Informacija

Udvostručenje koncentracije izvanstaničnog kalcija hiperpolarizira neuron. Zašto?

Udvostručenje koncentracije izvanstaničnog kalcija hiperpolarizira neuron. Zašto?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Radio sam neke izračune omotnica kako bih pokušao odgovoriti na ovo pitanje matematički više. Pitanje u biti glasi: Zašto povećanje koncentracije izvanstaničnog kalija depolarizira neuron, dok povećanje koncentracije izvanstaničnog kalcija hiperpolarizira neuron?

Moja je početna misao bila da postoji promjena ravnotežnog potencijala za svaki ion. Razrađujući ovo međutim shvatio sam da sam pogriješio u svom zaključivanju; moja matematika pokazala mi je da nisam u pravu.

Udvostručenje koncentracije izvanstaničnog kalija čini ravnotežni potencijal kalija 17,8 mV pozitivnijim. Za kalcij povećava pogonsku silu za 8,9 mV (na temelju sobne temperature 300 K). To mi znači da će oboje uzrokovati da potencijal neurona u mirovanju postane nešto pozitivniji, iako manje kalcija.

To je doista očito: dodavanjem više pozitivnih iona izvan stanice povećava se pokretačka snaga tog iona, a pod pretpostavkom da postoji bilo kakva vodljivost (iako mala) tada će doći do neke depolarizacije neurona.

Zbog toga mislim da to nije pojava koju objašnjava neuron u mirovanju. Neki drugi mehanizam odgovoran je za povećanje izvanstaničnog kalcija koji uzrokuje hiperpolarizaciju neurona.

Moja moguća nagađanja:

  • Ako se koncentracija kalcija udvostruči, tada se povećava pokretačka snaga kalcija, pa dolazi do većeg priljeva kalcija pa će se povećati i unutarnja koncentracija kalcija. Budući da je koncentracija iona kalcija s unutarnje strane prije bila blizu nule, sada će ta unutarnja koncentracija porasti na značajan broj, pa će hiperpolarizirati neuron.

  • Unutarnja koncentracija kalcija blago raste, ali umjesto (ili možda zajedno s) izravnog smanjenja potencijala za odmor, dolazi do veće aktivacije kalijevi kanali aktivirani kalcijem, čime se povećava vodljivost kalijevih iona, a time i u konačnici hiperpolarizira neuron.

Jesam li na dobrom putu ili mi nešto nedostaje?


Ovaj i ovaj rad podržavaju drugu mogućnost za koju sam pretpostavio. To jest povećanje vanjske koncentracije kalcija dovodi do povećanja vodljivosti kalija.

Dok se može pokazati da povećanje vanjske koncentracije kalija depolarizira stanicu izračunavanjem Nernstovog potencijala za ion, kalcijev ion ima neintuitivan učinak. To znači da ako se poveća vanjska koncentracija kalcijevih iona, neizbježno će doći do malog povećanja unutarnje koncentracije kalcijevih iona s unutarnje strane. To će malo utjecati na to da su ioni kalija aktivirani kalcijem malo otvoreniji. Time se povećava vodljivost kalija. To će značiti da postoji neto hiperpolarizirajuća struja koja održava ćeliju manje uzbudljivom.


A & ampP Ch.10

Podrijetlo: Mikroglija se pojavljuje rano u embrionalnom razvoju i povezana je s onim matičnim stanicama koje proizvode makrofage i monocite
Mikroglija migrira u CNS kao nastanak živčanog sustava i tamo postaje izolirana

Mjesto: Formirajte unutarnju sluznicu središnjeg kanala u leđnoj moždini i šupljinama (ventrikule) mozga i pokrijte specijalizirane kapilare (žilne žlijezde) koje se nalaze u ventrikulama

Sadrže brojne membranske vrećice nazvane sinaptičke vezikule

Uključuje aktivni transport Na+ i K+
Crpka Na+/K+ održava veću koncentraciju Na+ izvan ćelije i veću koncentraciju K+ unutar ćelije

Citoplazma ovih živčanih stanica sadrži veliki broj negativno nabijenih iona (aniona), poput fosfata, sulfata i proteina

Ne mogu se širiti kroz stanične membrane

Naziva se potencijalnom razlikom jer predstavlja pohranjenu električnu energiju koja se može koristiti za obavljanje poslova

Potencijalna razlika kroz staničnu membranu naziva se membranski potencijal i mjeri se u milivoltima

Potencijalna razlika između 2 točke može se mjeriti pomoću dvije elektrode spojene na voltmetar

Imaju sposobnost reagiranja na podražaje poput promjene temperature, svjetlosti ili pritiska i pretvaranje stimulusa u neuronski impuls

