Informacija

Daljine enzima DAM kreću se duž genoma

Daljine enzima DAM kreću se duž genoma



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Spajam protein s enzimom Dam (http://en.wikipedia.org/wiki/Dam_(metilaza)). Ideja je da će, kada se protein veže za DNK, enzim Dam početi metilirati obližnja GATC mjesta, pomažući tako u identifikaciji područja vezanja za proteine ​​(kasnije pomoću DpnI i tehnologije mikročipljenja). Međutim, teoretski nemam pojma koliko će enzima (bps) preći genom od početnog mjesta. Tj. Koliko će enzim (u smislu bp) od svog početnog mjesta metilirati GATC mjesta.

Postoje metode za pronalaženje regija za vezanje proteina duž genoma koje koriste takvu tehnologiju, primjer ovdje: http://www.nature.com/nbt/journal/v18/n4/abs/nbt0400_424.html


Dam metiltransferaza metilira velike molekule DNA na postupan način, s učinkovitim rasponom do 7 kb s obje strane početne reakcije metilacije.

Moj odgovor je preuzet iz ovog rada:

Urig, S. et al. (2002.) The Escherichia coli DNK brane metiltransferaza Modificira DNA u visoko procesnoj reakciji J Mol Biol 319 1085-1096

Autori izvještavaju o kinetičkoj analizi E coli brana metilaza. Za svakoga tko koristi ovaj sustav kako je opisano u OP -u, ovaj je članak važno čitanje. Njihov je zaključak da je proces metilacije visoko procesan, što znači da jedna interakcija brane i DNA dovodi do višestrukih metilacija prije nego što enzim disocira iz DNA.

Ograničit ću se na opis samo dva njihova eksperimenta:

Slika 5 U ovom eksperimentu analizirali su vremenski tijek metilacije 879-mera označenog na kraju s 4 GATC mjesta, koristeći DpnI digestiju za detekciju metilacije. U ovom eksperimentu je otkriveno da je sva DNA potpuno metilirana ili nemetilirana - nisu otkriveni dokazi o prisutnosti djelomično metiliranih molekula DNA.

Slika 6 U ovom su pokusu analizirali metilaciju λ DNA (48,5 kb) i uspjeli su otkriti djelomično metilirane molekule. Kinetička analiza podataka rezultira sljedećim zaključcima (MTaza; metiltransferaza):

Iz ovih simulacija [određujemo] procesnost od nav= 3000. To znači da nakon vezanja za λ-DNA i pokretanja jednodimenzionalnog procesa difuzije jedna MTaza u prosjeku susreće 3000 branskih mjesta prije nego što se disociira od DNA. Budući da enzim izvodi nasumični hod, pogodiće mnoga mjesta češće nego samo jednom, a učinkoviti raspon procesnosti odgovara kvadratnom korijenu od nav. Stoga brana MTaza može metilirati približno 55 GATC mjesta na λ-DNA u procesnoj reakciji in vitro. U ovoj simulaciji potrebno je 4,6 asocijacija molekule MTase na istu molekulu λ-DNA kako bi se dobila potpuno metilirana DNA.

U slučajnom slijedu DNA GATC bi se trebao javljati u prosjeku svaka 44 = 256 ostataka. To sugerira približan raspon od (55/2)*256 = 7 kb sa svake strane početne reakcije metilacije.


Nakon što sam ponovno pročitao vaše pitanje, sumnjam da miješate metilaciju DNA i ograničavate probavu. Za detaljniji pregled međusobnog odnosa ova dva, pročitajte stranicu sažetka na web stranici New England Biolab.

Kristalne strukture uobičajenih restrikcijskih enzima ne sugeriraju da skeniraju duž dvolančane DNK tražeći mjesto prepoznavanja. Njihova kinetika reakcije može se smatrati nasumičnijom interakcijom, pri čemu enzim dolazi u kontakt s mjestom za prepoznavanje, zatim cijepa DNA i slobodno pluta do sljedeće reakcije.

Metilacija DNA dolazi u tri uobičajena okusa: Dam (metilacija DNA adenina), Dcm (metilacija DNA citozina) i metilacija CpG. Dodavanje bilo koje od ovih promjena metilnih skupina može ometati enzimsko prepoznavanje mjesta. Mnogi enzimi su djelomično ili potpuno blokirani barem jednom vrstom metilacije, dok su drugi potpuno inhibirani. To je zbog oblika enzima i DNK.

