Informacija

Ima li čvorova u DNK?

Ima li čvorova u DNK?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ovo pitanje može zvučati glupo. Kako to da molekule DNK nisu potpuno zapletene s vremenom u stanici? Ako uzmem dugačke žice u kutiju i protresem je, to bi stvorilo čvorove i ne bih mogao lako izolirati svaki niz.

No tijekom mitoza, kromosomi su potpuno izolirani jedni od drugih, dok u protivnom DNK slobodno pluta u jezgri.


Mislim da je ključni faktor to što molekule DNK nisu pasivni dijelovi niza koji su ostavljeni da se slobodno kreću (što uzrokuje čvorove u stvarima nalik nizovima koje se predugo ostavljaju same).

S jedne strane, molekula DNA aktivni je dio staničnog metabolizma, jer se neprestano transkribira (za stvaranje RNA i proteina), kopira ili korigira itd. Kao dio svoje uloge u metabolizmu, molekula DNA usko je povezana s molekulama RNA, bjelančevinama i posebno proteinima oko kojih je DNA omotana, nazvanim "histoni". Stranica Wikipedia za "Chromatin" (od čega su kromosomi u osnovi napravljeni) opisuje različite aspekte ove organizacije, uključujući:

Ta DNA koja kodira gene koji se aktivno transkribiraju ("uključeno") labavije je pakirana i povezana je s RNA polimerazama (naziva se euhromatin), dok je ona DNK koja kodira neaktivne gene ("isključena") kondenzirana i povezana sa strukturnim proteini (heterokromatin).

Dakle, DNK neprestano manipuliraju sve vrste proteina i enzima koji utječu na njezin oblik i položaj u prostoru; ne leži samo tamo. Koliko god bi moglo doći do čvorova, to bi vjerojatno bilo dio manipulacije enzimima i proteinima ili bi se oni s njima prilično lako nosili. To međutim ne znači da DNK nema čvorove, zapravo se čini da može:

TEORIJA DNK I ČVOROVA (s Instituta za modeliranje okoliša na Sveučilištu Tennessee)

Zaključci: Načela topologije daju staničnim biolozima kvantitativan, snažan i invarijantan način mjerenja svojstava DNK. Načela teorije čvorova pomogla su razjasniti mehanizme pomoću kojih enzimi raspakiraju DNA. Osim toga, topološke metode bile su utjecajne u određivanju lijevog namota DNA oko histona. Mjerenje promjena broja križanja također je bilo važno za razumijevanje prestanka replikacije DNA i uloge enzima u rekombinaciji.

(imajte na umu da se u ovom radu razmatra DNK u E.coli, koja svoju DNK ne organizira u kromatinu na način na koji to čine Eukarioti).

Raspetljavanje DNK (iz Priroda blog CreatureCast, 2013)

Ova veza uključuje video zapis o topoizomerazama, enzimima koji se također spominju u prethodnoj vezi i koji raspetljavaju DNK.

Monte Carlo studija čvorova u dugim dvolančanim DNK lancima (PLOS Računska biologija, 2016)

Citat iz sažetka:

Iako se naš grubozrnati model temelji samo na eksperimentalnim vjerojatnostima čvorova kratkih niti DNA, on reproducira ispravnu duljinu postojanosti DNA. To ukazuje da čvorovi nisu samo fino mjerilo za strukturna svojstva, već i obećavajući alat za dizajn polimernih modela.

Aktivno mjesto domene SET izgrađeno je na čvoru (Priroda Strukturna biologija, 200)
Čvor ili ne čvor? Postavljanje zapisa "ravno" na proteine ​​(Računska biologija i kemija, 2003)

Ovi radovi raspravljaju o potencijalnim čvorovima unutar histonskog proteina, a ne DNA, ali ilustriraju da topologija i čvorovi mogu biti važni u makromolekulama:

Čvor unutar domene SET pomaže u stvaranju aktivnog mjesta metiltransferaze, gdje se veže AdoHcy i vjerojatno će doći do metilacije lizina.

Novi čvor pronađen u domenu SET ispituje se u svjetlu pet novijih kristalnih struktura i njihovih opisa u literaturi. Koristeći Taylorov algoritam utvrđeno je da okosnički lanac ne čini pravi čvor.

Otkriće predviđenog DNK čvora potvrđuje model za rekombinaciju specifičnu za mjesto (Znanost, 1985)

Ova je veza pomalo bolna za čitanje (i od 1985. pa ne znam je li zamijenjena, ali ima preko 200 citata) pa ću je ostaviti na naslovu.

I na kraju ovaj članak, koji sam pogledao na kraju, ali sam ga vjerojatno trebao pogledati jer prva rečenica sažetka doslovno odgovara na vaše pitanje:

Izravno promatranje DNK čvorova pomoću čvrstog nanopora (Nanotehnologija prirode, 2016)

Duge molekule DNA mogu se same zaplesti u čvorove. Eksperimentalne tehnike promatranja takvih DNK čvorova (prvenstveno elektroforeza u gelu) ograničene su na skupne metode i kružne molekule duljine ispod 10 kilobaznih parova. Ovdje pokazujemo da se nanopore u čvrstom stanju mogu koristiti za izravno promatranje pojedinačnih čvorova u linearnim i kružnim pojedinačnim molekulama DNA proizvoljne duljine.


Promatranje prolaska čvornate DNK kako klizi kroz nanopore

Svatko tko je bio na jedrilici zna da je vezivanje čvora najbolji način da se uže pričvrsti za udicu i spriječi njegovo klizanje. Isto se odnosi i na niti za šivanje gdje se uvode čvorovi kako bi se spriječilo njihovo klizanje kroz dva komada tkanine. Kako onda mogu dugi DNK niti, koji imaju zavojitu i visoko čvornu strukturu, uspjeti proći kroz male pore različitih bioloških sustava? Ovo je fascinantno pitanje kojim su se pozabavili Antonio Suma i Cristian Micheletti, istraživači s Međunarodne škole za napredne studije (SISSA) u Trstu koji su pomoću računalnih simulacija istraživali mogućnosti genetskog materijala u takvim situacijama. Studija je upravo objavljena u PNAS.

"Naša računska studija baca svjetlo na najnovija eksperimentalna dostignuća u manipulaciji čvorovanom DNK i dodaje zanimljive i neočekivane elemente", objašnjava Micheletti. "Prvo smo primijetili kako čvorovi DNK niti prolaze kroz sitne pore promjera oko 10 nanometara (10 milijarditih dijelova metra). Ponašanje zapaženo u našim simulacijama bilo je u dobrom skladu s eksperimentalnim mjerenjima dobivenim od međunarodnog istraživačkog tima predvođenog Ceesom Dekkerom , koji su objavljeni prije samo nekoliko mjeseci u Nature Biotechnology. Ovi napredni i sofisticirani eksperimenti označili su prekretnicu za razumijevanje DNK čvorova. Međutim, trenutni pokusi ne mogu "vidjeti" kako DNK čvorovi zapravo prolaze kroz uske pore. Zapravo, fenomen se događa u sićušnom prostornom mjerilu, pa je stoga nedostupan mikroskopima. Upravo je to razlog zašto je naša skupina pribjegla onome što je veliki njemački biofizičar Klaus Schulten nazvao "računalni mikroskop", odnosno računalnim simulacijama.

