Informacija

12.3: Onkogeni - biologija

12.3: Onkogeni - biologija



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Onkogen je gen koji, kada mutira ili se izražava na abnormalno visokim razinama, doprinosi pretvaranju normalne stanice u stanicu raka. Stanice raka su stanice koje sudjeluju u nekontroliranoj mitozi.

Signali za normalnu mitozu

Normalne stanice koje rastu u kulturi neće se podijeliti ako ih ne stimulira jedan ili više faktora rasta prisutnih u mediju za uzgoj (npr. Epidermalni faktor rasta (EGF)). Faktor rasta veže se na svoj receptor, integralni membranski protein ugrađen u membranu plazme sa svojim mjestom za vezanje liganda izloženim na površini stanice. Primjeri:

  • receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR). Gen koji ga kodira, EGFR, također poznat kao HER1.
  • drugi receptor faktora rasta kodiran je genom ERBB2 (također poznat kao HER2.)
  • Vezivanje faktora rasta za njegov receptor pokreće kaskadu signalnih događaja unutar citosola. Mnogi od njih uključuju
    • kinaze - enzimi koji vezuju fosfatne skupine za druge proteine. Primjeri: proteini koje kodira SRC, RAF, ABL, i fuzijski protein kodiran sa BCR/ABL nalaz u kronične mijelogene leukemije (CML).
    • ili molekule koje uključuju kinaze. Primjer: RAS. Molekule RAS -a nalaze se na unutarnjoj površini plazma membrane gdje služe za povezivanje aktivacije receptora s "nizvodnim" kinazama poput RAF -a.
  • U većini slučajeva fosforilacija aktivira protein i na kraju prenosi signal u jezgru.

Ovdje fosforilacija aktivira transkripcijske faktore koji se vežu za promotore i pojačivače u DNK, pa uključuju njihove povezane gene. Primjeri: AP-1, heterodimer proteina kodiranih sa jun i fos. Neki od gena koje aktiviraju ti transkripcijski faktori kodiraju druge transkripcijske faktore (npr. myc).

Neki od gena koje aktiviraju ti nizvodni transkripcijski faktori kodiraju cikline koji pripravljaju stanicu na mitozu. Geni koji sudjeluju u bilo kojem od gore navedenih koraka mogu postati onkogeni ako postanu mutirani tako da njihov proizvod postane konstitutivno aktivan (to jest, aktivan cijelo vrijeme čak i u odsutnosti pozitivnog signala) ili ako proizvod proizvede višak. Mogući uzroci uključuju ako je njihov promotor i/ili pojačivač postao mutiran (npr. Oncomouse: transgeni miš koji ima obje kopije svoje myc gen pod utjecajem ekstra moćnih promotora) ili gubitka (npr. translokacijom) 3'-UTR njihove mRNA, tako da mikroRNA (miRNA) koja inače potiskuje translaciju to više ne može činiti.

Svi ti onkogeni djeluju kao dominantni; ako stanica ima jedan normalan gen (nazvan proto-onkogen) i jedan mutirani gen (onkogen) na par lokusa, abnormalni proizvod preuzima kontrolu. Nijedan onkogen sam po sebi ne može uzrokovati rak. Može, međutim, povećati brzinu mitoze stanice u kojoj se nalazi. Stanice koje se dijele izložene su povećanom riziku od stjecanja mutacija, pa klon stanica koje se aktivno dijele može dati subklone stanica s drugim, trećim itd. Onkogenom. Kad klon izgubi svu kontrolu nad svojom mitozom, na dobrom je putu da se razvije u rak.

Ovaj grafikon (na temelju rada E. Sinn i sur., Cell 49: 465,1987) prikazuje sinergijski učinak dva onkogena. Udio (%) transgenih miševa bez tumora prikazan je kao funkcija starosti.

Druge vrste potencijalnih gena za promicanje raka

  • Geni koji inhibiraju apoptozu: Samoubojstvo oštećenih stanica - apoptoza - pruža važan mehanizam za oslobađanje tijela od stanica koje bi mogle nastati rak. Stoga ne čudi da inhibicija apoptoze može potaknuti nastanak raka. Primjer: Bcl-2. Produkt ovog gena inhibira apoptozu. Prekomjerna ekspresija gena zaštitni je znak karcinoma B-stanica.
  • Geni uključeni u popravak DNK ili zaustavljanje mitoze ako ne uspiju: Mutacije proizlaze iz nepopravljene greške u DNK. Dakle, svaki gen čiji proizvod sudjeluje u popravku DNA vjerojatno se može ponašati i kao onkogen kada mutira. Na primjer: bankomat. bankomat (= "ataksija telangiektazija mutirana") dobilo je ime po ljudskoj bolesti tog imena, čiji su pacijenti - između ostalog - u povećanom riziku od raka. ATM protein također je uključen u otkrivanje oštećenja DNA i prekidanje staničnog ciklusa kada se pronađe oštećenje. Procjenjuje se da je potpuno 1% od ~ 21 000 gena u ljudskom genomu protoonkogeni.
  • Geni za suzbijanje tumora: Produkti nekih gena inhibiraju mitozu. Ti se geni nazivaju geni za suzbijanje tumora. Za razliku od onkogena, oni se ponašaju kao recesivi - oba alela moraju biti neispravna da bi izgubila učinak kočenja na mitozu.

Biologija receptora

Michael Roberts je profesor biologije na Linfield Collegeu u McMinnvilleu (Oregon, SAD). On je 40 godina predavao studentima biologiju, prvo na sveučilištu Yale, a od 1981. na Linfield Collegeu. Njegov znanstveni fokus je kardiovaskularna fiziologija i regulacija tjelesne temperature životinja.

Anne Kruchten izvanredna je profesorica biologije na Linfield Collegeu u McMinnvilleu (Oregon, SAD). Diplomirala je na Sveučilištu Minnesota, pridružila se Linfield Collegeu 2006. Njezin je znanstveni fokus regulacija stanične migracije.