Ovdje mislim da povezujete ovo dvoje. REbase (baza podataka o restrikcijskim enzimima) doista je mjerodavan popis restrikcijskih enzima. Spominjete smanjenje brana u GATC -u. Slijed GATC je kanonski adenin metilacija (Brana) nalazište. Kao što ste istaknuli, nijedan poznati restrikcijski enzim ne sadrži Dam. Ako umjesto toga potražimo mjesto prepoznavanja, GATC će se podudarati s DpnI, restrikcijskim enzimom koji je proizveo tupe krajeve. Mislim da govorite o DpnI koji preferirano cijepa Dam metiliranu DNK (stoga se mjesto prepoznavanja GATC također podudara s Dam mytiltransferazama). Ako odsutnost metilirane DNA (ili ako je ne-metilirana DNA prisutnija), DpnI će se također probaviti na mjestima GATC-a.


Genomski alati za otkrivanje kromosomske arhitekture

Prostorna organizacija kromosoma unutar jezgre stanice još uvijek je slabo razumljiva. Ova se organizacija vodi unutar- i međukromosomskim kontaktima te interakcijama specifičnih kromosomskih lokusa s relativno fiksnim nuklearnim „orijentirima“, poput nuklearne ovojnice i jezgre. Istraživači su počeli koristiti nove tehnike mapiranja molekularnog genoma kako bi otkrili obje vrste molekularnih interakcija, pružajući uvid u temeljna načela međufaznog savijanja kromosoma.


Sažetak

Da bi se spasili morski ekosustavi od prekomjerne eksploatacije ribarstva, mora se naglasiti održiva i učinkovita akvakultura. Znanje dobiveno iz raspoloživog genomskog slijeda morskih organizama u mnogim je slučajevima ubrzalo morsku akvakulturu. Crni tigrasti škamp (Penaj monodon) jedan je od najistaknutijih uzgojenih penaeidnih račića (rakovi) s prosječnom godišnjom globalnom proizvodnjom od pola milijuna tona u posljednjem desetljeću. Međutim, njegovim trenutno dostupnim skupinama genoma nedostaje susjednost i potpunost potrebna za precizno označavanje genoma zbog visoko ponavljajuće prirode genoma i tehničkih poteškoća u ekstrakciji visokokvalitetne DNA velike molekularne težine. Ovdje izvješćujemo o prvom sklopu cijelog genoma na razini kromosoma P. monodon. Kombinacija dugo čitanih Pacific Biosciences (PacBio) i dalekosežnih Chicago i Hi-C tehnologija omogućila je uspješno sastavljanje ove prve visokokvalitetne sekvence genoma. Konačni sklop obuhvaćao je 2,39 Gb (92,3% procijenjene veličine genoma) i sadržavao je 44 pseudomolekule, što odgovara broju haploidnih kromosoma. Ponavljajući elementi zauzimali su značajan dio sklopa (62,5%), što je najveći broj zabilježen među vrstama rakova. Dostupnost ovog visokokvalitetnog sklopa genoma omogućila je identifikaciju gena povezanih s brzim rastom u crnim tigrastim kozicama kroz usporedbu transkriptoma hepatopancreas polako rastućih i brzorastućih škampa. Rezultati su istaknuli nekoliko gena povezanih s rastom. Naš visokokvalitetni sklop genoma pruža neprocjenjiv resurs za genetsko poboljšanje i uzgoj penaidnih kozica u akvakulturi. Dostupnost P. monodon genom omogućuje analize ekološkog utjecaja, prilagodbe i evolucije okoliša, kao i uloge genoma u zaštiti ekoloških resursa promicanjem održivog uzgoja škampa.


MATERIJALI I METODE

Baze podataka

BENZ je trenutno ažuriran UniProt/SwissProt izdanjem 2021_01. Prethodna verzija BENZ-a, temeljena na UniProt/SwissProt izdanju 2019_11, korištena je za generiranje sustava za provjere slične CAFA-i. Veze na baze podataka Pfam (11) i KEGG (17) izvedene su iz UniProt izdanja. Ne uzimaju se u obzir fragmenti i sekvence kraći od 50 ostataka. Oznake aktivnih, metalnih, ligand-vezujućih mjesta (ako su dostupne) također su izvedene iz UniProta i mapirane u Pfam arhitekturu enzimskih proteina.

