz početnica (crveni), s novo sintetiziranim nitima u zelenoj boji. Zeleni lanci okruženi s dva mjesta vezanja prajmera povećat će se brojno eksponencijalno kroz uzastopne cikluse PCR -a. (Wikipedia-madprime-GFDL)

U prvim PCR reakcijama korištena je polimeraza iz E coli. Budući da je visoka temperatura koraka denaturacije uništila enzim, nakon svakog ciklusa morala se dodati nova polimeraza. Kako bi to prevladali, istraživači su identificirali termostabilan DNA polimeraze kao npr Taq DNA pol, iz Thermus acquaticus, termofilna bakterija koja živi u toplim izvorima. Taq i slične termostabilne polimeraze iz drugih vrućih okruženja mogu ostati funkcionalne u ponovljenim ciklusima pojačanja. Taq polimeraza obično ne može pojačati fragmente dulje od oko 3 kbp, ali pod nekim posebnim uvjetima, PCR može pojačati fragmente do približno 10 kbp. Ostale polimeraze, same ili u kombinaciji s Taq, koriste se za povećanje duljine pojačanih fragmenata ili za povećanje vjernosti replikacije.

Nakon završetka termičkog ciklusa (amplifikacija), alikvot iz PCR reakcije obično se učita na elektroforetski gel (dolje opisano) kako bi se utvrdilo je li fragment DNA očekivane duljine uspješno pojačan ili nije. Obično će izvorna DNA šablona biti toliko razrijeđena da neće biti vidljiva na gelu, samo amplificirani PCR proizvod. Prisutnost oštre trake očekivane duljine ukazuje na to da je PCR uspio pojačati svoju metu. Ako je svrha PCR -a bila provjera prisutnosti određene sekvence predloška, ​​ovo je kraj pokusa. Inače, preostali PCR proizvod može se koristiti kao polazni materijal za razne druge tehnike, poput sekvenciranja ili kloniranja.

Primjena PCR -a: afera StarLink

PCR je vrlo osjetljiv (što znači da može pojačati vrlo male početne količine DNK) i specifičan (što znači da može pojačati samo ciljani niz iz mješavine mnogih sekvenci DNA). Zbog toga je PCR savršen alat za ispitivanje prisutnosti genetski modificiranog kukuruza u potrošačkim proizvodima na policama supermarketa. Iako je trenutno (2013.) 85% kukuruza u Sjedinjenim Državama genetski modificirano i sadrži gene koje su vladini regulatori odobrili za prehranu ljudi, još 2000. godine, ekološke grupe pokazale su da je soj genetski modificiranog kukuruza, koji je odobren samo za korištena kao hrana za životinje, bila je pomiješana s kukuruzom koji se koristio u proizvodnji ljudske hrane, poput školjki taco.

Da bi to učinile, grupe su kupile taco školjke u trgovinama na području Washington DC -a, izvadile DNK iz taco školjki i upotrijebile je kao predložak u PCR reakciji s početnicama specifičnim za neovlašteni gen (Cry9C). Njihove sumnje su se potvrdile kada su ovaj PCR proizvod proveli na agaroznom gelu i vidjeli traku očekivane veličine. PCR test je mogao otkriti jedno transgeno zrno u cijelom grmu kukuruza (1 na 100.000). Tvrtka (Aventis) koja je prodala transgeno sjeme poljoprivrednicima morala je platiti uništavanje velikih količina kukuruza, a bila je meta grupne tužbe bijesnih potrošača koji su tvrdili da su se razboljeli od taco školjki. Iako nikada nisu dokazani legitimni slučajevi nanošenja štete, a tužiteljima je dosuđeno 9 milijuna dolara, od čega je 3 milijuna dolara otišlo na sudske takse, a ostatak presude otišao je potrošačima u obliku kupona za taco školjke. Afera je oštetila tvrtku i otkrila slabost u načinu na koji se u to vrijeme u Sjedinjenim Državama postupalo s genetski modificiranim usjevima.


Gledaj video: PCR Primers. (Kolovoz 2022).