Holland-Frei Medicina protiv raka. 6. izdanje.

Dr. Marco A. Pierotti, dr. Gabriella Sozzi i dr. Carlo M. Croce

Aktivacija onkogena uključuje genetske promjene u staničnim protoonkogenima. Posljedica ovih genetskih promjena je davanje prednosti staničnom rastu. Tri genetska mehanizma aktiviraju onkogene u ljudskim neoplazmama: (1) mutacija, (2) amplifikacija gena i (3) preslagivanje kromosoma. Ovi mehanizmi rezultiraju ili promjenom strukture protoonkogena ili povećanjem ekspresije protoonkogena (slika 6-5). Budući da je neoplazija višestupanjski proces, više od jednog od ovih mehanizama često doprinosi nastanku ljudskih tumora mijenjanjem brojnih gena povezanih s rakom. Potpuna ekspresija neoplastičnog fenotipa, uključujući i sposobnost metastaziranja, obično uključuje kombinaciju aktivacije protoonkogena i gubitka ili inaktivacije gena za supresor tumora.

Slika 6-5

Shematski prikaz glavnih mehanizama aktivacije onkogena (od protoonkogena do onkogena). Normalni gen (protoonkogen) prikazan je s transcibiranim dijelom (pravokutnik). U slučaju amplifikacije gena, potonji se može duplicirati (više.)


EPIGENETIKA U RAKU

Epigenetika je promijenila općeprihvaćena znanja iz biologije raka. Kako je genetika u prošlosti bila prepoznata kao glavna komponenta odgovorna za tumorigeni proces, danas nastojimo epigenetici dodijeliti ključnu ulogu u pokretanju ili podržavanju progresije raka.

Mnogi epigenetski igrači mogu surađivati ​​kako bi transformirali stanice u stanice raka, jer su različite vrste epigenetskih čimbenika otkrivene izmijenjene u karcinomima. Među njima se ističu modifikatori histona [histon acetiltransferaze (HAT), histon deacetilaze (HDAC) i histon metiltransferaze], remodeleri kromatina, modifikatori DNA (DNA metil- i hidroksimetiltransferaze) i nekodirane RNK [1–4]. ili neizravni učinak na strukturu i dinamiku kromatina.

Genetski čimbenici uglavnom se oslanjaju na gubitak ili povećanje funkcije tumorskih supresora, odnosno onkogena, dok se epigenetski uvjetovane tumorske promjene temelje na (potencijalno reverzibilnoj) izmjeni enzimskih aktivnosti, što dovodi do globalno aberantnog fenotipa [5] .

Tipično, epigenetske promjene uključuju aberantne uzorke metilacije DNA i/ili histonske modifikacije, što dovodi do promijenjene ekspresije gena ključnih regulatornih gena koji su uglavnom uključeni u kontrolu rasta i proliferacije stanica, kao i popravak DNA ili održavanje stabilnosti genoma [2, 6]. To sugerira da vraćanje njihovog izraza na fiziološku razinu, na pr. uz korištenje epigenetskih modulatora, može pridonijeti rješavanju raka. Na temelju toga predložena je uporaba epigenetskih modulatora kao antikancerogenih spojeva kao nova terapijska strategija za rak i druge bolesti [7–9]. Kao najbolji primjer, HDAC inhibitori (HDACi) već su uvedeni u kliničko liječenje kožne leukemije T-stanica, a trenutno se još mnogo više epigenetskih modulatora nalazi u procesu probira [10]. Zapravo, čini se da je modulacija razina acetilacije najjednostavniji i do sada najuspješniji način za vraćanje normalnog epigenetskog obrasca i na kraju ispravnog profila ekspresije gena. Ovo naglašava važnost acetilacije u biologiji raka.

U ovom pregledu želimo istražiti različite razine uključenosti acetiltransferaza u rak i opći doprinos poremećenih obrazaca acetilacije u tumorigenezi.


Sadržaj

Prvi fuzijski gen [3] opisan je u stanicama raka početkom 1980 -ih. Nalaz se temeljio na otkriću 1960. godine od Peter Nowella i Davida Hungerforda u Philadelphiji malog abnormalnog markera kromosoma u bolesnika s kroničnom mijeloičnom leukemijom - prve dosljedne abnormalnosti kromosoma otkrivene u humanoj zloćudnoj bolesti, kasnije označene kromom Philadelphia. [4] 1973. Janet Rowley iz Chicaga pokazala je da je kromosom iz Philadelphije nastao translokacijom između kromosoma 9 i 22, a ne jednostavnim brisanjem kromosoma 22 kako se ranije mislilo. Nekoliko je istraživača početkom osamdesetih pokazalo da je translokacija kromosoma u Philadelphiji dovela do stvaranja novog fuzijskog gena BCR/ABL1, sastavljenog od 3 'dijela gena ABL1 u točki loma na kromosomu 9 i 5' dijela gena tzv. BCR u točki prekida u kromosomu 22. 1985. jasno je utvrđeno da fuzijski gen na kromosomu 22 proizvodi abnormalni himerni protein BCR/ABL1 sa sposobnošću induciranja kronične mijeloične leukemije.

Već je 30 godina poznato da odgovarajuća fuzija gena igra važnu ulogu u tumorigenezi. [5] Fuzijski geni mogu pridonijeti stvaranju tumora jer fuzijski geni mogu proizvesti mnogo aktivnije abnormalne proteine ​​od nefuzijskih gena. Fuzijski geni često su onkogeni koji uzrokuju rak, uključujući BCR-ABL, [6] TEL-AML1 (ALL s t (12 21)), AML1-ETO (M2 AML s t (8 21)) i TMPRSS2-ERG s intersticijska delecija na kromosomu 21, koja se često javlja kod raka prostate. [7] U slučaju TMPRSS2-ERG, ometanjem signalizacije androgenih receptora (AR) i inhibiranjem ekspresije AR onkogenim ETS transkripcijskim faktorom, fuzijski proizvod regulira rak prostate. [8] Većina fuzijskih gena pronađena je iz hematoloških karcinoma, sarkoma i raka prostate. [9] [10] BCAM-AKT2 je fuzijski gen koji je specifičan i jedinstven za visokorazredni serozni rak jajnika. [11]