Izrada grafikona, grupiranje i stvaranje HMM -a u klasterima

Postupak se izdvaja iz prethodno implementiranog tijeka rada koji smo usvojili za generiranje i ažuriranje našeg BAR 3.0 (Bolonjski izvor napomena, https://bar.biocomp.unibo.it/bar3/), proteinskog funkcionalnog i strukturnog izvora bilješki (18 ). Ukratko, sve UniProt sekvence određenog izdanja (u ovom slučaju UniProtKB 2019_01) uspoređuju se s BLAST -om (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), a zatim se grupiraju ograničavanjem identiteta sekvence (SI) i pokrivenost poravnanja (COV, omjer između broja preklapajućih položaja i duljine poravnanja). Graf se gradi povezivanjem parova sekvenci koji ispunjavaju i ograničenja identiteta i pokrivenosti. Ovdje usvajamo (SI) ≥50% na pokrivenost poravnanja (COV) ≥90%. Grupe se dobivaju izoliranjem povezanih komponenti grafa. Za ažuriranje koristimo UniRef90 klastere (https://www.uniprot.org/help/uniref) koji su mapirani u BAR klastere, slijedeći postupak opisan prije (18). To omogućuje uključivanje preostalih TrEMBL sekvenci, a algoritam AlignBucket (20) ubrzava postupak poravnavanja, iskorištavajući ograničenje na COVID. Svaki niz u klasteru zadržava bilješke prisutne u UniProt datoteci (PDB s najvećom pokrivenošću i razlučivošću ako je dostupna, Pfam/s, KEGG veze i četiri razine EC kodova, ako su prisutni). Naš sustav dopušta ažuriranje (18), dodavanjem novih nizova i sukladnim preoblikovanjem klastera, uključivanjem novih napomena iz UniProta.

Iz ove pozadinske arhitekture zadržavamo samo klastere koji sadrže sekvence povezane s četiri razine EC kodova, osobito klastere koji sadrže SwissProt ručno kurirane sekvence i TrEMBL sekvence s pridruženom PDB datotekom. Za svaki klaster smo zatim obučili HMM klastera s HMMER -om 3.3.2 (http://hmmer.org/, (20)) za poravnavanje višestrukih nizova specifično za klaster, izračunato s Clustal Omega (21). Sadašnja verzija BENZ WS -a, iz tehničkih razloga uključuje HMM -ove klastera s prosječnim duljinama u rasponu od 50 do 5000 ostataka, a to postavlja granicu upita na oko 5000 ostataka.

Odabir referentnog slijeda i shema bojenja HMM klastera

Za svaki HMM klastera odabiremo najbolji niz s bilješkama referentni slijed za klaster HMM-EC broj/e asocijacije sa sljedećim ograničenjima: za SwissProt sekvence, lance s najvećom ocjenom napomena za TrEMBL sekvence, samo one s četverorazrednim EC brojem i PDB asocijacijom. Svaki referentni slijed tada je pridružen svojoj specifičnoj Pfam arhitekturi, a na kraju se relevantna mjesta (uključujući aktivna, ligandna i metalna vezna mjesta) mapiraju u odgovarajuće Pfam/s. HMM klastera tada se grupiraju u dvije kategorije. ZLATNI HMM klasteri jednoznačno su povezani s jednim referentnim nizom, a PLAVI HMM klasteri povezani s više od jednog referentnog niza.

Implementacija BENZ -a

BENZ uključuje klasterske HMM -ove i modele Pfam (verzija Pfam 33.1). Kad ciljni niz uđe na poslužitelj, filtriraju ga dva različita skupa modela. Kad se zadrže unutar HMM -ova klastera (prag za uključivanje je E-vrijednost ≤ 10 −5), niz pronalazi referentni predložak unutar Pfam modela, kada se zadrži (prag za uključivanje je E-vrijednost≤10 −4), dobiva arhitekturu. Uključene E-vrijednosti odabrane su nakon testa samokonzistentnosti (predviđanje cijelog skupa referentnih sekvenci).

Ta se arhitektura zatim uspoređuje s referentnom, a cilj ima četverorazinski referentni EC broj samo ako je njegova arhitektura barem jednaka arhitekturi predloška. Ako nije, četverorazinski EC broj pripisuje se na temelju zajedničkog Pfam-a, koji sadrži relevantna mjesta (aktivno, vezivanje metala, mjesto vezivanja liganda). Opća shema BENZ sustava označavanja prikazana je na slici 1. Kada je HMM klaster za zadržavanje plurivokalno povezan s više od jedne referentne sekvence, generira se dendrogram nakon višestrukog poravnavanja s Clustal Omega (21), uključujući niz upita, koji je povezan s EZ kodovima najsličnijih među referencama.