Suma i Micheletti objašnjavaju: "Simulacije su otkrile da se prolazak čvora može dogoditi na dva različita načina: jedan gdje je čvor čvrst, a drugi gdje je čvor više delokaliziran. U oba slučaja čvor ne samo da uspijeva proći kroz pore, ali to čini u vrlo kratkom vremenu. " Štoviše, čvor obično prolazi u završnoj fazi translokacije, kada je većina lanca DNA već prošla. "Ali postoji još nešto što je kontraintuitivno", navode autori, "čini se da veličina čvora, bio on mali ili veliki, ne utječe mnogo na vrijeme začepljenja pora. Ovo posljednje umjesto toga ovisi o brzini translokacije, koja u okret, ovisi o početnom položaju čvora duž niti. " Ovi bi rezultati, kažu istraživači, trebali pomoći u osmišljavanju budućih pokusa koji će ispitivati ​​spontano vezanje DNK, još uvijek u velikoj mjeri neistraženo mjesto, posebno u pogledu veličine DNK čvorova.

Napredovanje našeg trenutnog razumijevanja čvorova u biološkim molekulama važno je razjasniti njihove implikacije u biološkom kontekstu, kao i u aplikativnim, poput sekvenciranja DNA pomoću nanopora. Suma i Micheletti nadaju se da obećavajući smjerovi predloženi njihovom studijom mogu dovesti do detaljnijeg i točnog profiliranja zapletenosti u DNK, RNK i proteine.


Postoje li čvorovi u kromosomima?

Nedavni razvoj događaja po prvi je put omogućio određivanje trodimenzionalnih struktura pojedinih kromosoma i genoma u jezgrama jednostrukih haploidnih stanica embrionalnih matičnih stanica miša (ES) na temelju kontaktnih podataka o konformaciji Hi⁻C kromosoma. Iako ove prve strukture imaju relativno nisku razlučivost, one daju prve eksperimentalne podatke koji se mogu koristiti za proučavanje kromosomskog i netaknutog savijanja genoma. Ovdje dalje analiziramo ove strukture i pružamo prve dokaze da su kromosomi faze G1 vezani čvorovima, u skladu s činjenicom da grafikoni vjerojatnosti kontakta u odnosu na razdvajanje sekvence pokazuju ovisnost o zakonu moći koja je međuizmeđu one fraktalne kugle i ravnotežne strukture.

Ključne riječi: DNK kromosomske teritorije kromosomi fraktalni globularni čvorovi.

Izjava o sukobu interesa

Nema sukoba za prijavljivanje.

Figure

Struktura netaknutog genoma ...

Struktura netaknutog genoma modela 3 iz stanice br. 2. Kromosomi ...

Promjena vjerojatnosti eksperimentalnog kontakta ...

Varijacija eksperimentalne vjerojatnosti kontakta s razdvajanjem sekvence izračunatom za svih 8 ćelija.…

Shematski crteži pet ...

Shematski crteži pet najjednostavnijih čvorova (0 0, 3 1…

Struktura kromosoma 14 iz…

Struktura kromosoma 14 iz stanice 2 [48]. Ploča ( a ) pokazuje ...

Stabilnost čvora prema slučajnim pomacima njegovih čvorova. Vjerojatnost…


DNK: Razrada čvorova

DNK, kao i ostale makromolekule, ima sklonost samozapetljavanju. Međutim, čimbenici koji kontroliraju stvaranje čvorova i njihovu ulogu u biološkim procesima slabo su razumljivi zbog nedostatka odgovarajućih tehnika promatranja. Sada, koristeći čvrsti sustav nanopora, istraživači su u stanju ispitati prirodu ovih nedostižnih značajki.

Ranije su se za ispitivanje DNK čvorova koristile različite eksperimentalne tehnike, međutim sve su to skupne metode koje su ograničene na relativno kratke (<10 kilobaznih parova) i/ili kružnu DNK. Nasuprot tome, tehnika nanopora koju su prijavili Cees Dekker i suradnici u Nanotehnologija prirode omogućuje promatranje pojedinačnih čvorova u proizvoljno dugoj, dvolančanoj linearnoj i kružnoj DNK. "Iako su takvi čvorovi najčešći na dugim duljinama, prije naše tehnike nije bilo metode za promatranje čvorova u dugim molekulama DNA", objašnjava Dekker.

Nanopore u čvrstom stanju koriste se za proučavanje temeljnih svojstava biomolekula na razini jedne molekule i njihove interakcije (na primjer, između DNA i proteina), kao i odvajanje i sekvenciranje DNA. Tehnika uključuje električni potencijal koji se primjenjuje na membranu koja sadrži nanopor (tipično širine oko 20 nm) s spremnikom napunjenim elektrolitom s obje strane. Nabijena biomolekula (poput DNK) pokreće se kroz nanopore elektroforetskom silom, gdje uzrokuje blokadu ionske struje koja ovisi o volumenu polimera u porama, a u slučaju DNA i o specifičnim parovima baza .

Iako je translokacija DNA kroz nanopore temelj nekoliko aplikacija u komercijalnom razvoju (na primjer, za otkrivanje i sekvenciranje) i pogodna je za velike molekule DNA, tehnika prethodno nije dala podatke o prisutnosti i prirodi čvorova. Dekkerov tim proučava DNK osjet u nanoporama više od 15 godina. "Otkad sam počeo raditi na translokaciji DNA kroz nanopore, pitao sam se zašto bi DNK prešla tako male pore na lijep način od glave do repa, a da pritom ne naiđe na čvorove", kaže Dekker. Sada, naoružani puno većom vremenskom razlučivošću u odnosu na njihov prethodni sustav nanopora, pokazali su da je moguće ne samo otkriti čvorove, već i dobiti neviđene, detaljne informacije o njihovim svojstvima.

Znanstvenici su istraživali kako pojava čvorova ovisi o duljini DNA (do 166 kilobaznih parova), kao i o veličini i položaju pojedinih čvorova. Pojava čvorova povećavala se s duljinom, s konstantnom vjerojatnosti po jedinici duljine, što je u skladu s rezultatima prethodnih teorijskih simulacija. Štoviše, pod visokim naponom primijetili su da su čvorovi u linearnoj DNK kliznuli dok je DNK prolazila kroz nanopor. Međutim, najznačajniji nalaz bio je da su čvorovi bili izuzetno čvrsti (<100 nm).

Implikacije ovog rada protežu se na svaku primjenu koja uključuje dugačke polimere, kao i temeljne studije čvorova u biološkim sustavima. "Prisutnost čvorova u velikoj je mjeri zanemarena u mnogim nanopornim aplikacijama, jer nas je ograničena razlučivost mjerenja spriječila da ih promatramo", objašnjava Dekker. "Sada kada smo pokazali da su čvorovi tu, važno ih je uzeti u obzir u aplikacijama, kao što je otkrivanje proteina vezanog za DNA, a posebno pri sondiranju dugih duljina DNK."

"Prisutnost čvorova u velikoj je mjeri zanemarena u mnogim aplikacijama nanopora, jer nas je ograničena rezolucija mjerenja spriječila da ih promatramo"

Cristian Micheletti, teoretičar i stručnjak za polimerne čvorove s Međunarodne škole za napredne studije u Trstu u Italiji, koji nije bio uključen u studiju komentira: „Ovo zorno potvrđuje predviđanje da je za uravnotežene DNK lance najvjerojatnija duljina čvora relativno mali. Međutim, prolaz kroz pore mogao je također pridonijeti zatezanju čvora, što smo primijetili u simulacijama translokacije čvorovane jednolančane DNK. ” Što se tiče prirodnog (iako izazovnog) produžetka ovog djela, Micheletti dodaje: "Nadam se da će ovo otkriće pomoći u otkrivanju jednolančanog zapleta DNA u bliskoj budućnosti." To bi bilo osobito važno za sekvenciranje, koje zahtijeva jednolančanu DNK.