Onkogeni fuzijski geni mogu dovesti do genskog proizvoda s novom ili različitom funkcijom od dva fuzijska partnera. Alternativno, proto-onkogen je spojen sa snažnim promotorom, pa je onkogena funkcija postavljena da funkcionira zbog regulacije uzrokovane jakim promotorom uzvodnog fuzijskog partnera. Ovo posljednje uobičajeno je u limfomima, gdje su onkogeni poredeni s promotorima gena imunoglobulina. [12] Transkripti onkogene fuzije također mogu biti uzrokovani događajima trans-spajanja ili čitanja. [13]

Budući da kromosomske translokacije igraju tako značajnu ulogu u neoplaziji, stvorena je specijalizirana baza podataka o kromosomskim aberacijama i fuzijama gena u raku. Ova baza podataka naziva se Mitelmanova baza podataka o aberacijama kromosoma i fuzija gena u raku. [14]

Prisutnost određenih kromosomskih aberacija i njihovih nastalih fuzijskih gena obično se koristi u dijagnostici raka kako bi se postavila precizna dijagnoza. Analiza traka kromosoma, fluorescencija in situ hibridizacija (FISH) i lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije (RT-PCR) uobičajene su metode koje se koriste u dijagnostičkim laboratorijima. Sve ove metode imaju svoje posebne nedostatke zbog vrlo složene prirode genoma raka. Nedavni događaji, poput visokopropusnog sekvenciranja [15] i prilagođenih DNK mikroredova, obećavaju uvođenje učinkovitijih metoda. [16]

Fuzija gena igra ključnu ulogu u evoluciji genske arhitekture. Njegov učinak možemo primijetiti ako dođe do fuzije gena u kodirajućim nizovima. [17] Duplikacija, divergencija sekvenci i rekombinacija glavni su čimbenici u evoluciji gena. [18] Ovi događaji vjerojatno mogu proizvesti nove gene iz već postojećih dijelova. Kada se fuzija gena dogodi u nekodirajućoj sekvencijskoj regiji, to može dovesti do pogrešne regulacije ekspresije gena koji je sada pod kontrolom cis-regulatorne sekvence drugog gena. Ako se to dogodi u kodirajućim nizovima, fuzija gena uzrokuje sastavljanje novog gena, tada dopušta pojavu novih funkcija dodavanjem peptidnih modula u protein s više domena. [19] Metode otkrivanja za inventarizaciju događaja fuzije gena na velikoj biološkoj razini mogu pružiti uvid u multi modularnu arhitekturu proteina. [20] [21] [22]

Biosinteza purina Uredi

Purini adenin i gvanin dvije su od četiri baze podataka koje kodiraju univerzalni genetski kod. Biosinteza ovih purina odvija se sličnim, ali ne i identičnim putevima u različitim vrstama triju područja života, arheja, bakterija i eukariota. Glavna karakteristična značajka biosintetskih puteva purina u bakterijama je prevalencija fuzija gena gdje su dva ili više biosintetskih enzima purina kodirani jednim genom. [23] Takve fuzije gena gotovo su isključivo između gena koji kodiraju enzime koji izvode uzastopne korake u biosintetskom putu. Eukariotske vrste općenito pokazuju najčešće fuzije gena viđene u Bakterijama, ali osim toga imaju i nove fuzije koje potencijalno povećavaju metabolički tok.

Posljednjih godina, tehnologija sekvenciranja sljedeće generacije već je postala dostupna za provjeru poznatih i novih događaja fuzije gena na širokoj razini genoma. Međutim, preduvjet za detekciju velikih razmjera je sekvenciranje uparenog kraja transkriptoma stanice. Smjer otkrivanja fuzijskog gena uglavnom je prema analizi i vizualizaciji podataka. Neki su istraživači već razvili novi alat pod nazivom Transcriptome Viewer (TViewer) za izravnu vizualizaciju otkrivenih fuzija gena na razini transkripta. [24]

Biolozi također mogu namjerno stvoriti fuzijske gene u istraživačke svrhe. Fuzija reporterskih gena s regulatornim elementima gena od interesa omogućuje istraživanjima proučavanje ekspresije gena. Spojevi gena reportera mogu se koristiti za mjerenje razine aktivnosti regulatora gena, identifikaciju regulatornih mjesta gena (uključujući potrebne signale), identifikaciju različitih gena koji su regulirani kao odgovor na isti podražaj, te umjetno kontrolirati ekspresiju željenih gena, posebno Stanice. [25] Na primjer, stvaranjem fuzijskog gena proteina od interesa i zelenog fluorescentnog proteina, protein od interesa može se primijetiti u stanicama ili tkivu pomoću fluorescentne mikroskopije. [26] Protein sintetiziran pri ekspresiji fuzijskog gena naziva se a fuzijski protein.


Materijali i metode

Biljni materijal

Eksperimenti su provedeni s ebi-1 koja je četiri puta vraćena na roditeljsku transgenu liniju 6A koja nosi KABINA2: LUC+ reporterska konstrukcija (NASC ID N9352).

Linija T-DNA SALK_128255.54.50.n dobivena je iz NASC-a, a biljke homozigotne za T-DNA potvrđene su PCR-om pomoću početnica 5'-ttgccgcagtaacaaaggtac-3 ', 5'-agtttatccggaagcaaatgg-3' (WT traka u Col-0 , nema pojasa u homozigotnoj liniji SALK). Lijeva rubna sekvenca pojačana je primerom 5'-agtttatccggaagcaaatgg-3 'i LBb. KABINA2: LUC+ je uveden korištenjem Agrobacterium-posrednički protokol transformacije i uranjanja [36].