Tijek rada BENZ WS -a. Za niz upita, u FASTA formatu, postupak označavanja započinje HMM filtriranjem. Ako je zadržavajući HMM plurivokalno povezan s različitim referentnim nizovima (plava zvjezdica), generira se dendrogram kako bi se među referentnim nizovima pronašao najsličniji cilj. Inače (žuta zvijezda), cilj je povezan s jedinom referencom. Nakon što se ocijeni je li referentna proteinska arhitektura (Ref Seq Arch) sadržana (⊆) u arhitekturi predviđene ciljne Pfam arhitekture (Query Pred Arch), usredotočuje se na Pfams koji nose relevantna mjesta, uspostavlja se pridruživanje slijeda EC broja upita. Pfamovi u našem sustavu označeni su kad god je to moguće, s položajima aktivnog mjesta, mjesta vezanja liganda i mjesta vezanja metala (relevantna mjesta). Preglednik značajki slijeda omogućuje korisniku da provjeri zadržava li upitna sekvenca ostatke relevantne za katalizu proteina radi potvrđivanja prijenosa bilješke iz referentnog niza. Linkovi na datoteku UniProt/SwissProt referentnog niza, PDB datoteku strukture i unose Pfam, zajedno s KEGG identifikatorima i putovima također su prisutni u ispisu (vidi HELP, https://benzdb.biocomp.unibo.it/help).

Tijek rada BENZ WS -a. Za niz upita, u FASTA formatu, postupak označavanja započinje HMM filtriranjem. Ako je zadržavajući HMM plurivokalno povezan s različitim referentnim nizovima (plava zvjezdica), generira se dendrogram kako bi se među referentnim nizovima pronašao najsličniji cilj. Inače (žuta zvijezda), cilj je povezan s jedinom referencom. Nakon što se ocijeni je li referentna proteinska arhitektura (Ref Seq Arch) sadržana (⊆) u arhitekturi predviđene ciljne Pfam arhitekture (Query Pred Arch), usredotočuje se na Pfams koji nose relevantna mjesta, uspostavlja se pridruživanje slijeda EC broja upita. Pfamovi u našem sustavu bilježeni su kad je to moguće, s položajima aktivnog mjesta, mjesta vezanja liganda i mjesta vezanja metala (relevantna mjesta). Preglednik značajki slijeda omogućuje korisniku da provjeri zadržava li upitna sekvenca ostatke relevantne za katalizu proteina radi potvrđivanja prijenosa bilješke iz referentnog niza. Linkovi na datoteku UniProt/SwissProt referentnog niza, PDB datoteku strukture i unose Pfam, zajedno s KEGG identifikatorima i putovima također su prisutni u ispisu (vidi HELP, https://benzdb.biocomp.unibo.it/help).

Web poslužitelj

Sučelje BENZ web poslužitelja optimizirano je za rad s uobičajenim web preglednicima, uključujući Chrome 88.0, Firefox 83.0, Edge 88.0 i Safari 14.0. Nakon predaje, poslovi se asinkrono obrađuju prihvaćajući internu uslugu čekanja u redu temeljenu na Sun Grid Engineu. Predane sekvence poravnavaju se s HMM -ovima klastera i knjižnicama Pfam s HMMer 3.3.2 (20). Korisniku je omogućena veza na statičku web stranicu koja će prikazati rezultate po završetku posla. Stranica se ažurira svakih 30 s. Rezultati se rutinski vraćaju u roku od 1 minute od slanja. Za sekvence duže od 3000 ostataka mogu biti potrebna dulja vremena.

Kada su kriteriji opisani na slici 1 ispunjeni, stranica s rezultatima vraća EC napomenu izvedenu iz najbolje usklađenog referentnog niza. Odjeljak "Najbolje podudaranje" također izvještava o PDB strukturi reference (ako je dostupna), Pfam arhitekturi upita i referentnih sekvenci te vrsti asocijacije HMM reference, bilo jednoznačnoj (ZLATNA zvjezdica) ili plurivokalnoj (PLAVA zvjezdica). Više pojedinosti nalazi se u odjeljku "Podaci", uključujući popis HMM -ova klastera s bodovanjem E-vrijednost ≤10 −5, povezane referentne sekvence i veze na IntEnz (https://www.ebi.ac.uk/intenz/), UniProt, PDB, Pfam i KEGG. Tablični podaci predstavljeni su podatkovnim tablicama (https://datatables.net/), što omogućuje sortiranje redaka u odnosu na bilo koji ključ stupca i pretraživanje tekstualnih pojavljivanja u tablici. Veze se rješavaju uslugom Identifiers.org (22) radi poboljšanja interoperabilnosti.