Takve promjene ili podražaji obično utječu na potencijal mirovanja u određenom lokalnom području stanične membrane

Samo primjer: Promjena potencijala odmora od -70mV do - 62mV je depolarizacija

Samo primjer: Promjena potencijala odmora od -70mV do - 90mV je hiperpolarizacija

Razina na kojoj se proizvodi akcijski potencijal, što je osnova za živčani impuls
Dostizanje praga otvara određene zatvorene ionske kanale

Prostiranje akcijskih potencijala duž aksona je živčani impuls. Akcijski potencijali se šire duž duljine aksona kao živčani impulsi

Aksoni su sposobni za akcijske potencijale, ali stanično tijelo i dendriti NISU

Akcijski potencijal u zoni okidanja uzrokuje električnu struju koja stimulira susjedne dijelove membrane aksona pokrećući još jedan akcijski potencijal
Depolarizacija / Repolarizacija

Depolarizacija membrane

Potencijal za odmor postaje sve pozitivniji
-70mV do + 30 mV na vrhuncu akcijskog potencijala
Depolarizacija uzrokuje otvaranje susjednih Na+ kanala s naponom

2. Relativno vatrostalno razdoblje
Sljedeće razdoblje je kada membrana ponovno uspostavlja svoj potencijal mirovanja
U tom se razdoblju membrana može stimulirati samo podražajem visokog intenziteta

Povećanje koncentracije K+ u izvanstaničnoj tekućini:
*Smanjuje gradijent za K+ kako bi napustio potencijal praga stanice dosegnut podražajem manjeg intenziteta dovodi do uzbudljivih neurona, možda i grčeva

Smanjenje koncentracije K+ u izvanstaničnoj tekućini:
*Neuroni mogu postati hiperpolarizirani akcijski potencijali ne stvaraju se nedostatak impulsa dovodi do paralize mišića

Rezultat je unutrašnja difuzija kalcijevih iona (Ca+2) iz izvanstanične tekućine

Molekule neurotransmitera će se raspršiti po sinaptičkoj pukotini

Reakcija sa specifičnim receptorskim molekulama koje se nalaze u ili na membrani postsinaptičkog neurona

uzrokovati otvaranje ionskih kanala (kemijski zatvorenih kanala)

Što više Ca+2 uđe u sinaptički gumb, to je više uključenih sinaptičkih vezikula i više se oslobađa neurotransmitera

Tipično, učinci neurotransmitera traju samo nekoliko milisekundi prije nego što ih prekine jedan od sljedećih mehanizama: raspadanje, ponovno preuzimanje ili difuzija

2. Ponovno preuzimanje neurotransmitera
Neki neurotransmiteri uklanjaju se iz sinapse ponovnim preuzimanjem u presinpatički terminal, gdje ih enzimi pohranjuju ili uništavaju


Cerebralni vaskularni mišić

TRPV4

TRPV4 kanali olakšavaju dotok kalcija u vaskularne mišiće, ali iznenađujuće posreduju u vazodilataciji [3]. Aktivacija TRPV4 kanala izaziva oslobađanje kalcija inducirano kalcijem u obliku iskrica kalcija iz skladišta sarkoplazmatskog retikuluma, posredujući tako odgovore na 11,12-epoksieikosatrijensku kiselinu (11,12-EET). Iskrice kalcija aktiviraju BK kanale uzrokujući hiperpolarizaciju vaskularnog mišića i širenje.

Druga opisana uloga TRPV4 je modulacija vazokonstrikcije izazvane angiotenzinom II (Ang II). U izoliranom vaskularnom mišiću aktivacija receptora tipa angiotenzina ovisna o Ang II povećala je iskričavu aktivnost TRPV4. U netaknutim cerebralnim žilama, stezanje izazvano Ang II kompenzirano je aktivnošću TRPV4. Kao i u izoliranim stanicama, kalcijeve iskre ovisne o TRPV4 aktivirale su BK kanale za moduliranje Ang II-inducirane vazokonstrikcije.


Materijali i metode

Liječenje životinja i tkiva

Pokusi su provedeni na štakorima s kapuljačom Long Evans u skladu s nacionalnim zakonodavstvom i propisima ARVO -a. Životinje su uzgajane u laboratoriju. Intraokularne injekcije u novorođenčadi anestezirane eterom izvedene su kako je prethodno opisano (Galli-Resta i sur., 2002.). Intraokularne koncentracije određene su uz pretpostavku 10 μl vitrealnog volumena na P1, kako je prethodno procijenjeno (Galli-Resta i sur., 2002.). Bromodeoksiuridin (BrdU), koji se ugrađuje tijekom sinteze DNA (Gratzner, 1982.), injektiran je intraperitonealno (ip 50 mg/kg tjelesne težine) svakih 6 sati, počevši neposredno prije tretmana, kako bi se označile sve stanice koje ulaze u S-fazu nakon tretmana . S-faza u retini je 12-18 sati u ovoj fazi (Alexiades i Cepko, 1996.). Životinje su žrtvovane odrubljivanjem glave. Disekcija, fiksacija oka, retinalna ravna montaža ili presjek i imunocitokemija provedeni su kako je prethodno opisano (Galli-Resta i Ensini, 1996).