Zaslon za mutante cirkadijskog sata

Mutageneza i skrining opisani su u [18]. Kratko, Arabidopsis Transgensko sjeme Ws-2 koje nosi KABINA2: LUC+ transgen (gore opisan) mutageniziran je potapanjem u 100 mM EMS kroz 3 h. Rezultirajući M1 stanovništvo je zasijano i samooplođeno, a M2 stanovništvo je pregledano na sadnice s promijenjenim rokom KABINA2: LUC+ izraz u stalnoj tami.

Analiza cirkadijalnih ritmova

Sadnice su zatim posijane na medij Murashige i Skoog koji sadrži 3% saharoze i 1,5% agara. Oni su 7 dana držani u komori za rast u ciklusima svjetla/mraka na 22 ° C prije nego što su prebačeni na konstantno svjetlo i temperaturu. Za mjerenje su korištene dvije metode KABINA2: LUC+ aktivnost. Za početni pregled i preliminarnu karakterizaciju mutanta u stalnoj mraku korišten je automatizirani luminometar (Topcount, Perkinelmer, Cambridge, UK) kako je opisano [37]. Druga metoda za karakterizaciju mutanta pri stalnom svjetlu i naknadnu karakterizaciju povratnih križanih linija i mutanata T-DNA bio je sustav snimanja video zapisa pri slabom osvjetljenju kako je opisano u [37]. Metoda mjerenja ritmova u kretanju lista koristila je starije 12-dnevne sadnice i metodu identičnu onoj opisanoj u [38].

Sekvenciranje WS-2 i ebi-1

DNK je izolirana pomoću biljnog DNeasy kompleta (Qiagen, Crawley, West Sussex, UK) Pripremljene su dvije biblioteke čitljivih oznaka, jedna za ebi-1 i jedan za Ws. PCR emulzije pomoću standardnog SOLiD protokola proveden je u svakoj knjižnici. Knjižnice su pohranjene na zasebne dijapozitive i poredane u jednom ciklusu pomoću SOLiD analizatora verzija 2 (Life Technologies).

Za sekvenciranje genoma 454, 5 μg Ws-2 DNA je fragmentirano nebulizacijom. Fragmentirana DNA analizirana je pomoću Bioanalyzera (Agilent Technologies, Wokingham, Berkshire, UK) kako bi se osiguralo da je većina fragmenata između 350 i 1.000 bp. Pročišćena fragmentirana DNK obrađena je prema 454 FLX Titanium Library kompletu za izgradnju i protokolu (Roche Applied Science, Burgess Hill, East Sussex, UK). Bibliotečki fragmenti dodani su u emulzijske PCR kuglice u omjeru 1: 1 prema emPCR pri optimalnih 1,5 molekula DNA po zrnu i pojačani prema uputama proizvođača (Roche Applied Science), a sekvencirana je cijela pločica s piko-titrom.

Dobivene oznake prostora od 35 znakova iz oba niza u nizu zatim su preslikane u referentnu sekvencu Col-0 od 119,7 Mbp [39] pomoću podudarnog cjevovoda paketa za analizu podataka SOLiD izvan stroja Corona Lite [40] koji koristi niz podudarne sheme, temeljene na oznakama prostora u boji od 35 znakova u punoj duljini, kao i sheme na temelju oznaka obrezanih na 25 znakova kako bi se uklonili položaji koji su najviše skloni pogreškama. Putativni SNP-ovi u odnosu na Col-0 tada su pozvani za svaki genom koristeći Corona Lite-ov kanal za otkrivanje SNP-a.

Rezultirajući SNP popis za ebi-1 zatim je unakrsno referenciran s Ws-2 kako bi se identificirali SNP-ovi koje dijele oba genoma, kao i SNP-ovi koji se pojavljuju samo u ebi-1 ili samo u Ws-2. U ovoj fazi SNP-i niskog povjerenja su filtrirani isključivanjem svih SNP lokusa gdje je pokrivenost bila 5 ili manja, SOLiD SNP rezultati bili su manji od 0,7 ili je SNP bio heterozigotan u oba genoma. Kako bi se osiguralo da su uzeti u obzir samo SNP-i visokog povjerenja, poduzeta je daljnja runda provjere u kojoj su za naknadnu analizu uzeti u obzir samo oni prijavljeni prema svim primijenjenim shemama podudaranja.

Koristeći trenutne (TAIR 8) napomene [39] kao vodič, SNP-i visokog povjerenja klasificirani su i popisani. Podaci o slijedovima za Ws-2 arhiviraju se na TAIR-u i dostupni su kao zapis na Arabidopsis genom hostiran na TAIR -u [SpeciesVariant: 393] [41].

SNP validacija

Za potvrđivanje SNP -ova između ebi-1 i Ws-2, koristili smo jednostavan pristup baziran na PCR-u analize CAPS-a i dCAPS-a. PCR početnice za CAPS/dCAPS analizu dizajnirane su pomoću dCAPS finder 2.0 [42]. Za pojačavanje produkata iz korišten je standardni PCR protokol ebi-1 i Ws-2, a PCR produkti su digestirani i provedeni na 4% agaroznom gelu i bodovani. Osnovni premazi, mjesta ograničenja i veličine proizvoda sažeti su u Dodatnoj datoteci 4. SNP -ovi u PRR7 i EBI dodatno su potvrđene standardnim metodama sekvenciranja.

Kvantificiranje RNA pomoću PCR-a u stvarnom vremenu

Sadnice su uzgajane u ciklusu od 12 sati svjetla/12 sati po mraku tijekom 6 dana. Sadnice su sakupljene izravno u tekući dušik 1 sat nakon zore i 1 sat nakon sumraka pomoću zelenog sigurnosnog svjetla. RNA je zatim ekstrahirana pomoću RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka). cDNA je sintetizirana iz 1 μg ukupne RNA pomoću iScript ™ kompleta za sintezu cDNA (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). PCR u stvarnom vremenu izveden je s MyIQ ™, ICycler ili CFX96 PCR sustavom za otkrivanje u stvarnom vremenu (Bio-Rad Laboratories, Hempstead, Hertfordshire, UK), pomoću iQ SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Učinkovitost pojačanja procijenjena je u odnosu na β-TUBULIN (βTUB) izraz. Mjerenja su ponovljena najmanje dva puta s neovisnim biološkim materijalom. Razine ekspresije izračunate su u odnosu na referentni gen primjenom metode usporednog ciklusa praga [43]. Rezultati pokazuju srednju vrijednost četiri biološke replikacije, svaka s tri tehnička ponavljanja, izraženu u odnosu na srednju vrijednost serije divljeg tipa nakon standardizacije do βTUB. Temeljni premazi za βTUB već su objavljeni [44]. The EBI-specifični početnici su bili sljedeći: EBI-F, 5'-TGC GAG AAT ATG CTT AAT TGC-3 ' EBI-R, 5'-CCA CAA CAT CAC AAG ACA AG-3 '.