Struktura DNK pruža mehanizam za nasljeđivanje

Geni nose biološke informacije koje se moraju točno kopirati za prijenos na sljedeću generaciju svaki put kada se stanica podijeli i tvori dvije stanice kćeri. Iz ovih zahtjeva proizlaze dva središnja biološka pitanja: kako se informacije za specifikaciju organizma mogu prenijeti u kemijskom obliku i kako se točno kopiraju? Otkriće strukture DNK dvostruke spirale bilo je prekretnica u biologiji dvadesetog stoljeća jer je odmah predložilo odgovore na oba pitanja, čime je na molekularnoj razini riješen problem nasljedstva. U ovom odjeljku ukratko raspravljamo o odgovorima na ova pitanja, a detaljnije ćemo ih ispitati u narednim poglavljima.

DNK kodira informacije kroz redoslijed ili niz nukleotida duž svakog lanca. Svaka baza 𠅊, C, T ili G — može se smatrati slovom u abecedi s četiri slova koja određuje biološke poruke u kemijskoj strukturi DNA. Kao što smo vidjeli u 1. poglavlju, organizmi se međusobno razlikuju jer njihove molekule DNA imaju različite nukleotidne sekvence i, posljedično, nose različite biološke poruke. No, kako se nukleotidna abeceda koristi za slanje poruka, i što oni navode?

Kao što je gore spomenuto, bilo je poznato mnogo prije nego što je utvrđena struktura DNA da geni sadrže upute za proizvodnju proteina. DNK poruke stoga moraju nekako kodirati proteine ​​(slika 4-6). Taj odnos odmah čini problem lakšim za razumijevanje, zbog kemijskog karaktera proteina. Kao što je objašnjeno u 3. poglavlju, svojstva proteina, koja su odgovorna za njegovu biološku funkciju, određena su njegovom trodimenzionalnom strukturom, a njegova struktura je pak određena linearnim nizom aminokiselina od kojih se sastoji. Linearni niz nukleotida u genu stoga mora nekako navesti linearni niz aminokiselina u proteinu. Točna podudarnost između četiri slova nukleotidne abecede DNK i azbuke aminokiselina s dvadeset slova bjelančevina — genetskog koda — nije očita iz strukture DNK, a prošlo je više od deset godina nakon otkrića dvostruke spirale prije nego što je bilo razrađeno. U 6. poglavlju detaljno opisujemo ovaj kôd tijekom razrade procesa, poznatog kao ekspresiju gena, putem kojega stanica prevodi nukleotidnu sekvencu gena u aminokiselinsku sekvencu proteina.

Slika 4-6

Odnos između genetskih informacija prenesenih u DNK i proteina.

Cjeloviti skup informacija u DNK organizma naziva se njegov genom i on nosi informacije za sve proteine ​​koje će organizam ikada sintetizirati. (Pojam genom također se koristi za opisivanje DNK koja nosi te podatke.) Količina informacija sadržanih u genomima je zapanjujuća: na primjer, tipična ljudska stanica sadrži 2 metra DNK. Ispisano nukleotidnom abecedom od četiri slova, nukleotidna sekvenca vrlo malog ljudskog gena zauzima četvrtinu stranice teksta (slika 4-7), dok bi kompletan niz nukleotida u ljudskom genomu ispunio više od tisuću knjige veličine ove. Uz ostale kritične informacije, sadrži upute za oko 30.000 različitih proteina.

Slika 4-7

Nukleotidna sekvenca gena humanog β-globina. Ovaj gen nosi informacije o aminokiselinskom slijedu jedne od dvije vrste podjedinica molekule hemoglobina, koja prenosi kisik u krvi. Drugačiji gen, α-globin (više.)

Pri svakoj diobi stanice stanica mora kopirati svoj genom kako bi ga proslijedila objema stanicama kćerima. Otkriće strukture DNK također je otkrilo princip koji omogućuje kopiranje: budući da svaki lanac DNK sadrži niz nukleotida koji je točno komplementaran s nukleotidnim nizom svoje partnerske niti, svaki lanac može djelovati kao predložak ili kalup , za sintezu nove komplementarne niti. Drugim riječima, označimo li dva DNK lanca kao S i S ′, niz S može poslužiti kao predložak za izradu novog lanca S ′, dok niz S ′ može poslužiti kao predložak za izradu novog lanca S (Slika 4-8). Tako se genetske informacije u DNK mogu točno kopirati prekrasnim jednostavnim postupkom u kojem se lanac S odvaja od lanca S ′, a svaki odijeljeni lanac tada služi kao predložak za proizvodnju novog komplementarnog lanca partnera koji je identičan njegovu bivši partner.

Slika 4-8

DNK kao predložak za vlastitu duplikaciju. Kako se nukleotid A uspješno spaja samo s T, a G s C, svaki lanac DNA može specificirati slijed nukleotida u svom komplementarnom lancu. Na taj se način dvostruko spiralna DNA može precizno kopirati. (više.)

Sposobnost svakog lanca molekule DNA da djeluje kao predložak za stvaranje komplementarne niti omogućuje stanici kopiranje ili ponoviti, svoje gene prije nego što ih prenese na svoje potomke. U sljedećem poglavlju opisujemo elegantne strojeve koje ćelija koristi za obavljanje ovog ogromnog zadatka.


Levitt, M. J. molec. Biol. 104, 59–107 (1976).

Némethy, G. & amp Scheraga, H.A. P. Velečasni Biophys. 10, 239–352 (1977).

Skolnick, J. i amp Kolinski, A. J. molec. Biol. 221, 499–531 (1991).

Chan, H.S. & amp Dill, K.A. Fizika danas 46, 24–32(1993).

Grosberg, A. & amp Nechaev, S. Adv. Polim. Sci. 106, 1–29(1993).

Connolly, M.L. Kuntz, I.D. & amp Crippen, G.M. Biopolimeri 19, 1167–1182 (1980).

Crowell, Richard, H. & amp Fox, Ralph, H. Uvod u teoriju čvorova (Ginn, New York, 1963.).

Burde, G. & amp Zieschang, H. Čvorovi (deGruyter, New York, 1985.).

Rolfsen, D. Čvorovi i poveznice (Publish or Perish, Berkeley, 1976.).

Wu, F.Y. Rev. Mod. Phys. 64, 1099–1131 (1992).

Koniaris, K. & amp Muthukumar, M. J. kem. Phys. 95, 2873–2881 (1991).


Saopćenje za medije

To je rsquos DNA, ali ne onakav kakvog ga poznajemo.

U prvom svijetu na svijetu australski su istraživači identificirali novu strukturu DNK nazvanu i-motiv & ndash unutar stanica. Uvrnuti & lsquoknot & rsquo DNK, i-motiv nikada prije nije izravno viđen unutar živih stanica.

Novi nalazi Instituta za medicinska istraživanja Garvan objavljeni su danas u vodećem časopisu Kemija prirode.

Duboko u stanicama našeg tijela nalazi se naša DNK. Podaci u DNK kodu & ndash svih 6 milijardi slova A, C, G i T & ndash daju precizne upute o tome kako su naša tijela izgrađena i kako rade.

Ikonski & lsquodouble helix & rsquo oblik DNK uzdrmao je javnu maštu od 1953. godine, kada su James Watson i Francis Crick slavno otkrili strukturu DNK. Međutim, sada je poznato da kratki dijelovi DNK mogu postojati u drugim oblicima, barem u laboratoriju i znanstvenici sumnjaju da bi ti različiti oblici mogli imati važnu ulogu u tome kako i kada je DNK kod & lsquoread & rsquo.