Kako bismo kontrolirali učinkovitost apiraze u smanjenju razine e-ATP in vivo, prikupili smo 5 μl uzoraka tekućine iz stražnje očne komore, smatrajući da bi promjene razine ATP-a u ovoj tekućini bile paralelne s onima u susjednoj mrežnici. Štakori P4 su anestezirani avertinom (10 ml/kg tjelesne težine, ip.3,3% tri-brom-etanola, 2% tercijarnog amil-alkohola u fiziološkoj otopini) 3 sata nakon intraokularne injekcije apiraze ili nosača. Vrh (30-50 μm) staklene mikropipete spojene na Hamiltonovu špricu od 25 μl s klipom s mikro pogonom umetnut je u stražnju očnu komoru. Uzorci su prikupljeni pod disekcijskim mikroskopom kako bi se provjerio nedostatak krvi ili zamućenje, te su ispitani na luminometru (Perkin Elmer) za mjerenje razine ATP-a pomoću testa luciferin-luciferaze. Životinje tretirane apirazom pokazale su 50 puta smanjenje razine e-ATP-a u odnosu na kontrole [2 ± 1 μM ubrizganog nosača (n= 5 životinja), ubrizgana 40 ± 50 nM apiraze (n= 5 životinja), P& lt0.05, Studentska t-test]. Važno je naglasiti da su te koncentracije niže od onih u retini, gdje endogeni e-ATP doseže lokalne koncentracije oko 0,1 mM (Newman, 2001). Međutim, budući da se ne raspršuje daleko (približno 50 μm) i brzo se razgrađuje (Newman, 2001), njegova konačna koncentracija jednom razrijeđena u vitreus humoru znatno je manja.

Označavanje gen-pištolja eksplantirane mrežnice

Snimanje živih neurona provedeno je u mrežnicama eksplantiranim od neonatalnih štakora. Dob je bila ravnomjerno raspoređena između P2 i P8. Retine su brzo secirane u svježe napravljenoj umjetnoj cerebrospinalnoj tekućini (Stacy i Wong, 2003.), spljoštene na 13 mm millipore nitrocelulozne filtere i stavljene u Petrijeve zdjelice koje sadrže umjetnu cerebrospinalnu tekućinu (ACSF) unutar oksigenirane i navlažene komore za inkubaciju na sobnoj temperaturi (25- 28 ° C). Pojedine stanice označene su fluorescentno konjugiranim dekstranom isporučenim pucanjem čestica volframa obloženih 1,3 μm u retinu pomoću pištolja Bio-Rad gena (Kettunen i sur., 2002.). Kolinergične stanice identificirane su po laminarnom položaju u retini, morfologiji zvjezdanog izljeva i planarnom dendritičkom rasporedu, koje su već prepoznatljive u ranom životu (Stacy i Wong, 2003. Wong i Collin, 1989.). Osim toga, proveli smo morfološko istraživanje kombinirajući transfekciju YFP-a za označavanje pojedinačnih kolinergičnih stanica i imunohistokemiju za kolin acetiltransferazu (ChAT) kako bismo pomogli u identifikaciji kolinergičnih stanica u mrežnicama štakora P2-P13 (neobjavljeni podaci). Obilježavanje genskog pištolja fluorescentnim dekstranom proizvodilo je u prosjeku tri do četiri kolinergička neurona označena svakih 10 mrežnica, u skladu s relativno niskom učestalošću tih neurona (Jeon i sur., 1998.).

Snimanje stanica u izoliranim mrežnicama

Retine su analizirane počevši 1-2 sata nakon označavanja. Slike stanica dobivene su fluorescentnim mikroskopom Zeiss Axioplan opremljenim crno -bijelom CCD kamerom (Chroma1600 DTA, Pisa, Italija). Retine su postavljene na pozornicu mikroskopa unutar male komore za promatranje koja sadrži 4 ml stalno oksigeniranih i često zamijenjenih ACFS -a održavanih na sobnoj temperaturi.