Mapiranje ebi-1

An F.2 mapiranje stanovništva napravljeno je između ebi-1 i Col-0. Skup od približno 20 pojedinaca iz ove populacije, koji su imali svoje ebi-1 fenotip potvrđen u F3, imali rekombinacijske događaje u kromosomu 5 i postavili ebi-1 mutacija na sjevernom kraku kromosoma 5. Ova je kartografska populacija povećana i s dvije jedinke smo dalje mogli ograničiti interval kartiranja između CIW18 i nga158.


Stjecanje kromosomske nestabilnosti mehanizam je za izbjegavanje ovisnosti o onkogenima

Nestabilnost kromosoma (CIN) povezana je s terapijskom rezistencijom kod mnogih karcinoma. Međutim, nije jasno postaju li tumori genomski nestabilni kao evolucijski mehanizam za prevladavanje uskih grla nastalih terapijom. Koristeći CIN model raka dojke uzrokovanog Krasom, pokazujemo da aneuploidni tumori stječu genetske modifikacije koje olakšavaju razvoj rezistencije na ciljanu terapiju brže od euploidnih tumora. Nadalje pokazujemo da nekoliko početno kromosomski stabilnih karcinoma koji uspijevaju opstati tijekom liječenja čine to istodobno s stjecanjem CIN -a. Analiza sekvenciranja cijelog genoma otkrila je da je najčešća genetska promjena u rezistentnim tumorima, koja potječe od euploidnih ili aneuploidnih primarnih tumora, bila amplifikacija na kromosomu 6 koji sadrži cMet onkogen. Nadalje pokazujemo da ovi tumori ovise o cMet -u jer njegova farmakološka inhibicija dovodi do smanjenog rasta i povećane smrti stanica. Naši rezultati ističu da su, bez obzira na početne razine CIN -a, genomi raka dinamični i stjecanje određene razine CIN -a, inducirane ili spontane, mehanizam je zaobilaženja ovisnosti o onkogenima.

Ključne riječi: Kromosomska nestabilnost rak dojke cMet modelira otpornost miša.


Rezultati i rasprava

Procjena pristranosti fragmenata u postojećim protokolima

Broj fragmenata u eksperimentu RNA-Seq određen je s dva različita fenomena: fragmenti koji potječu iz visoko izraženih transkripata pojavljivat će se češće u podacima od onih koji potječu iz niže eksprimiranih transkripata, a bibliotečke pripreme uključuju predrasude koje mogu preferirano odabrati neke potencijalne fragmente umjesto drugi. Pod pristranosti fragmenata mislimo samo na prekomjernu ili nedovoljnu zastupljenost fragmenata zbog predodređenosti specifične za sekvencu ili položaja kako je raspravljano u pozadini. Budući da razine ekspresije također utječu na broj fragmenata, potrebno je zajednički procijeniti brojnost transkripta i parametre pristranosti kako bi se pravilno naučilo pristranost izravno iz podataka RNA-Seq.

Ovo pitanje ilustrirano je primjerom na slici 2 gdje je potreba za zajedničkom procjenom parametara pristranosti i vrijednosti izraza dokazana usporedbom sirovih brojeva baza na počecima/krajevima fragmenata (ploča a) i prilagođenim brojevima normaliziranim prema brojnostima prijepisa (ploča b). Na posljednji izračun utječu parametri pristranosti, pa je potrebna zajednička procjena. Proširili smo okvir vjerojatnosti opisan u [6] kako bismo izvršili takvu procjenu parametara (vidi Materijali i metode), rezultirajući "naučenim" ponderima pristranosti (ploča d Slika 2) koji su korišteni za prilagodbu očekivanih brojeva fragmenata u izračunavanju obilja koristeći naš model vjerojatnosti. Slika 3 prikazuje primjer koliko dobro ove procjene pristranosti bilježe prekomjernu i nedovoljnu reprezentaciju čitanja na različitim pozicijama transkripta, na temelju njegovog slijeda.

Ispravljanje pristranosti unutar prijepisa. Primjer koji pokazuje učinak korekcije pristranosti na broj čitanja za ljudski prijepis NM_004684. Gornja ploča prikazuje neobrađeno brojanje čitanja (broj 3 'krajeva fragmenata na svakom mjestu), a donja ploča prikazuje umnožak parametara pristranosti (ukupna težina pristranosti definirana u Dodatnim metodama u Dodatnoj datoteci 3) na istim mjestima. Ispravno identificiramo pristranost na različitim pozicijama i stoga možemo ispraviti neujednačenost. Imajte na umu da su parametri pristranosti naučeni iz cijelog skupa podataka, isključujući čitanja preslikana na ovaj prijepis, kako bi se međusobno provjerili rezultati. RNA-Seq za pokus izveden je s NSR protokolom [21], zbog čega su korištena 3 'broja umjesto 5'.