Novi oblik izgleda potpuno drugačije od dvolančane dvostruke spirale DNA.

& ldquoKada većina nas misli na DNK, mislimo na dvostruku spiralu, & rdquo kaže izvanredni profesor Daniel Christ (voditelj, Laboratorij za antitijela, Garvan) koji je vodio istraživanje. & ldquoOvo novo istraživanje podsjeća nas da postoje potpuno različite strukture DNK & ndash te bi mogle biti važne za naše stanice. & rdquo

& ldquoI-motiv je četverolančani & lsquoknot & rsquo DNK, & rdquo kaže izvanredni profesor Marcel Dinger (voditelj, Kinghorn centar za kliničku genomiku, Garvan), koji je zajedno s A/Prof. Christ vodio istraživanje.

& ldquoU strukturi čvora, C slova na istom lancu DNA vežu se jedno za drugo & ndash pa se to jako razlikuje od dvostruke spirale, gdje se & lsquoletters & rsquo na suprotnim nitima međusobno prepoznaju, a gdje se Cs vežu za Gs [gvanini]. & rdquo

Iako su istraživači već vidjeli i-motiv i detaljno su ga proučili, to je samo svjedoci in vitro & ndash, to jest, u umjetnim uvjetima u laboratoriju, a ne unutar stanica.

Zapravo, znanstvenici na terenu raspravljali su o tome hoće li i-motiv & lsquoknots & rsquo uopće postojati unutar živih bića & ndash pitanje koje se rješava novim nalazima.

Za otkrivanje i-motiva unutar stanica, istraživači su razvili precizan novi alat & ndash fragment molekule antitijela & ndash koji bi mogao specifično prepoznati i vezati se za i-motive s vrlo visokim afinitetom. Do sada je nedostatak antitijela specifičnog za i-motive ozbiljno kočio razumijevanje njihove uloge.

Ono što je najvažnije, fragment antitijela nije "otkrio" DNK u spiralnom obliku, niti je prepoznao "lsquoG-četverostruke strukture" (strukturno sličan četverolančani raspored DNA).

S novim alatom, istraživači su otkrili lokaciju & lsquoi-motiva & rsquo u nizu ljudskih staničnih linija. Koristeći fluorescentne tehnike kako bi odredili gdje su i-motivi locirani, identificirali su brojne mrlje zelene boje unutar jezgre, koje ukazuju na položaj i-motiva.

Najviše nas je uzbudilo to što smo mogli vidjeti zelene mrlje & ndash i-motive & ndash kako se pojavljuju i nestaju tijekom vremena, pa znamo da se oni stvaraju, otapaju i ponovno formiraju, & rdquo kaže dr. Mahdi Zeraati, čije istraživanje potkrepljuje nalaze i rezultate istraživanja.

Istraživači su pokazali da se i-motivi uglavnom stvaraju na određenoj točki staničnog ciklusa & rsquo & lsquolife ciklusa & rsquo & ndash kasne G1 faze, kada se DNK aktivno & lsquoread & rsquo. Također su pokazali da se i-motivi pojavljuju u nekim regijama promotora (područja DNA koja kontroliraju jesu li geni uključeni ili isključeni) i u telomerima, & lsquoend presjecima & rsquo kromosoma koji su važni u procesu starenja.

Dr Zeraati kaže: & ldquoMislimo da je dolazak i odlazak i-motiva trag onom što rade. Čini se vjerojatno da su oni tu da pomognu pri uključivanju ili isključivanju gena i utječu na to da li se gen aktivno čita ili ne. & Rdquo

& ldquoMi također mislimo da prolazna priroda i-motiva objašnjava zašto ih je do sada bilo tako teško pronaći u ćelijama, & rdquo dodaje A/Prof Christ.

A/Prof Marcel Dinger kaže: "ldquoI & rsquos je uzbudljivo otkriti potpuno novi oblik DNK u stanicama & ndash, a ti će nalazi postaviti temelje za potpuno novi poticaj da se shvati čemu ovaj novi oblik DNK zapravo služi i hoće li to utjecati na zdravlje i bolesti. & rdquo

Istaknuti papir: Mahdi Zeraati, David B. Langley, Peter Schofield, Aaron L. Moye, Romain Rouet, William E. Hughes, Tracey M. Bryan, Marcel E. Dinger i Daniel Christ. DNA strukture I-motiva nastaju u jezgrama ljudskih stanica. Kemija prirode 2018 DOI: 10.1038/s41557-018-0046-3

Podrška: Ovaj su rad podržali Nacionalno vijeće za zdravstvena i medicinska istraživanja (Australija) i Australsko istraživačko vijeće.


DNK KNOTING AND SUPECOILING

Ravnoteža čvorova

Važno pitanje povezano s međudjelovanjem supermotacije DNK i čvorova DNK jest kako utjecaj supernamotanja DNK na ravnotežu čvorova. Da bismo objasnili koncept čvorove ravnoteže, prvo razmotrimo zamišljenu situaciju, gdje torzijski opuštene, visoko razrijeđene kružne molekule DNA određene veličine podliježu toplinskim fluktuacijama tijekom kojih idealne topoizomeraze DNA tipa II dopuštaju presječne prolaze kad god se dva segmenta DNA sudaraju. . Takva će reakcija doseći ravnotežu čvorova kada će novi krugovi prolaza stvoriti nove DNK čvorove podjednako koliko će ih i poništiti, a kako reakcija bude dalje od ove točke, dio molekula koji su vezani ostat će prilično konstantan. Budući da su prolazi DNK-DNK posredovani DNK topoizomerazama u stvarnosti slučajni, ravnotežna čvorova obično je postignuta u pokusima u kojima su linearne molekule DNA prolazile kroz sporu reakciju ciklizacije zbog žarenja njihovih dugih kohezivnih krajeva. Nakon takvog žarenja, neke molekule postaju čvorovane, a vjeruje se da je dio čvornih molekula isti kao i onaj dobiven pri ravnoteži čvorova zbog slobodnih prolaza (35, 36). Nekoliko biokemijskih i numeričkih studija potvrdilo je intuitivnu ideju da se udio čvorova pri ravnoteži čvorova povećava s veličinom lanca molekula DNA i smanjuje se s povećanjem elektrostatičkog odbijanja između segmenata DNA, što opet ovisi o koncentraciji protuionica (35–37). Razmotrimo sada kako se mijenja ravnoteža čvorova kada se proučavana DNK aktivno održava u super namotanom obliku, kao što je to slučaj u živim bakterijskim stanicama. Smatramo hipotetičku, idealiziranu situaciju u kojoj bakterijski Topo IV izvodi međusegmentarne prijelaze koji mogu dovesti do stvaranja čvorova ili nepovezivanja svaki put kad se dva segmenta DNA sudaraju jedan s drugim (u stvarnosti, kako je dolje objašnjeno, odlomci posredovani Topom IV selektivni su i ovise o prostornom raspored segmenata DNA). Osim toga, smatramo da DNA giraza i Topo I kompenziraju moguće smanjenje ili povećanje torzijskog naprezanja DNK zbog stvaranja čvora ponovnom uspostavljanjem početne razine torzijskog naprezanja tipične za namotavanje super namotaja DNA. Hoće li ravnoteža čvorova u ustaljenom stanju u takvim uvjetima rezultirati većim ili manjim udjelom molekula DNK u čvoru nego u ravnoteži čvorova koja uključuje torzijski opuštene molekule DNK ?.