Mrežnice su brzo pregledane na označene kolinergičke stanice pomoću Olympusovog objektiva za uranjanje u vodu 40 × (NA 0,80), držeći svjetlo pobude na 10-20% svog maksimalnog intenziteta. Za svaku ćeliju snimljene su dvije slike, fokusirajući se na dendritičko stablo (3-sekundna ekspozicija), zatim na somu (0,5-sekundna ekspozicija). Nakon tretmana snimljene su slike dendrita i some prethodno snimljenih stanica. Referentne točke unutar komore za promatranje snimljene su radi identifikacije određenih ćelija u sljedećim opažanjima pomoću njihovih koordinata. Kako bi se ograničilo izlaganje svjetlu, tretirane i kontrolne stanice snimljene su samo prije i 30 minuta nakon tretmana, osim ako nije drugačije naznačeno. U nekim pokusima stanice su transficirane s YFP -om i dobiveni su slični rezultati kao i s dekstranom (nije prikazano).

Propustljivost membrane procijenjena je dodavanjem propidijevog jodida (PI 1,5 μM, 1 minuta) u ACSF. Izloženost fospatidilserina na listiću vanjske membrane procijenjena je pomoću Cy3-aneksina V (3 μg/ml, 20 minuta). Slike su dobivene s postavkom FITC (488 nm) filtera za Oregon-Green-488-dekstran, s postavkom filtra TRITC (568 nm) za PI, Cy-3-aneksin V i Alexa-Fluo-568-dekstran. Kvinakrin (1 μM) inkubiran je 10-20 minuta na sobnoj temperaturi i snimljen pomoću Leica TCNS konfokalnog mikroskopa, održavajući laser pri minimalnoj snazi ​​(5-10%). Budući da se kinakrin lako izbjeljuje, skenirane su najviše dvije stanice po retini, postavljajući dubinu skeniranja za svaku stanicu ispod TRITC filtera (s oznakom dekstrana), zatim skeniranjem pomoću FITC filtra (kinakrin) i na kraju s filtrom TRITC.

Prikupljanje i analiza podataka

Nizovi kolinergičkih stanica uzorkovani su pomoću Leica TCNS konfokalnog mikroskopa. Četiri 400 × 400 μm 2 uzorka bilo kojeg niza kolinergičkih stanica uzeta su u svaku mrežnicu cijelog nosača pri sredini ekscentričnosti duž četiri okomite osi. Gustoća kolinergičkih stanica ne varira s ekscentričnošću u tim godinama (Galli-Resta i sur., 2002.). Isto se pokazalo istinitim u namjenskoj analizi tretiranih slučajeva (osam uzoraka po retini uzetih pri dva različita ekscentriciteta duž četiri okomite osi, dvije retine po tretmanu nisu prikazane). Budući da je u svakom slučaju cilj bio postavljen na pola puta između papile i ruba retine bez prethodnog ispitivanja distribucije stanica, svako uzorkovanje je bilo nepristrano. Uzorkovana polja i retinalne slike ispitane su pomoću analizatora slike (Imaging Ontario, Kanada) kako bi se odredila gustoća stanica, pozicioniranje stanica i retinalno područje. Brojanje stanica i koordinate dobiveni su unošenjem svakog polja uzorka u sustav za snimanje i korištenjem automatskog brojača stanica na temelju praga intenziteta i kriterija isključenja veličine za uklanjanje šuma. Ukupni broj stanica procijenjen je množenjem prosječne gustoće stanica i retinalne površine. Kako bi se istražila smrt među kolinergičkim neuronima, uzorkovana polja su pregledana na stanične ostatke zadržavajući imunoreaktivnost za ChAT. ChAT-pozitivni (ChAT+) ostaci unutar 15 μm jedan od drugoga brojeni su kao jedna pojava. Piknotične stanice u GCL -u prebrojane su u četiri uzorka (250 × 250 μm 2) po retini, nakon bojenja s propidijevim jodidom. Za uzorkovanje ne-kolinergičnih stanica u sloju ganglijskih stanica (GCL), cijele mrežnice imunobojene su na ChAT (FITC: zeleno), a zatim su označene s PI (TRITC). Cijela debljina GCL -a skenirana je konfokalnim mikroskopom pod postavkom FITC+TRITC filtra, uzimajući osam uzoraka (250 × 250 μm 2) po retini u dva pravilno raspoređena ekscentriciteta duž četiri okomite osi. Sve PI stanice koje nisu označene za ChAT tada su prebrojane pomoću Metamorpha. Brojene su i vodoravne stanice (tau-imunoreaktivne), dopaminergične amakrine [stanice unutarnjeg nuklearnog sloja (INL) imunoreaktivne za tirozin hidroksilazu (TH)] i AII amakrinske stanice (onesposobljena 1 imunoreaktivna): vodoravne stanice uzorkovane su u četiri (400 × 400 μm 2) uzorci. TH stanice uzorkovane su u osam uzoraka s pravilnim razmakom (400 × 400 μm 2) koji su ograničeni na dorzotemporalnu retinu gdje su te stanice ograničene u ranom životu (Wu i Cepko, 1993.) AII stanice uzorkovane su u četiri srednje ekscentričnosti (250 × 250 μm 2) polja uz četiri okomite osi.