Validacija u usporedbi s alternativnim testovima izražavanja

Naglašavamo da naš cilj nije bio potvrditi RNA-Seq po sebi, nego radije pokazati da korekcija pristranosti poboljšava procjenu izraza. Stoga smo se u tumačenju korelacija u cijelom radu usredotočili na poboljšanja u korelaciji s korekcijom pristranosti, a ne na apsolutnu vrijednost. S tim u vezi, izvještavamo većinu naših rezultata kao objašnjenje nesklada, što smo izračunali dijeljenjem promjene u R 2 nakon korekcije pristranosti za razliku početne R 2 od 1 (savršena korelacija). Odabrani korelacijski grafikoni mogu se pronaći na slici S3 dodatne datoteke 1, a svi neobrađeni podaci o izrazu u dodatnoj datoteci 2. Nadalje, spominjemo da smo primijetili da su rezultati korelacije osjetljivi na opseg filtriranja fragmenata male količine i stoga smo pokušali eliminirati filtriranje u pokusima koje smo izveli (za više detalja pogledajte Materijali i metode).

Veliki problem s potvrđivanjem procjena ekspresije RNA-Seq je što ne postoji jasan "zlatni standard" za procjenu ekspresije. Usporedba RNA-Seq s mikroredovima pokazala je da je prva tehnologija točnija od druge [13]. Pregledali smo nedavno objavljeni sustav ekspresije gena NanoString nCounter [14], ali smo primijetili mnoge neobjašnjive izdvojenosti i velike razlike među tehničkim replikama (vidi sliku S4 u dodatnoj datoteci 1 i podatke u dodatnoj datoteci 2). Kvantitativni PCR reverzne transkripcije (qRT-PCR) poslužio je kao mjerilo u brojnim studijama, ali nije savršen test za mjerenje ekspresije [15], pa je stoga apriorno nije jasno koja tehnologija trenutno proizvodi najtočnije procjene izraza. Ipak, trenutno vjerujemo da je to najbolja mjera izražavanja osim, možda, same RNA-Seq. Zbog prethodno pokazane superiornosti RNA-Seq nad mikroredovima i problema s NanoStringom, izvršili smo sve naše benchmarking u odnosu na qRT-PCR.

Započeli smo uspoređujući procjene ekspresije na skupu podataka Human Brain Reference (HBR) Microarray Quality Control (MAQC) Human Brain Reference (HBR)), koji uključuje 907 transkripata s jedinstveno mapiranim TaqMan qRT-PCR sondama [16], s podacima RNA-Seq iz istog uzorka poredanog prema Illumina (SRA012427) [17] (slika 4). Ispitali smo korelaciju izlaza manžetni s podacima o ekspresiji qRT-PCR i uočili povećanje R 2 od 0,753 prije korekcije na 0,807 nakon korekcije.

Korelacija između RNA-Seq i qRT-PCR. (a) Procjene izraza prije korekcije pristranosti (rep strelica) i nakon korekcije (točke strelica) za skup podataka SRA012427 u usporedbi s vrijednostima qRT-PCR za iste transkripte. Crvene strelice pokazuju smanjenje izraza nakon korekcije, a plave povećanje. Imajte na umu da smo radi jasnoće uvećali transkripte slabijeg izraza (većina). (b) Raspodjela promjene u izrazu dnevnog nabora nakon korekcije pristranosti.

Ispitivali smo osnovu za promjenu korelacije daljnjim istraživanjem, za svaki transkript, je li se njegova procjena ekspresije povećala ili smanjila nakon korekcije pristranosti, i za koliko. Strelice na slici 4 prikazuju smjer i opseg promjene izraza s korekcijom te ukupnu raspodjelu promjena nabora. Mnogi fragmenti pokazuju velike promjene u izrazu s medijanom apsolutne promjene nabora 1,5 (slika 4b). Kako bismo utvrdili značaj poboljšanja korelacije, proveli smo test permutacije gdje smo nasumično promijenili procjene izraza transkripata prema raspodjeli promjena na slici 4b. Dobili smo a P-vrijednost 0,0007, što znači da je poboljšanje u R 2 koje naše korekcije postižu vrlo su značajne. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da korekcija pristranosti može dramatično utjecati na procjene izraza i povećanjem i smanjenjem vrijednosti izraza, te da te promjene omogućuju općenito poboljšanje procjena obilja.

Usporedba s prethodnim metodama

U [8] je predložena metoda za ispravljanje pristranosti koja se temelji na ispravljanju broja pročitanih transkripata prema pristranosti naučenoj za obrasce na početku čitanja (normalizirano pomoću sekvenci u unutrašnjosti čitanja). Ovaj pristup koristi manje informacija od naše metode jer je ograničen na pristranost učenja unutar čitanog niza i ne može obuhvatiti pristranost oko početnog mjesta. Nadalje, metode temeljene na prebrojavanju ne iskorištavaju u potpunosti informacije dostupne u čitanjima uparenih krajeva koje omogućuju određivanje duljine fragmenta. Duljina fragmenta može pomoći u dodjeljivanju dvosmisleno preslikanih fragmenata transkriptima, a naša metoda to koristi. S druge strane, budući da se brojanje čitanja promicalo kao prihvatljiv način za mjerenje obilja [18], usporedili smo metodu s našom koristeći podatke MAQC qRT-PCR iz prethodnog odjeljka. Slika 5 prikazuje rezultate metode iz [8], prije i poslije korekcije pristranosti (R 2 = 0,711 prije i R 2 = 0,715 nakon korekcije). Za dobivanje ovih rezultata koristili smo programski paket Genominator [8], slijedeći smjernice u dokumentaciji, s izuzetkom da je pristranost naučena zasebno za svaki kromosom, budući da softver nije mogao učitati čitav genom u memoriju. Više pojedinosti nalazi se u odjeljku Materijali i metode.

Usporedba s prethodnim metodama. Usporedba naše metode (Dugmad za manžete) s Genominatorom [8] i mseqom [10]. The y-os prikazuje R 2 vrijednost za korelaciju između nekorigiranih (zeleno) i ispravljanih pristranosti (narančasto) procjena ekspresije RNA-Seq i qRT-PCR za tri metode. Grafikoni korelacija za ove podatke mogu se pronaći na slici S3 dodatne datoteke 1.