Studije o in vivo formirani čvorovi u Escherichia coli otkrili su da pBR322 plazmidi uzgojeni u E coli sojevi s neispravnom DNA girazom bili su do 10 puta češće čvorovi nego plazmidi uzgojeni u sojevima divljeg tipa (38). Budući da je DNA giraza odgovorna za održavanje DNK u super namotanom obliku i nije nepoznata topoizomeraza po sebi, budući da je Topo IV (39), ovaj rezultat daje snažan pokazatelj da supermotacija DNK pomaže Topu IV u održavanju DNK nezapaženom u živim bakterijskim stanicama. Također je istražen učinak supermotacije na nesuženje in vitro uspoređivanjem razvezivanja superkokuriranih i nepresavijenih molekula DNA prema Topu IV (39), tj. enzimu za koji se vjeruje da je odgovoran za razdvajanje DNK i dekatenaciju DNA u E coli. Autori te studije došli su do zaključka da supernamotavanje DNK ne povećava značajno stopu nepovezivanja prema Topu IV (39). Međutim, pomniji pogled na prezentirane podatke jasno otkriva da, iako se činilo da se složeni DNK čvorovi podjednako brzo transformirali u jednostavnije čvorove pomoću Topa IV, neovisno o tome jesu li bili super namotani ili ne, nesvesnost manje složenih čvorova, poput čvorova trolista, bila je očito stimulirano super namotavanjem DNA, dok su se čvorovi trolista nakupljali kada je Topo IV djelovao na mješavinu složenih DNK čvorova koji nisu bili namotani [vidi sliku 7 u ref. (39)]. Vjerojatno objašnjenje ovog ponašanja je da prisutnost jednostavnih čvorova u ne-supermotanim molekulama DNK ne proizvodi dovoljan energetski gradijent koji bi mogao dovesti do nepovezivanja, pa je stoga taj gradijent potrebno pojačati supermotanjem DNA. Za složene čvorove, međutim, dobitak energije zbog prolaska niti koji dovodi do pojednostavljenja čvorova dovoljno je velik da usmjeri te prolaze čak i u odsutnosti DNK supermotacije.

Energetske komponente uzajamnog djelovanja između DNK čvorova i supermotacije

Kao što je gore rečeno, in vivo i in vitro studije podupiru shvaćanje da superkolubrikacija DNA inhibira stvaranje DNK čvorova. Međutim, ova inhibicija ne mora biti povezana s promjenom gradijenta slobodne energije uvedenom supermotacijom DNA, već je posljedica ATP -ovog trošenja Topo IV djelovanja koje ne mora slijediti gradijent slobodne energije molekula DNA. Točnije, supernamotavanje DNK moglo bi pomoći Topu IV u odabiru prolaza koji vode do nepovezivanja čak i ako ne slijede gradijent slobodne energije u sustavu. Stoga nam gore razmotrene studije zapravo ne govore mijenja li DNK supermotacija mijenja gradijent energije na način koji pogoduje stvaranju čvorova DNK. Međutim, simulacijske studije, u kojima se može kontrolirati energija i topologija modeliranih molekula DNA, i gdje se također može postaviti uvjet da se prolazi događaju neovisno o određenom prostornom rasporedu sudarajućih segmenata, mogle bi nam dati te podatke.

Zanimljivo je da su dvije različite simulacijske studije koje su istraživale učinak supermotacije DNA na DNK čvorove došle do suprotnih zaključaka. Dok je Podteležnikov et al. (11) zaključili su da supernamotavanje DNA stimulira DNK stvaranje čvorova, Burnier et al. (40) zaključio je suprotno. Istražimo razloge tog neslaganja. Obje su studije koristile vrlo sličnu simulacijsku metodu Metropolis – Monte Carlo koja uzima u obzir elastična svojstva DNA i učinkoviti promjer DNA (4). Tijekom simulacijskog postupka Metropolis – Monte Carlo, modelirane molekule stalno mijenjaju svoj oblik i istražuju raspoloživi konfiguracijski prostor. Potonji se može promatrati kao sklop svih mogućih konfiguracija elastičnog lanca pod utjecajem toplinskog miješanja, i naravno, u tom će se nizu energetski povoljnije konfiguracije češće pojavljivati. Stoga, ako bi vezanje superkoluliranih molekula bilo energetski povoljno, treba uočiti snažnu tendenciju da se superkolulirane molekule DNK vežu. Toplinsko kretanje samo po sebi ne može proći kroz dva segmenta DNA. Stoga, kako bi se objasnilo djelovanje DNK topoizomeraza, tijekom simulacije treba dopustiti pomake segmenata koji vode do prolaza niti, a time i moguće do čvorova ili nepovezivanja. Međutim, ako su međusegmentarni prolazi dopušteni bez ikakvih ograničenja u pogledu topološkog stanja molekula, simulirane superkolulirane molekule DNA brzo se opuštaju. Time se poništavaju simulacije koje imaju za cilj provjeriti učinak održavanja DNK u supermotanom obliku na tendenciju da molekule DNA postanu čvorovane ili nepovezane.

Nekoliko ranijih simulacijskih studija pokazalo je da, nakon postavljanja fiksnog ΔLk (razlika između stvarnog Lk modeliranih molekula i njihovog Lk0), a nakon dopuštanja međusegmentarnih prolaza koji nisu rezultirali stvaranjem čvorova, simulirane superkolulirane molekule DNK zadržale su svoju izvornu supermotanost, pa čak i uzorkovale na učinkovitiji način konfiguracijski prostor u usporedbi sa simulacijama u kojima međusegmentni prolazi nisu bili dopušteni (4) . Na primjer, s ovom tehnikom, simulirane konfiguracije supersavijenih molekula DNA izgledale su poput onih promatranih elektronskom mikroskopijom (41). Podteležnikov et al. (42), u svojim simulacijama istražujući međusobnu interakciju između supermotacije DNK i čvorova DNK, dopustili su i ove poteze koji su rezultirali prijelazima od nepoznatih u čvorove i obrnuto, a ΔLk je ostao fiksiran. S tom postavkom, simulirane super namotane molekule DNK postajale su progresivno čvornate, tvoreći torusne čvorove s sve većom složenošću. Na temelju toga, autori su zaključili da bi molekule DNK koje drže ΔLk tipične za negativno superkokulirane molekule DNK imale tendenciju prolaziti prolazi što dovodi do stvaranja lijevih torusnih čvorova.