Nacrti, histogrami učestalosti i statistička analiza napravljeni su pomoću Origin 7.0 (Microcal). Za izračun autokorelacije, profila za oporavak gustoće (DRP) i učestalosti ćelija bliže od 15 μm jednom od njihovih susjeda korišteni su prilagođeni programi. DRP i radijus isključenja (ER) izračunavaju se na sljedeći način. Koncentrični krugovi se prate na konstantnim udaljenostima (ovdje 2,5 μm) jedan od drugog u autokorelaciji, a dobiva se histogram (DPR) gustoće autokorelacijskih brojeva u prstenovima omeđenim s dva uzastopna kruga. Vrijednosti DRP -a vrlo su niske blizu središta autokorelacije (što odražava središnju rupu), a zatim rastu do konačne konstantne gustoće u kantama daleko od ishodišta. ER se dobiva kao polumjer prve kružnice (FC) gdje histogram doseže ili premašuje svoju prosječnu konačnu gustoću minus korekcija koja važi brojeve autokorelacije koji se nalaze u prstenovima unutar FC. Ova korekcija izračunava se kao gustoća brojanja unutar FC kruga podijeljena s prosječnom vrijednošću platoa DRP -a dosegnutom od ishodišta i pomnoženom za veličinu spremnika histograma (Rodieck, 1991). Kako bi se procijenila učestalost staničnih parova s ​​međustaničnom udaljenošću ispod 15 μm, podaci iz mrežnica tretiranih apirazom i oksidiranom ATP (oATP) su združeni. Učestalost staničnih parova izračunata je kao postotak ukupnog broja parova stanica u polju. Na polju sa n stanice postoje n * (n-1)/2 para stanica.

Reagensi

Fluorescentno konjugirani dekstrani (10 kDa, konjugirani s Alexa Fluo 488 ili 568 ili Oregon Green 488), a fluorescentno konjugirana sekundarna antitijela su iz Molecular Probes, Eugene, OR. Suramin je bio iz Calbiochema. Protutijela na kolin acetiltransferazu (ChAT) i tirozin hidroksilazu (TH) bila su iz tvrtke Chemicon. BrdU monoklonsko protutijelo bilo je iz Rochea. P2X7poliklonalni je prethodno opisan (Ferrari i sur., 1997.) A8 poliklonalni otočić Islet 1/2 bio je ljubazan dar T. Jessella, a antitijela osobama s invaliditetom 1 ljubazni dar B. Howella. Sve ostale kemikalije bile su iz Sigme.


Sadašnja adresa: Odsjek za patologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta Stanford, Stanford, CA, SAD

Pripadnosti

Zavod za farmakologiju i kemijsku biologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta Emory, Atlanta, GA, SAD

Riley E.Perszyk, Sharon A. Swanger, Chris Shelley, Alpa Khatri, Jing Zhang, Phuong Le, Hongjie Yuan & amp Stephen F. Traynelis

Virginia Tech Carilion Research Institute, Roanoke, VA, SAD

Zavod za unutarnju medicinu, Medicinski fakultet Virginia Tech Carilion, Roanoke, VA, SAD

Odjel za biomedicinske znanosti i patobiologiju, Fakultet veterinarske medicine Virginia-Maryland, Virginia Tech, Blacksburg, VA, SAD

Odjel za biologiju, Sveučilište Jug, Sewanee, TN, SAD

Odjel za kemiju, Sveučilište Emory, Atlanta, GA, SAD

Gabriela Fernandez-Cuervo, Matthew P. Epplin, Ethel Garnier-Amblard, Pavan Kumar Reddy Gangireddy, David S. Menaldino, Dennis C. Liotta & amp Lanny S. Liebeskind

Odsjek za fiziologiju, Sveučilište Emory, Atlanta, GA, SAD

Odjel za staničnu biologiju, Sveučilište Emory, Atlanta, GA, SAD

Pernille Bülow & amp Gary J. Bassell

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google znalcu

Doprinosi

Autori su doprinijeli na sljedeći način: prikupljanjem podataka konceptualizacijom (SFT, REP i SAS) i formalnom analizom (REP, SAS, CS, AK, GF-C., HY i SFT) (SAS, SFT, HY, DCL i GJB) (REP, SAS, CS, AK, JZ, PL, EG-A., GF-C., MPE, DSM i PB) razvoj ili dizajn metodologije (REP, SAS, SFT, EG-A., GF -C., MPE, GJB, DSM, DCL i LSL) administracija projekata (REP, SFT i SAS) pružanje reagensa, materijala i alata za analizu (PKRG, EG-A., GF-C., PB, GJB, MPE, DSM, DCL i LSL) softver (REP i SFT) nadzor (SFT, LSL, DCL i GJB) provjera (REP, SAS, CS, AK, GF-C., MPE i DSM) i vizualizacija i pisanje (svi autori).