Za plurivokalne grozdove, dendrogram u Newick formatu, koji predstavlja udaljenosti između upita i referentnih sekvenci, izračunava se pomoću Clustal Omega (21) i vizualizira se pomoću Bio.Phylo modula Biopythona (23). Pfam domene mapirane na nizu upita navedene su u tablici ‘Arhitektura predviđene cilja’ i grafički prikazane sa zapisima prikazanim pomoću knjižnice Pviz.js (24). Grafički prikaz također omogućuje ispitivanje očuvanja aktivnih, veznih metala i ligand-vezujućih mjesta između upita i referentnih sekvenci. Web poslužitelju je slobodno dostupan bez registracije na https://benzdb.biocomp.unibo.it.


Otkriće "skakanja" bakterijskog enzima daje uvid u ekspresiju gena

Otkriće istraživača UC Santa Barbare o varijaciji sposobnosti enzima da "skače" dok se kreće po DNK, mijenjajući genetski materijal bakterije - te njenu fizičku sposobnost i ponašanje - mnogo obećava za biomedicinske i druge znanstvene primjene.

The E coli adaptivni mehanizam bakterije omogućuje joj da promijeni svoj fenotip - svoje uočljive karakteristike - ovisno o okolišu. Na primjer, ako osjeti potrebu za pronalaskom hrane, zalijepljenjem za tkiva svog organizma domaćina ili za reprodukciju, bakterija će na svojoj površini stvoriti piliće ili strukture nalik na kosu kako bi joj se omogućilo kretanje, lijepljenje ili prolazak genetski materijal.

"Pokušavamo otkriti što je to u ćeliji što potiče te promjene", rekao je Adam Pollak, prvi autor rada.

Formiranje ovih pili potiče epigenetski mehanizam-"označavanje" koje vrši enzim DNA adenin metiltransferaza (Dam), koji djeluje na specifičan slijed DNA, nazvan GATC mjesta (Guanin-Adenin-Timin-Citozin). Označavanje signalizira stvaranje ovih - privjesaka mehanizam sličan onom kod ljudi, gdje označavanje usmjerava stvaranje tkiva za različite organe iz iste DNA. Ovo označavanje dio je šireg područja, zvanog epigenetika, gdje su izmjene u genomu nasljedne i reguliraju ekspresiju gena.

Tamo gdje je prevladavalo uvjerenje da je enzim Dam skliznuo samo s jedne strane dvostruko spiralne DNA bakterije tražeći ta GATC mjesta, prema istraživačima, Dam može zapravo "skočiti" na jedno ili više takvih mjesta s obje strane dvostruka spirala.

"Kreće se dalje, pronalazi mjesto i to metilira, ali se okreće, preorijentira i metilira drugu stranu", rekao je Norbert Reich, profesor kemije i biokemije na UCSB -u.

Koristeći nekoliko niti genetski modificirane DNK različitih duljina i različitih udaljenosti između mjesta metilacije, istraživači su otkrili da se skakanje brane može događati češće, ovisno o grupiranju mjesta, npr. Veća je vjerojatnost da će se dogoditi kada su dva mjesta unutar 10 do 200 parova baza jedan od drugog. Grupirana GATC mjesta snažno su povezana s regulacijom gena, dok je izolirano GATC mjesto na dvostrukoj spirali povezano s kopiranjem DNK. Prema nalazima autora, što duže enzim prolazi bez lociranja GATC sekvence molekula, manja je vjerojatnost da će doživjeti ovu novu varijaciju skakanja, ali će uvođenje GATC sekvence ponovno stimulirati mehanizam.

Prema članku, skakanje može objasniti učinkovitost pomoću koje enzimi koji modificiraju DNK mogu pronaći svoja mjesta prepoznavanja, unatoč prisutnosti velike količine nespecifične DNK, kao i kako enzimi mogu izmijeniti više od jednog mjesta, unatoč suprotnim usmjerenjima niti .