Doista bi to bio slučaj da odlomci posredovani Topo II nisu mijenjali povezujući broj molekula DNA pri svakom intramolekularnom prolazu. Znamo, međutim, da topo II posredovani prijelaz od nenavezanih molekula DNA do lijevih čvorova trolista zahtijeva smanjenje broja povezivanja za 2. Tako, na primjer, ako se krene sa super namotanom molekulom s ΔLk = −5 i obaviće se nužan prolaz što dovodi do stvaranja lijevog čvora trolista, ΔLk te molekule promijenio bi se na -7 (slika 3A). Slijedom toga, pravi bi prolaz bio energetski nepovoljan za razliku od zamišljenog prolaza posredovanog topo II s nerealnim svojstvom održavanja konstante ΔLk (slika 3A). Osim toga, čak i ako se realan prolaz dogodio, tada bi DNA giraza djelovala tako da ponovno uspostavi prethodnu razinu torzijskog naprezanja, što bi dovelo molekulu u stanje s ΔLk oscilirajućim ∼ − 8,41. (Slika 3A) To je posljedica formule: Lk = Tw + Wr i činjenice da je Wr torzijski opuštenog lijevo čvornog trolisnog čvora ∼ − 3,41 (43). Stoga je Lk0 u torzijski opuštenih čvorova trolista lijeve ruke manji je nego u torzijski opuštenih molekula DNK bez veza. Da bi se objasnila promjena Lk0 zbog čvorova, Burnier et al. (40) uveo koncept efektivnog ΔLk (ΔLke), koji je razlika broja povezivanja između Lk0 torzijski opuštenog čvora zadanog tipa uključujući nepoznat i stvarni Lk modelirane DNA koji tvori istu vrstu čvora. Kad je modeliranim molekulama dopušteno promijeniti vrstu čvora, ali zadržati isti ΔLke, njihova torzijska napetost približno se čuva. Simulacije provedene u takvim uvjetima otkrile su da super namotavanje usmjerava međusegmentarne prolaze prema nepoznatosti budući da se najniže energetsko stanje molekula DNA s danim ΔLke postiže za nenavezane molekule DNA, a to neovisno o tome jesu li formirani čvorovi lijevo ili desno ( 40). Međutim, ovdje je potrebno navesti da se simulacije izvedene u uvjetima održavanja istog ΔLke prije i poslije prolaza koji vode do stvaranja čvora temelje na nerealnoj pretpostavci da se torzijska napetost ponovno uspostavlja odmah nakon prolaska, dok će u stvarnosti biti potrebno neko vrijeme dok homeostatski mehanizmi koji kontroliraju razinu torzijskog naprezanja ponovno uspostave izvornu razinu torzijskog naprezanja (27). Druga je pretpostavka da prolaze posredovane topoizomerazom pokreće gradijent slobodne energije, dok u stvarnosti topoizomeraze DNA tipa II povezuju energiju hidrolize ATP-a s izvedenim prolazom i mogu djelovati protiv gradijenta slobodne energije (26). Međutim, ove su pretpostavke potrebne kako bi se procijenila važnost energetskih razmatranja u proučavanju ravnoteže čvorova u stacionarnom stanju u prisutnosti homeostatskih mehanizama koji održavaju kvazi-konstantnu razinu torzijskog naprezanja DNA u supermotanoj DNA.

DNK čvorovi, super namotavanje i geometrijska kiralnost. (A) Usporedba elastičnih energija simuliranih negativno superkoluliranih molekula DNA s 3000 bp koje su bile nezapažene ili su formirale lijeve čvorove trolista [grafikon energije reproduciran je iz ref. (40)]. ΔLk se odnosi na razliku između stvarnog povezujućeg broja molekula DNK u čvoru ili s nevezom i broja torzijski opuštenih molekula DNK bez torzije. Svijetloplava strelica označava energetsku razliku između molekula DNK bez čvorova i čvorova s ​​istim ΔLke. The dark blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules resulting from one round of a Topo II-like action. The black arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules under the unrealistic assumption that topoisomerase II could mediate an intramolecular passage reaction without changing the linking number. Note that left-handed trefoil knots reach their minimal energy state for ΔLk ≈3.5 and that this closely corresponds to the average writhe of torsionally relaxed left-handed trefoil knots ( 43) (shown in the inset). For the convenience of the presentation the figure shows three different energetic consequences of formation of left-handed trefoil knot starting from unknotted DNA molecules that were kept at their supercoiling equilibrium at ΔLk ≈ −5. However, natural supercoiling of 3000 bp-long DNA would rather keep the unknotted molecules at ΔLk ≈−15. Therefore, at physiological level of negative supercoiling the passages leading to knot formation will be much stronger opposed by the free energy gradient than for the case analysed here. (B) The concept of geometrical chirality. To determine the geometrical chirality of a crossing one looks what is the smallest rotation of the overlying segment that brings it parallel with the underlying one. If that rotation is clockwise the crossing is left-handed and it is right-handed otherwise. (C) Knot 52L with indicated geometrical chirality of their crossings. An intersegmental passage at any of left-handed crossing will unknot the knot, while a passage at any of right-handed crossings will convert the 52L knot into 31L knot.

DNA knots, supercoiling and the geometric chirality. (A) Comparison of the elastic energies of simulated negatively supercoiled DNA molecules with 3000 bp that were either unknotted or formed left-handed trefoil knots [the energy graph is reproduced from ref. ( 40)]. ΔLk refers to the difference between the actual linking number of knotted or unknotted DNA molecules and that of torsionally relaxed unknotted DNA molecules. The light blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules with the same ΔLke. The dark blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules resulting from one round of a Topo II-like action. The black arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules under the unrealistic assumption that topoisomerase II could mediate an intramolecular passage reaction without changing the linking number. Note that left-handed trefoil knots reach their minimal energy state for ΔLk ≈3.5 and that this closely corresponds to the average writhe of torsionally relaxed left-handed trefoil knots ( 43) (shown in the inset). For the convenience of the presentation the figure shows three different energetic consequences of formation of left-handed trefoil knot starting from unknotted DNA molecules that were kept at their supercoiling equilibrium at ΔLk ≈ −5. However, natural supercoiling of 3000 bp-long DNA would rather keep the unknotted molecules at ΔLk ≈−15. Therefore, at physiological level of negative supercoiling the passages leading to knot formation will be much stronger opposed by the free energy gradient than for the case analysed here. (B) The concept of geometrical chirality. To determine the geometrical chirality of a crossing one looks what is the smallest rotation of the overlying segment that brings it parallel with the underlying one. If that rotation is clockwise the crossing is left-handed and it is right-handed otherwise. (C) Knot 52L with indicated geometrical chirality of their crossings. An intersegmental passage at any of left-handed crossing will unknot the knot, while a passage at any of right-handed crossings will convert the 52L knot into 31L knot.

Geometric components of the interplay between DNA supercoiling and DNA knotting

The free energy gradient provided by DNA supercoiling helps to guide DNA topoisomerases towards efficient unknotting, but this is not sufficient to explain the complexity of the interplay between DNA supercoiling, knotting and catenation. If DNA topoisomerases were simply catalysing reactions along the free energy gradient, then supercoiled DNA molecules in living bacterial cells would be subject to topoisomerase-mediated reactions leading to their rapid torsional relaxation. So for example, bacterial type I DNA topoisomerases, which perform passages of one strand through the other, would relax the torsional stress in supercoiled DNA. However, as the negative torsional stress is required for normal functioning of bacterial DNA, a metabolic short circuit would appear in this case, with type I topoisomerases constantly relaxing negatively supercoiled DNA molecules and with many molecules of DNA gyrase using ATP to re-establish the original level of negative supercoiling. Such a metabolic short-circuit would exhaust the cellular pool of ATP, and is in reality avoided trough molecular mechanisms that evolved to ensure that bacterial type I topoisomerases are only activated by an excessive torsional stress of the DNA or by the appearance of atypical DNA structures ( 27). The excessive torsional stress can be directly sensed at the local DNA level by the facility of strand separation, for example, and this provides the molecular basis of the mechanism protecting normally supercoiled DNA from the action of type I topoisomerases ( 27).

However, it seems more difficult to imagine molecular mechanisms that make naturally supercoiled DNA very good substrate for Topo IV-mediated passages leading to decatenation and unknotting but not to relaxation of negative supercoils ( 39). Since DNA topoisomerases are relatively small compared to overall dimensions of plasmid or chromosomal DNA, they can only distinguish between some local features that are characteristic for unperturbed negatively supercoiled DNA and these that appear in DNA molecules that are knotted and catenated. If there are such structural differences, then type II DNA topoisomerases could have acquired during the evolution the capacity to act preferentially on the DNA–DNA juxtapositions arising due to knotting or catenation, but not on those arising due to negative supercoiling.