Odgovarajući autor


Metode

Materijali

Medij za kulturu uključujući DMEM i fetalni goveđi serum kupljen je od Gibco Life Technology Invitrogen (Grand Island, NY, USA). Oligo-fektamin, MEMI, fluo-4 AM, natrij-vezujući benzofuran izoftalat (SBFI) AM, zrnca G-agaroze, TFR antitijelo, β-aktinsko protutijelo, GFAP protutijelo, DMT1 antitijelo i DMT1 siRNA dupleks lanci su iz Thermo Fisher Scientific ( Waltham, MA USA) siRNA dupleks lanci TFR, NCX1-3, Cav-3 i Dab2, NCX2 antitijela, Na + /K + -ATPase alfa1 /2 antitijela i sekundarna protutijela su kupljena od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA , SAD). NCX1 antitijelo, NCX3 antitijelo i nativni mišji apo-transferin (apo-TF tj. Bez željeza) su iz Abcam-a (Cambridge, MA, SAD). Magareći serum, ksestospongin C (Xe-C), nifedipin, željezov sulfat heptahidrat (FeSO4), sulforhodamine 101 (SR101) i amonijev citrat željeza kupljeni su od Sigma-Aldricha (St. Louis, MO, USA). Ryanodine i KB-R7943 kupljeni su od Calbiochema (La Jolla, CA, USA). Sekundarna antitijela obojena magarećim anti-mišjim ili zečjim Cy-2/3 bila su iz Jackson Immuno-Research (West Grove, PA, SAD). Primarno antitijelo na histon H3 kupljeno je od EarthOx -a (Millbrae, CA, SAD).

Životinje

Miševi C57BL/6, FVB/N-Tg (GFAP-eGFP) 14Mes/J i B6.Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/J transgeni miševi svi su kupljeni u laboratoriju Jackson (Bar Harbor, ME, SAD) . Životinje su uzgajane u standardnim uvjetima držanja (ciklus svjetlo/mrak 22 ± 1 ° C od 12/12 h), s vodom i hranom na raspolaganju ad libitum. Svi su pokusi izvedeni u skladu s Vodičem za njegu i uporabu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje SAD -a (NIH publikacija br. 8023) i revizijom iz 1978., a sve eksperimentalne protokole odobrio je Kineski odbor za njegu i uporabu životinja Kine. Medicinsko sveučilište, br. [2019] 059.

Primarna kultura astrocita

Astrociti su uzgojeni iz novorođenih miševa 71,72. Ukratko, moždane hemisfere su izolirane, disocirane i filtrirane. Izolirani astrociti uzgojeni su u Dulbeccovom minimalnom esencijalnom mediju (DMEM) sa 7,5 mM glukoze nadopunjenom s 10% fetalnog goveđeg seruma. Astrociti su inkubirani na 37 ° C u vlažnoj atmosferi CO2/zrak (5: 95%). Kulture su jako obogaćene astrocitima, čistoća je> 95% prema GFAP bojenju 73.

Liječenje željezom

Za pripremu otopine Fe 3+ -TF, željezni amonijev citrat i mišji apo-TF inkubirani su u omjeru 2: 1 u mediju za kulturu bez seruma 1 sat na 37 ° C 74,75. Za kontrolne tretmane korištena je ista koncentracija apo-TF u istom volumenu medijuma za kulturu, ali bez Fe 3+. Za otopinu Fe 2+, FeSO4 svježe je disociran u mediju za kulturu bez seruma na 37 ° C i odmah upotrijebljen, isti volumen medija bez kulture za serum korišten je kao kontrola za skupinu Fe 2+.

Ometanje RNA

Uzgojeni astrociti inkubirani su u DMEM -u bez seruma 12 sati prije transfekcije 73,76,77. Otopina za transfekciju koja sadrži 2 μl oligo-fektamina (Promega, Madison, WI, SAD), 40 μl MEMI i 2,5 μl siRNA (DMT1, TFR, NCX1-3, Cav-3 ili Dab2) dodana je u medij za kulturu u svakom dobro 8 h. U siRNA-negativne kontrolne kulture dodana je otopina za transfekciju bez siRNA. Nakon toga, kulturama je dodan DMEM s tri puta serumom. Ovi duPlex lanci siRNA kupljeni su od Santa Cruz Biotechnology (CA, USA).