Istraživanje kapitalizira desetljeća promatranja E coliponašanje i čimbenici koji pridonose njezinoj virulenciji ili sposobnosti da ustraje i umnožava se. Proučavanje mehanizama koji uključuju i isključuju te sposobnosti pridonijelo bi načinu na koji se ljudi mogu nositi s tim bakterijama, koje postoje u toplokrvnih stvorenja, ali u određenim slučajevima mogu uzrokovati bolesti.

"Da imamo inhibitore koji bi mogli spriječiti prebacivanje, na primjer ne bismo imali infekcije mokraćnog sustava", rekao je Pollak.

Ista istraživačka skupina nedavno je izvijestila o sličnom mehanizmu kod ljudi, koji je poremećen u određenim oblicima leukemije.


Novi pristup identificiranju interakcija RNA-kromatin specifičnih za stanični tip

Duge nekodirajuće RNK (lncRNA) su transkripti dulji od 200 bp koji mogu imati ulogu u regulaciji transkripcije. Mnogi stupaju u interakciju s faktorima transkripcije i faktorima remodeliranja kromatina kako bi utjecali na ekspresiju gena na specifičnim genomskim lokusima (Marchese i sur., 2017.). lncRNA su izražene u prostorno i vremenski ograničenim obrascima in vivo. Povlačenje RNA iz umreženog kromatina omogućuje identifikaciju mjesta vezanja lncRNA u staničnoj kulturi, ali zbog potrebe za desecima milijuna stanica njihova primjena in vivo bio ograničen (Chu i sur., 2015). RNA-DamID je novi pristup za identifikaciju genomske popunjenosti lncRNA in vivo na način specifičan za ćelijski tip (Cheetham i Brand, 2018). RNA-DamID uključuje genetsko označavanje lncRNA od interesa s MS2, stabilnom ukosnicom koja je izvedena iz MS2 bakteriofaga. Brana se zatim spaja s MS2 proteinskim premazom (MCP), koji se s nanomolarnom učinkovitošću veže na MS2 RNA oznaku. Označena lncRNA i fuzija Dam-MCP mogu se izraziti u staničnom tipu od interesa, u kojem se Dam-MCP regrutira na mjesta interakcije lncRNA-kromatina i metilira obližnje GATC motive, čime se identificiraju mjesta vezana za lncRNA vezana za stanični tip in vivo (Slika 2D). RNA-DamID daleko je osjetljiviji od alternativnih pristupa koji se temelje na spuštanju za mapiranje interakcija lncRNA-kromatina, poput ChART-a (Simon i sur., 2011.), RAP-a (Engreitz i sur., 2013.) i ChIRP-a (Chu i sur., 2011.) , a korišten je u samo 30 000 neuronskih matičnih stanica. Važno je da RNA-DamID također ima manje lažno pozitivnih rezultata od ChIRP-a. RNA-DamID može identificirati mjesta vezivanja ektopično eksprimiranih (roX2) i endogeno označeni (roX1) lncRNA, ali još nije primijenjena na druge lncRNA. Iako RNA-DamID zahtijeva transgenezu, kao i svi pristupi DamID-u, to je trenutno jedina metoda koja može razriješiti profile vezanja RNA iz ograničenih staničnih populacija in vivo. Stoga će RNA-DamID biti neprocjenjiv alat za identifikaciju mehanizama putem kojih lncRNA kontroliraju ekspresiju gena i strukturu kromatina.


Daljine enzima DAM kreću se duž genoma - Biologija

Nuklearna lamina (NL) stupa u interakciju sa stotinama velikih genomskih regija koje se nazivaju domene povezane s laminom (LAD). Dinamika ovih interakcija i odnos prema epigenetskim modifikacijama slabo su razumljivi. Vizualizirali smo sudbinu LAD -ova u pojedinačnim stanicama pomoću pristupa "molekularne kontaktne memorije". U svakoj jezgri samo je 30% LAD -a postavljeno na periferiji. Ti LAD -i su u povremenom molekularnom kontaktu s NL -om, ali ostaju ograničeni na periferiju. Nakon mitoze, LAD pozicioniranje nije nasljedno nasljedno, već se stohastički mijenja. Kontakt pojedinih LAD -ova s ​​NL povezan je s transkripcijskom represijom i dimetilacijom H3K9 u pojedinačnim stanicama. Nadalje, identificiramo H3K9 metiltransferazu G9a kao regulator NL kontakata. Zajedno, ovi rezultati ističu načela dinamičke prostorne arhitekture kromosoma u odnosu na regulaciju gena.