Single molecule studies investigating the action of bacterial topoisomerase IV on braided DNA molecules revealed that it acts preferentially on left-handed braids having a local segment juxtaposition geometry similar to that of positively supercoiled DNA, while it leaves right-handed braids, comparable to negative supercoils, practically untouched (see Figure 3 for the explanation of the geometrical chirality of DNA–DNA juxtapositions) ( 44– 46). These observations made a perfect sense as they explained why DNA molecules that are negatively supercoiled are practically immune to Topo IV relaxation, while positive supercoiling that arises during DNA replication can be efficiently relaxed by Topo IV, permitting further progression of the replication forks ( 47). Comparing DNA–DNA juxtapositions in positively- and negatively-supercoiled DNA, one notices that both types have a hooked character ( 48) but can be distinguished by the opposite geometric chirality of winding of juxtaposing segments ( 45, 46).

It is important to mention here the difference between topological and geometric chirality. To determine the topological chirality one needs to operate with the concept of oriented curves and be aware in which direction the imaginary orientation vectors are pointing when two segments of DNA contact each other. Clearly, enzymes cannot recognize imaginary vectors. However, enzymes can recognize geometrical chirality of crossings if their DNA binding sites are arranged in such a way that, when the first DNA molecule is bound, the second can be bound on top of it but only at a certain relative inclination angle with respect to the already bound DNA segment. Depending on that angle, the enzyme may preferentially interact with DNA segments that wind around each other in left- or right-handed way ( 49, 50). In negatively supercoiled DNA the topological sign of perceived intramolecular crossings is negative, however, the opposing DNA segments of negatively supercoiled DNA molecules wind around each other in a right-handed way. The left-handed direction of winding is then characteristic for the juxtapositions in positively supercoiled DNA molecules ( Figure 4) and those are preferentially recognized by Topo IV.

Topological transitions during replication of circular DNA. (A) Supercoiled DNA that just started its process of DNA replication. The molecule is still negatively supercoiled and shows right-handed interwinding. The negative supercoiling helps to initiate the process of DNA replication ( 7). (B) Partially replicated DNA molecule with positive torsional stress causing formation of left-handed interwinding in the unreplicated portion and of right-handed interwinding of precatenanes in the replicated portion. The left-handed interwinding can be easily relaxed by DNA gyrase or by topoisomerase IV. Right-handed interwinding is a poor substrate for the relaxation reaction by Topo IV. (C) Standard representation of freshly replicated molecules forming multiply interlinked DNA catenanes. All crossings in this representation have right-handed chirality but this representation is not the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. (D) Schematic presentation of the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. Minimization of the elastic energy of multiply interlinked catenanes leads to the formation of a left-handed folding of the entire catenanes ( 21, 78). This folding leads to the apparition of left-handed DNA–DNA juxtapositions that are very good substrates for Topo IV-mediated passages that lead to decrease of DNA catenation. (E) Catenanes with decreasing number of interlinks. Individual rings get supercoiled by DNA gyrase, and left-handed crossings may form in the region deformed by the extrusion of supercoils. (Ž) Singly interlinked catenanes have a complete freedom to form left-handed juxtapositions. Supercoiling provides the necessary ‘pressure’ leading to unlinking. The representations of DNA molecules at different steps of DNA replication are not shown at the same scale but their size was chosen in order to make important points clear. However, all the drawings correspond to sequential stages of DNA replication of a molecule with 800 bp.

Topological transitions during replication of circular DNA. (A) Supercoiled DNA that just started its process of DNA replication. The molecule is still negatively supercoiled and shows right-handed interwinding. The negative supercoiling helps to initiate the process of DNA replication ( 7). (B) Partially replicated DNA molecule with positive torsional stress causing formation of left-handed interwinding in the unreplicated portion and of right-handed interwinding of precatenanes in the replicated portion. The left-handed interwinding can be easily relaxed by DNA gyrase or by topoisomerase IV. Right-handed interwinding is a poor substrate for the relaxation reaction by Topo IV. (C) Standard representation of freshly replicated molecules forming multiply interlinked DNA catenanes. All crossings in this representation have right-handed chirality but this representation is not the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. (D) Schematic presentation of the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. Minimization of the elastic energy of multiply interlinked catenanes leads to the formation of a left-handed folding of the entire catenanes ( 21, 78). This folding leads to the apparition of left-handed DNA–DNA juxtapositions that are very good substrates for Topo IV-mediated passages that lead to decrease of DNA catenation. (E) Catenanes with decreasing number of interlinks. Individual rings get supercoiled by DNA gyrase, and left-handed crossings may form in the region deformed by the extrusion of supercoils. (Ž) Singly interlinked catenanes have a complete freedom to form left-handed juxtapositions. Supercoiling provides the necessary ‘pressure’ leading to unlinking. The representations of DNA molecules at different steps of DNA replication are not shown at the same scale but their size was chosen in order to make important points clear. However, all the drawings correspond to sequential stages of DNA replication of a molecule with 800 bp.

The geometry of positively supercoiled DNA favours not only left-handed crossings of the formed DNA–DNA juxtapositions but also hooking of contacting DNA segments. Interestingly, the preferential action of type II DNA topoisomerases on hooked juxtapositions was also proposed as the mechanism that explained the seminal experiment by Rybenkov et al. ( 30, 51). This experiment demonstrated that type II DNA topoisomerases acting in vivo on torsionally relaxed DNA keep the level of DNA knotting and catenation much below the topological equilibrium that would have arisen if the passages were simply driven by the free energy gradient ( 30). Type II DNA topoisomerases couple their DNA–DNA passage reaction to ATP hydrolysis and therefore there is no violation of thermodynamic principles connected to the fact that action of type II DNA topoisomerases on a statistical set of plasmid DNA molecules can push this set out of its lowest free-energy state. However, it was very intriguing how DNA topoisomerases, that can only sense local information, may get hints whether performing a DNA–DNA passage in a given place will rather unknot the DNA than lead to DNA knotting.

Several complex mechanisms were proposed over the years to explain how DNA topoisomerases could get these hints: the active sliding model ( 30), the kinetic proofreading ( 52) or the three-site interaction ( 53). While some of these models were incompatible with the known properties of type II topoisomerases (active sliding model), the other models seemed to be unnecessarily complex (kinetic proofreading, three site interaction). In 2002 Vologodskii et al. ( 51) proposed a model according to which type II DNA topoisomerases were actively bending the DNA in the so called G region (G stands for the gate as that DNA region will be later cut and will serve as a gate for the passage of transferred segment known as T segment). According to that model, the DNA topoisomerase was placing itself in the bend in such a way that the T segment could only be transferred if it approached the G region from the inside of the bend. As a consequence, the topoisomerase was providing directionality for the passage of the T segment from the inside to the outside of the strongly bent DNA loop with the G site in its centre. Simulations performed to test this model revealed that this relatively simple mechanism permits a 10-fold reduction of the knotting level below the topological equilibrium ( 51). However, biochemical experiments using Topo IV from E coli showed ∼50-fold reduction of the knotting level below the topological equilibrium and therefore the mechanism proposed by Vologodskii et al. was not sufficient to explain the observed effect.

In 2004, a theoretical paper by Buck and Zechiedrich proposed that type II topoisomerases can keep a very low steady-state level of DNA knotting and of DNA catenation by preferentially acting on inter-hooked juxtapositions and performing passages there ( 48, 54). The idea behind that model was that, in freely fluctuating, torsionally relaxed DNA, the interhooked juxtapositions form preferentially in the region where DNA is knotted or catenated ( 48, 54). For entropic reasons the knotted domains in freely fluctuating knotted polymers tend to be rather tight ( 55, 56) and this favours that hooked juxtapositions form there. Indeed, simulation studies using polygons confined to a cubic lattice confirmed that preferential action on hooked juxtapositions can decrease the level of knotting by ∼50 times as compared to random passages ( 57). Also, simulations performed using polygonal chains off-lattice revealed that selection of interhooked juxtapositions can result in a reduction of the knotting level as strong as that observed experimentally ( 58).