Također smo usporedili naš pristup s mseq metodom u [10]. We again used the MAQC HBR qRT-PCR data and this time prepared the sequences and learned parameters for models following the suggested guidelines in [10], that is we trained the parameters of a MART model for bias by learning from the 100 most expressed transcripts in the experiment, and then tested on the set of 907 transcripts with uniquely mapping TaqMan probes. In this case, we observed an uncorrected R 2 = 0.730 and corrected R 2 = 0.755. Note that the even though the expression was again calculated using counts, the initial correlation of mseq is better than that of Genominator due to the fact that the implementation in [10] required us to remap the reads directly to the transcript sequences, which is presumably more accurate than relying on spliced mapping.

We suspect that the overall inferior results of both the Genominator and mseq in comparison to Cufflinks are due in part to the fact that the bias parameters cannot be learned from raw read counts, but must be normalized by the expression values of the transcripts from which the reads originate (Figure 2). For example, in [10], bias parameters are learned from what are estimated to be the most highly expressed transcripts based on RPKM, but these are likely to also be the most positively biased transcripts, and are therefore not representative in terms of their sequence content. We also believe that, as we argued in [6], it is important to account for fragment lengths in estimating expression, and read count based expression measures do not use such information. Another issue affecting Genominator is that instead of computing the expected read count as is done in Cufflinks and mseq , the observed read counts are adjusted. This means that in positions lacking read alignments, there is no correction of bias. We believe this may partially explain the improved performance of mseq in comparison to Genominator .

Technical replicates

A recurring worry with RNA-Seq has been that repeated experiments, possibly based on different libraries or performed in different laboratories, may be variable due to experimental 'noise'. We investigated these effects starting with an exploration of the correlation between technical replicates before and after bias correction. We define technical replicates to be the sequencing of two different libraries that have been prepared using the same protocol from a single sample. This differs slightly from some previous uses in particular, technical replication has also referred to two sequencing experiments from the same library. Such replicates have already been shown to exhibit very little variability [18, 19].

We postulated that the differences between expression estimates from two different libraries should be reduced after bias correction. We tested this hypothesis in a series of analyses whose results are shown in Figure 6. First, we examined libraries prepared in two different experiments from the same MAQC Universal Human Reference (UHR) sample. In the first experiment [20], which we will refer to by its accession SRA008403, the sample was sequenced from one library preparation. In the second experiment [19], which we will refer to as SRA010153, the sample was sequenced in four separate library preparations. Although the same protocol was used in all five replicates, the learned bias weights differ somewhat between the data produced by the two labs (see Figure S2 in Additional file 1).

Variable technical replicates. Results of correlation tests showing improvement after bias correction for technical replicates. Fraction Explained Discrepancy was calculated by dividing the change in R 2 after bias correction by the difference of the initial R 2 from one (a perfect correlation). Note that when two RNA-Seq datasets are compared, the correction in the legend was applied to both. The pairwise correlations of the four SRA010153 replicates versus qRT-PCR and SRA008403, respectively, were averaged for the figure. Even though the same RH priming protocol was used in both labs, the bias differs slightly (see Figure S2 of Additional file 1) between the preps, which is why our correction method was able to improve the correlation.

Figure 6 shows how correlations of the replicates with qRT-PCR and each other were affected by bias correction. Although the method does improve the pairwise correlations between different library preparations within SRA010153, the initial correlation is already so high (average R 2 > 0.96) that we only show the average pairwise correlations against qRT-PCR and the SRA008403 dataset. The greater correlation among the SRA010153 replicates as compared to the correlation between them and SRA008403 further indicates that bias is more similar when the protocol is carried out by the same lab, presumably by the same person. Bias correction clearly recovers much of the differences in quantification between the replicates introduced by sequence and positional bias. Furthermore, as in the initial validation example, the correction brings both sets closer in line with the qRT-PCR standard.

Library preparation methods

In Figure 7 we demonstrate our ability to correct bias specific to libraries prepared using different protocols. For this experiment, we tried our method on several libraries from a study comparing strand-specific protocols (SRA020818) using the same yeast sample [11], as well as a dataset generated using the 'not so random' (NSR) priming protocol on the human MAQC HBR sample [21]. We compared all of these datasets with a standard Random Hexamer (RH) control for the given sample. Note that although the control (RH) and dUTP libraries have the same sequence bias (see Figure S2 in Additional file 1) and near-perfect initial correlation (R 2 > 0.99), the remaining discrepancy is reduced by positional bias correction.

Variable library preparations. Results of correlation tests showing improvement after bias correction of datasets generated using different library prep methods, all of which are strand-specific. The first four protocols are described in [11] and the final in [21]. All datasets were compared against a control that was generated using the standard Illumina RH protocol. The first four datasets used the control from [11] with the same yeast sample. The last dataset (NSR) was compared against the HBR dataset from SRA010153 since it is also consists of single-end reads.

Because the NSR dataset was sequenced from the MAQC HBR sample, we were also able to compare it to the qRT-PCR standard. We found that our method explained 33.5% of the discrepancy between an initial estimation and qRT-PCR.

Sequencing platforms

Previous studies on bias in RNA-Seq have focused on experiments performed with Illumina sequencers. To investigate whether bias persists with other prep and sequencing technologies, we examined bias in a SOLiD experiment that sequenced both MAQC samples using the standard whole transcriptome (WT) protocol. We saw clear signs of both sequence-specific and positional bias that differed from the other protocols we had examined (see Figure S2 of Additional le 1).

We next compared the expression estimates for the SOLiD dataset with one from Illumina (accession SRA012427) before and after bias correction. In order to illustrate that our improvement in correlation does not come solely from correcting bias in the Illumina dataset, we tested whether there was some improvement from correcting one dataset at a time, as compared to simultaneous correction for both platforms. We found an increase of R 2 from 0.74 to 0.88 (Illumina correction) and 0.85 (SOLiD correction) compared to 0.94 for both. These results are summarized in Figure 8. While one cannot draw general conclusions based on a single experiment, we note that our approach to quantifying bias should be useful in future studies that aim to quantitatively compare the bias among different sequencing platforms.