Priprema membranskih kaveola

Homogenizacija stanica i priprema kaveola iz astrocita je 78,79. Ukratko, primarno uzgojeni astrociti su sakupljeni i homogenizirani u SET-u (0.315 M saharoze, 20 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA, pH 7.4), te centrifugirani 1 h na 1.000 × g. Peleti su ponovno otopljeni u SET-u i slojeni na Percoll-u (30% u SET-u) nakon centrifugiranja na 1000 × g. Peleti su ponovno homogenizirani i ponovno slojeviti u tri otopine gradijenta gustoće saharoze (80%, 30%i 5%) ultra-centrifugiranjem na 175.000 × g. Konačno, pročišćene kaveole su prikupljene i ponovno suspendirane u SET-u.

Ko-imunoprecipitacija

Koristili smo tehnologije suimunoprecipitacije i naknadnog Western blot-a za provjeru razine konjukcije između NCX-a i DMT1 76. Nakon homogenizacije, sadržaj proteina određen je Bradfordovom metodom 80 koristeći goveđi serumski albumin kao standard. Za imunoprecipitaciju NCX1-3, lizati cijelih stanica (500 μg) inkubirani su s 20 μg antitijela protiv NCX1, anti-NCX2 ili anti-NCX3 preko noći na 4 ° C. Zatim je dodano 200 μl isprane proteinske kaše zrnaca G-agaroze i smjesa je inkubirana još 2 sata na 4 ° C. Zrnca agaroze isprana su tri puta hladnom otopinom fosfatnog pufera (PBS) i sakupljena impulsnim centrifugiranjem (5 s u mikrocentrifugi na 14 000 × g), supernatant je ocijeđen, a kuglice kuhane 5 minuta. Nakon toga, supernatant je prikupljen impulsnim centrifugiranjem, a čitavi imunoprecipitati podvrgnuti su elektroforezi s 10% -tnim natrij dodecil sulfatom (SDS) -poliakrilamid gelom (PAGE).

Ekstrakcija proteina citoplazme i jezgre

Podstanična frakcija je analizirana pomoću kompleta za ekstrakciju proteina (P0028, Beyotime, Šangaj, Kina) 81, prema protokolu proizvođača. Za daljnje Western blot testove ekstrakcije citoplazmatskih i nukleinskih proteina držane su na -20 ° C.

Western blotting

Za kvantificiranje ekspresije DMT1, TFR, NCX1-3, Cav-3 ili Dab2, uzorci koji sadrže 100 μg proteina dodani su u pločaste gelove. Nakon prijenosa na PVDF membrane, uzorci su blokirani 10% obranog mlijeka u prahu tijekom 1 sata, a membrane su inkubirane preko noći s primarnim antitijelima, specifičnim za bilo DMT1 u razrjeđenju 1: 300, TFR u razrjeđenju 1: 200, NCX1 u razrjeđenju 1: 100, NCX2 u razrjeđenju 1: 200, NCX3 u razrjeđenju 1: 150, Cav-3 u razrjeđenju 1: 200, Dab2 u razrjeđenju 1: 100, Histon H3 u razrjeđenju 1: 500 ili β -aktin u razrjeđenju 1: 1000. Nakon ispiranja, sekundarna antitijela konjugirana s hrenom peroksidazom otkrila su specifično vezanje. Slike su analizirane pomoću Sistema za analizu snimanja gelom za elektroforezu (MF-ChemiBIS 3.2, DNR Bio-Imaging Systems, Izrael). Gustoća pojasa mjerena je 32-bitnim softverom Window AlphaEase TM FC 72,82.

Praćenje [Ca 2+]i

Za [Ca 2+]i praćenje i snimanje u uzgojenim astrocitima 83,84, nakon prethodnog tretmana sa ili bez inhibitora ili duRex lanaca siRNA, primarno uzgojeni astrociti napunjeni su s 5 μM fluo-4-AM, (Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)) , 30 min. Signali Fluo-4 vizualizirani su fluorescentnom mikroskopijom (Olympus IX71, Japan). Očitavanja svih stanica pozitivnih na fluo-4 u jednom izmjerenom vidnom polju u svakoj kulturi uključena su u statistiku, intenzitet fluorescencije fluo-4 normaliziran je na osnovni intenzitet prije stimulacije. Mjerenja su ponovljena u 10 različitih kultura. Uzgojeni astrociti također su obojeni specifičnim markerom sulforhodaminom 101 (SR101) pri razrjeđenju 1: 2000.