The hooked juxtapositions proposed by Buck and Zechiedrich ( 48) and tested in simulations by Liu et al. ( 57, 59) were not assumed to wind in a right- or left-handed way but were modelled as achiral, interhooked juxtapositions where the planes of hooking were perpendicular to each other. Such achiral hooked juxtapositions were sufficient to explain the experiment by Rybenkov et al. ( 30) where the tested DNA was not supercoiled. However, even for unsupercoiled DNA there were other experiments requiring a chirality criteria to explain the observed results. Mann et al. ( 60) reported that human topoisomerase IIα has the very interesting ability to unknot left-handed five crossing twist knots (with the topological notation 52L) in just one passage. These results were puzzling since, even if DNA topoisomerases could specifically recognize hooked juxtapositions resulting from tight knotting of 52 knot, there are possibilities of forming five such juxtapositions and only passages occurring at two of them could lead to a direct conversion of the 52 knot into an unknot ( 61). The question arose then what structural difference could exist between DNA–DNA juxtapositions at these two different types of crossings in freely fluctuating DNA forming 52L knots?

Burnier et al. ( 58) used numerical simulations to test whether, by recognizing and performing passages within inter-hooked juxtapositions in which opposing segments wind around each other in a left-handed way ( Figure 3), the topoisomerases could unknot 52L knots by performing just one passage. The simulations showed that this criteria was indeed very efficient in favouring unknotting of the 52L knot by a single topo II-mediated passage ( 58). In addition, the preferential action on inter-hooked juxtapositions with left-handed character explains also the mechanism by which human topoisomerase IIα relaxes positively supercoiled DNA molecules at least 10 times faster than negatively supercoiled ones ( 62).

Additional support for the hooking model was provided recently by crystallographic analysis of Topo IV DNA complexes ( 63). In these complexes, the DNA to which the topoisomerase is bound (G segment) is strongly bent in the direction consistent with the models proposing that Topo IV induces DNA bends ( 51, 64) or that it preferably binds hooked juxtapositions ( 48, 54). The observation mentioned earlier that plasmids isolated from bacterial strains with defective gyrase are frequently knotted ( 38) is consistent with the interpretation that DNA supercoiling may help Topo IV to distinguish better DNA juxtapositions that are due to knotting from other DNA juxtapositions.

As mentioned earlier, bacterial topoisomerases evolved in such a way that negatively supercoiled DNA molecules are protected against their relaxing activity. In the case of Topo IV, this protection is ensured by the chirality sensing mechanism explained above ( 44– 46): right-handed juxtaposition present in negatively supercoiled DNA are practically immune to its action, whereas left-handed juxtapositions that are predominant in positively supercoiled DNA are very efficiently recognized by Topo IV and are substrate of processive passage reactions ( 44– 46, 65). Presumably, when knots are present in negatively supercoiled DNA molecules they promote formation of DNA–DNA juxtapositions with geometries that are somewhat different than the typical geometry of DNA–DNA juxtapositions in negatively supercoiled DNA. This is certainly the case of DNA molecules forming left-handed trefoil knots whose crossings have a natural tendency to form left-handed dsDNA–dsDNA juxtapositions. However, also DNA molecules forming right-handed trefoil knots, despite their preference to form right-handed dsDNA–dsDNA crossings, may in fact promote formation of juxtapositions that are more hooked or have somewhat different inclination angle than these normally present in negatively supercoiled DNA. In such a case also these knots may be efficiently unknotted by Topo IV action while regular DNA–DNA juxtapositions due to negative supercoiling would not serve as substrates of Topo IV.


Computer model unravels knotty problems in DNA

If you've ever tried to untangle a pair of earbuds, you'll understand how loops and cords can get twisted up. DNA can get tangled in the same way, and in some cases, has to be cut and reconnected to resolve the knots. Now a team of mathematicians, biologists and computer scientists has unraveled how E coli bacteria can unlink tangled DNA by a local reconnection process. The math behind the research, recently published in Scientific Reports, could have implications far beyond biology.

E. coli bacteria can cause intestinal disease, but they are also laboratory workhorses. E coli's genome is a single circle of double-stranded DNA. Before an E coli cell divides, that circle is copied. Opening up the double helix to copy it throws twisting strains elsewhere down the molecule -- just as uncoiling a cord in one place will make it over-coil somewhere else. The process results in two twisted loops of DNA that pass through each other like a "magic rings" trick.

To separate the rings, E coli uses an enzyme called topoisomerase IV, which precisely cuts a DNA segment, allows the loops to pass through the break and then reseals the break. Because topoisomerase IV is so important to bacteria, it's a tempting target for antibiotics such as ciprofloxacin. But when topoisomerase IV is absent, another enzyme complex can step in to carry out this unlinking, although less efficiently. This complex introduces two breaks and unlinks by reconnecting the four loose ends.

"There are other ways to unlink the rings, but how do they do it?" said Mariel Vazquez, professor of mathematics and of microbiology and molecular genetics at the University of California, Davis.

One pathway, Vazquez said, is that the reconnection enzymes remove one link at a time until they get to zero. That solution was favored by the biologists.

But mathematicians look at the problem slightly differently. They understand the DNA as a flexible curve in three-dimensional space. Certain points on the curve can be broken and reconnected. To a mathematician, there are many potential routes for reconnection processes to work -- including some where the number of links actually goes up before going back down.

"These are all the same to a mathematician, but not to a biologist," Vazquez said. To determine the most likely route and resolve the problem, they turned to computational modeling.

Vazquez and colleagues developed computer software with DNA represented as flexible chains to model the possible locations where reconnection enzymes could cut and reconnect the chains. Overall, they modeled millions of configurations representing 881 different topologies, or mathematical shapes, and identified hundreds of minimal pathways to get two DNA circles linked in up to nine places down to two separate circles.

The computer model confirmed the biologists' hunch: Undoing one link at a time is the preferred route to separate the circles of DNA.

The results could have implications far beyond DNA biology, Vazquez said. There are other examples in nature of objects that collide, break and reconnect -- like the dynamics of linked fluid vortices, or the patterns formed by smoke rings, for example. When solar flares are ejected from the sun, powerful magnetic field lines cross and reconnect.

"The math is not DNA specific, and the computation can be adapted," Vazquez said.


Sažetak

Various site-specific recombination enzymes produce different types of knots or catenanes while acting on circular DNA in vitro i in vivo. By analysing the types of knots or links produced, it is possible to reconstruct the order of events during the reaction and to deduce the molecular “architecture” of the complexes that different enzymes form with DNA. Until recently it was necessary to use laborious electron microscopy methods to identify the types of knots or catenanes that migrate in different bands on the agarose gels used to analyse the products of the reaction. We reported recently that electrophoretic migration of different knots and catenanes formed on the same size DNA molecules is simply related to the average crossing number of the ideal representations of the corresponding knots and catenanes. Here we explain this relation by demonstrating that the expected sedimentation coefficient of randomly fluctuating knotted or catenated DNA molecules in solution shows approximately linear correlation with the average crossing number of ideal configurations of the corresponding knots or catenanes.


Gledaj video: DETEKTOR LAŽI - U sledećem odgovaramo NA VAŠA PITANJA! (Svibanj 2022).