Bias in different sequence technologies. Results of correlation tests showing improvement after bias correction of datasets generated using different sequencing technologies. The Illumina dataset is SRA012427 (x-axes) and the SOLiD data is SOLiD4_ HBR_PE_50x25 (y-osovine). Both used the same MAQC HBR sample. Red axes and lines denote uncorrected FPKM values and blue corrected, while purple regression lines denote a comparison between corrected and uncorrected values. Both datasets are being corrected for different biases, which causes their expression estimates to become more correlated. Note that the plot is zoomed in on the lower abundance transcripts for clarity but captures over 98% of those in the experiment.


Zaključci

In conclusion, agents targeting driver oncogenic mutations in the advanced NSCLC setting have already changed the treatment paradigm. Given the high incidence of KRAS mutations in patients with NSCLC, this is a promising therapeutic target. However, KRAS is a heterogeneous entity and other coexisting alterations may be crucial for its role and biologic impact. Even though attempts to target KRAS pathway have shed little light so far, new molecules or new therapeutic strategies may revolutionize outcomes in patients with KRAS-driven NSCLC in the near future. Further investigations to better understand the pathways involved, to identify possible synthetic lethal partners and for a better patient selection are needed.


Regulation of Autophagy by p53

The tumor suppressor protein p53 is often inactivated in tumor cells, for instance due to mutations of p53 itself, due to mutations of the kinases that lead to its activation (such as ATM or Chk1) or due to the amplification of MDM2, the E3 ubiquitin ligase that targets p53 to proteasome-mediated destruction. 35, 36 Hence, inactivation of the p53 system is one of the most frequent alterations that occur in cancer. p53 is mainly viewed as a transcription factor that transactivates proapoptotic and cell cycle-arresting genes, 36 thereby favoring apoptosis and senescence of cancer cell precursors (which explains its tumor-suppressive effects as a ‘guardian of the genome’) or of cancer cells that respond to chemotherapy or radiotherapy (which explains its positive impact on anticancer treatment). p53 can also transactivate an autophagy-inducing gene, dram, which codes for a lysosomal protein, 37 and p53-dependent induction of autophagy has been documented by several groups in response to DNA damage, 38 Arf activation, 39 or reexpression of p53 in p53-negative tumor cells. 40

Recently, we observed that inactivation of p53 by deletion, depletion or inhibition also can trigger autophagy. 41 Thus, human and mouse cells subjected to knockout, knockdown or pharmacological inhibition of p53 manifest signs of autophagy, such as depletion of p62/SQSTM1, LC3 lipidation (and hence conversion of LC3-I into LC3-II), redistribution of GFP-LC3 in cytoplasmic puncta and electron microscopic evidence of autophagosomes and autolysosomes, 42 both in vitro i in vivo. 41 This applies to a variety of methods for p53 inactivation: chemical inhibition with cyclic pifithrin-α (PFT-α), knockdown with siRNAs specific for human p53, mouse p53 or the Caenorhabditis elegans p53 ortholog cep1 or homologous recombination of p53 in human cancer cells, mice or nematodes. p53 inactivation was found to induce autophagy in several nontransformed or malignant human cell lines, namely HFFF2 fibroblasts, HCT116 colon cancer cells, SH-SY5Y neuroblastoma and HeLa cervical cancer cells, in mouse embryonic fibroblasts (MEF), in vivo in multiple mouse tissues (kidney, pancreas, liver, brain and heart), as well as in C. elegans embryos and adult pharyngeal cells. 41 Electron microscopy and immunofluorescence experiments indicate that p53 inactivation induces both autophagy of the ER (reticulophagy) and mitochondria (mitophagy). When p53 was inhibited in an acute fashion by addition of PFT-α, reticulophagy was induced more rapidly than mitophagy, suggesting an intimate relationship between p53 inhibition and ER stress (which also induces preferential reticulophagy). Accordingly, p53 triggered the phosphorylation of eIF2α, which is a hallmark of ER stress. Moreover, the knockdown or knockout of IRE1 , one of the quintessential ER stress effectors, reduced autophagy induction by p53 inactivation. 41

Inhibition of p53 caused autophagy in enucleated cells, indicating that the cytoplasmic, nonnuclear pool of p53 can regulate autophagy. We also observed that retransfection of p53 −/− cells with wild-type (WT) p53 suppressed autophagy and that this effect could be mimicked by a p53 mutant that is excluded from the nucleus, due to the deletion of the nuclear localization sequence. In contrast, retransfection of p53 −/− cells with a nucleus-restricted p53 mutant (in which the nuclear localization sequence has been deleted) failed to inhibit autophagy. Hence, cytoplasmic (but not nuclear) p53 is responsible for the inhibition of autophagy. Several distinct autophagy inducers (npr., nutrient depletion or addition of rapamycin, lithium, tunicamycin or thapsigargin) stimulated the rapid degradation of p53. The p53 protein was depleted both from the nucleus and from the cytoplasm, with similar kinetics. Inhibition of the p53-specific E3 ubiquitin ligase MDM2 (by two distinct pharmacological inhibitors or by knockdown) avoided p53 depletion and simultaneously prevented the activation of autophagy. Finally, a p53 mutant that lacks the MDM2 ubiquitinylation site and hence is more stable than WT p53 was particularly efficient in inhibiting autophagy. 41

In conclusion, p53 has a dual function in the control of autophagy. On the one hand, nuclear p53 can induce autophagy through transcriptional effects. On the other hand, cytoplasmic p53 may act as a master repressor of autophagy. How this latter effect is achieved in mechanistic terms is not clear yet (Figure 1).

Cytoplasmic protiv nuclear effects of p53. p53 has a Janus role in the control of autophagy. Nuclear p53 promotes the transcription of proapoptotic and cell cycle-arresting genes, and also can act as an autophagy-inducing transcription factor. In contrast, cytoplasmic p53 degradation exerts an autophagy-inhibitory function. Both of the p53 ‘faces’ are not completely known at molecular level