Grafički sažetak

Naglasci

► Nova metoda praćenja i manipulacije LAD-ovima u pojedinačnim stanicama ► LAD-ovi su ograničeni tijekom međufaze, ali se stohastički mijenjaju nakon mitoze ► Histonske modifikacije pojedinih LAD-a povezane su sa stohastičkim pozicioniranjem ► H3K9 metiltransferaza G9a promiče kontakte LAD-NL


4. Metode kvantifikacije ChIP -a i DamID -a

4.1. qPCR

ChIP ili DamID nakon kojeg slijedi qPCR održiva je opcija kada se zna ili ima dobra pretpostavka o tome gdje se protein veže. PCR u stvarnom vremenu koristi se za kvantificiranje relativne količine ChIP DNA u usporedbi s ulaznom DNA na testnom i kontrolnom lokusu. Odabir testne regije za qPCR ovisi o cilju. Na primjer, u slučaju transkripcijskog faktora koji veže DNA, mogu se izabrati početnice koje obuhvaćaju područje promotora s pretpostavljenim motivom DNK sekvence. ChIP podaci za cijeli genom dostupni su za brojne transkripcijske faktore (http://www.modencode.org/). Lokus negativne kontrole trebao bi biti na području bez očekivanog vezanja. Preporučujemo da obogaćenje ChIP -a izrazite kao postotak unosa. Neki istraživači koriste obogaćivanje nabora u usporedbi s IgG kontrolom ili lokusima negativne kontrole. U tom slučaju potrebno je paziti da se pozadinski signal ne razlikuje previše od pokusa do pokusa.

4.2. DNK mikroredovi

Za identifikaciju i kvantificiranje DNK fragmenata tehnologijom niza, uzorci iz fuzijskog soja Dam i kontrolnog soja “Dam only ” paralelno se obrađuju i fluorescentno obilježavaju različitim bojama, nakon čega slijedi ko-hibridizacija na nizovima visoke gustoće. Slično za ChIP-čip, ChIP i ulazna DNA se pojačavaju i obilježavaju s dva različita fluorescentna bojila (Cy3 i Cy5) i ko-hibridiziraju u mikro nizove koji obuhvaćaju cijeli genom (Buck i Lieb, 2004. Ercan i sur., 2007.). Kako bi se izbjegla potencijalna pristranost koju unose dvije boje, eksperiment zamjene boje treba provesti s barem jednim od bioloških ponavljanja. Analiza podataka o hibridizaciji, uključujući normalizaciju i zaglađivanje, može se provesti različitim algoritmima. Ukratko, omjer fluorescentnog signala ChIP -a na ulazu ili “Dam fuzije ” na “Dam samo ” je mjera obogaćivanja ChIP -a ili DamID -a po sondi, a zbog normalizacije, obogaćivanje na svakom lokusu je u odnosu na ostatak genom. Daljnja obrada podataka obično će ovisiti o klasi kromatinske povezanosti koja se istražuje. Nizovi za popločavanje cijelog genoma tvrtke Roche NimbleGen koji sadrže 2,1 milijuna sondi od 50 nt korišteni su u eksperimentima s ChIP-čipom i DamID-om, ali se više ne proizvode. Ekvivalentni nizovi drugih proizvođača nisu testirani u C. elegans DamID, ali su korišteni u DamID eksperimentima na drugim organizmima, kao i u C. elegans ChIP studije.

4.3. Visokopropusno sekvenciranje

DamID i ChIP DNA mogu se izravno sekvencirati visokopropusnim sekvenciranjem. ChIP-seq pruža višu razlučivost i veći dinamički raspon u odnosu na ChIP-čip, a trenutno je jeftiniji jer se sekvenciranje može multipleksirati, a komercijalni mikromreži se postupno ukidaju (Park, 2009. Landt i sur., 2012.). Multipleksiranje se vrši uključivanjem jedinstvenog identifikacijskog indeksa u svaku biblioteku za sekvenciranje i udruživanjem knjižnica za sekvenciranje, na primjer, u jednoj traci protočne ćelije Illumina & reg. Za ChIP-seq važniji je veći broj kratkih čitanja nego duga čitanja. Stoga je sekvenciranje s jednim krajem od 36-50 bp od strane Illumine popularna metoda izbora. Transkripcijski čimbenici s fokusiranim vezanjem i s manje veznih mjesta obično zahtijevaju manje čitanja, dok mete sa širokim uzorcima, poput modifikacija histona, zahtijevaju više čitanja. Prema našem iskustvu, 10-20 milijuna mapiranih očitavanja od 50 bp obično su dovoljni za veliki raspon ciljeva u C. elegans (Kranz i sur. 2013). Tipično 80-90% čitanja s ChIP karte u genom. Jedna traka Illumina HiSeq2500 obično pruža � milijuna mapiranih očitanja, pa se može multipleksirati 𕙠 uzoraka u traci. Rezultat obogaćivanja ChIP-seq izračunava se za svaki par baza u genomu kao obuhvat čitanja ChIP-a u usporedbi s ulazom, i stoga odražava relativno vezivanje u odnosu na cijeli genom. Za točno određivanje mjesta vezanja za proteine ​​vršnim pozivanjem, važno je sekvencirati odgovarajuću ulaznu DNA po mogućnosti pri istoj ili većoj pokrivenosti (Chen i sur., 2012).

Iako je većina objavljenih DamID eksperimenata koristila DNK mikro nizove, nedavna su istraživanja kartirala mjesta metilacije Dam s Illumina sekvenciranjem (Sha i sur., 2010. Luo i sur., 2011.). Ove dvije studije razlikuju se u nekoliko detalja, ali obje su uključivale enzimsko podrezivanje metiliranih fragmenata kako bi se dobile oznake sekvence DamID od 20-27 bp koje su identificirane masivnim sekvenciranjem. Približno 38% čitanja neobrađenog slijeda moglo bi se mapirati na jedinstvena GATC web mjesta u C. elegans genom (Sha et al., 2010), što znači da će za svaki uzorak biti prikladno 10-20 milijuna očitanja, što je slično situaciji u ChIP-seq.

4.4. Analiza podataka

Budući da će analiza podataka uvelike ovisiti o nekoliko parametara, poput vrste proteina koji se analizira (transkripcijski faktor, histon, protein jezgrene ovojnice itd.), Metodama za generiranje podataka (niz ili sekvenciranje) i opsegu dostupne bioinformatičke pomoći, ovdje nije realno dati detaljne protokole o ovom aspektu. Pogledajte objavljene studije ili nas kontaktirajte za daljnju raspravu.


ZAHVALNOST

Ovo je istraživanje financiralo Savjetodavna skupina za međunarodni program poljoprivrednih istraživanja o rižino-poljoprivrednim sustavima (CRP-RICE, 2017–2022). Ngan Thi Phan podržala je stipendija doktora znanosti iz Francuske ambasade u Vijetnamu. Guillaume Besnard član je laboratorija EDB-a podržanog projektima izvrsnosti Labex CEBA (ANR-10-LABX-25-01) i Labex TULIP (ANR-10-LABX-0041), kojima upravlja francuski ANR. Autori se žele zahvaliti Jamelu Aribiju (IRD-IPME, Francuska), Alainu Rouletu (Genopole, Toulouse, Francuska) i Michelu Lebrunu i Thi Hue Nguyenu ("Rice Functional Genomics and Plant Biology" International Joint Laboratory, Hanoi, Vijetnam) za njihovu tehničku podršku u nematologiji ili genomici. Također želimo zahvaliti Ndomassi Tando i IRD itrop platformi za bioinformatiku „Plantes Santé“ na pružanju HPC resursa i podršci našem istraživačkom projektu, te trojici anonimnih sudaca na njihovim konstruktivnim komentarima.


Zaključci

Naše istraživanje pokazuje opću interakciju između transpozicije i replikacije posredovanu kliznom stezaljkom β, koja se u različitim Phylaima različito otkriva kao posljedica različite dinamike replikacije kromosoma. U Firmicutesu bi međusobna igra transpoza s replikacijom mogla stvoriti pristranost u orijentaciji u mnogim obiteljima IS -a kao posljedicu asimetrije u distribuciji β na replikacijskoj vilici. Željeli bismo predložiti da bi IS-i mogli izvući dvostruku korist iz svoje β posredovane povezanosti s replikacijom: prvo, integracija s kromosomskom replikacijom domaćina, vjerojatno potrebna za njihovu proliferaciju unutar kromosoma, i drugo, univerzalna, visoko konzervirana, platforma za širenje među vrstama. Interakcija s β mogla bi stoga pružiti ključ sveprisutne prirode insercijskih elemenata u bakterijskim genomima, ističući izvanredan primjer ekstremne molekularne prilagodljivosti.


Gledaj video: АСМР опуштајућа масажа лица. 53,29 минута потпуног умирујућег опуштања. (Kolovoz 2022).