Dvofotonsko in vivo snimanje Ca 2+

Odrasli transgeni miševi FVB/N-Tg (GFAP-eGFP) 14Mes/J (stari 10-12 tjedana) anestezirani su ketaminom (80 mg/kg, i.p.) i ksilazinom (10 mg/kg, i.p.). Tjelesna temperatura praćena je rektalnom sondom, a miševi su grijaćom dekom održavani na 37 ° C. Metalna ploča izrađena po narudžbi zalijepljena je na lubanju zubnim akrilnim cementom, a preko desne hemisfere pripremljen je kranijalni prozor na 2,5 mm bočno i 2 mm straga od bregme. Somato-senzorne kortikalne stanice napunjene su Ca 2+ indikatorom Rhod-2 AM (50 μM, 1 h). Transkranijalni prozor bio je superfuzijski spojen s umjetnim CSF -om. Nakon što je postignuto stabilno početno snimanje, dodano je Fe 2+ (100 μM) ili Fe 3+ -TF (100 μM) tijekom 1 minute. Propusni filteri (Chroma) bili su 540 nm/40 nm za eGFP i 850 nm/70 nm za signale rhod-2. Usporene slike astrocitne Ca 2+ signalizacije snimljene su svakih 5 s pomoću FluoView-a s prilagođenim dvofotonskim laserskim skeniranjem (Nikon AR1, Japan) 84,85.

Unutarstanična mjerenja Na +

Za nadzor unutarstaničnog ioniziranog Na + ([Na +]i) u kultiviranim astrocitima, primarno kultivirani astrociti su napunjeni s 10 μM indikatora osjetljivog na Na + SBFI-AM 30 minuta u mediju bez seruma, s naknadnim ispiranjem od 1 h. SBFI je alternativno pobuđen na 340 nm i 380 nm, a emisija je praćena na 500 nm. SBFI signali mjereni su fluorescentnom mikroskopijom (Olympus IX71, Japan) i izraženi kao omjer (R = F340/F380) 52 .

Imunofluorescencija

Tkivo mozga fiksirano je potapanjem u 4% paraformaldehid i izrezano na kriške od 100 μm 72,82. Kultivirane stanice su fiksirane sa 100% metanolom na -20 ° C. Kriške ili stanice mozga permeabilizirane su inkubacijom tijekom 1 sata s magarećim serumom. Primarna antitijela protiv DMT1 ili TFR korištena su u razrjeđenju 1: 100, a protiv glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) u razrjeđenju 1: 200. Jezgre su obojene markerom 4 ′, 6′-diamidino-2-fenilindol (DAPI) pri razrjeđenju 1: 1000. Primarna protutijela inkubirana su preko noći na 4 ° C, a zatim magareće anti-mišje ili anti-zečje Cy-2/3 konjugirano sekundarno protutijelo 2 sata na sobnoj temperaturi. Slike su snimljene konfokalnim skenirajućim mikroskopom (DMi8, Leica, Wetzlar, Njemačka).

ELISA testovi

Astrociti su inkubirani na 37 ° C u svježem mediju za kulturu bez seruma nakon tretmana sa Fe 2+ /Fe 3+ ili inhibitorima, astrociti su sakupljeni i centrifugirani na 10 000 × g 10 minuta za uklanjanje plutajućih stanica i/ili ostataka stanica na 4 ° C. Za ispitivanje aktivnosti NKA, komercijalni ELISA komplet (abx255202 Abbexa, Cambridge, UK) korišten je i radio kao protokoli, osjetljivost je 0,19 ng/mL, optička gustoća (OD) izmjerena je na 450 nm, a vrijednost OD bila je normalizira kontrolna skupina. Za ispitivanje InsP3 koncentracija 86, sakupljen je supernatant i koncentracija InsP3 ispitano pomoću komercijalnog ELISA pribora (E-EL-0059c Elabscience Biotechnology, Wuhan, Kina).

Sortiranje neuronskih stanica putem sortirača stanica aktiviranih fluorescencijom (FACS) i kvantitativnog PCR -a (qPCR)

Za mjerenje mRNA za TFR i DMT1 korišteni su astrociti koji eksprimiraju fluorescentni marker GFP (miševi GFAP-GFP) i neuroni koji eksprimiraju fluorescentni marker YFP (miševi Thy1-YFP). Također smo ekstrahirali tkiva hemisfera mozga iz miševa divljeg tipa. Stanice transgenih miševa korištene su za specifično sortiranje astrocita ili neurona s FACS 85,87. RNZ sortiranih stanica i cerebralnog tkiva ekstrahiran je Trizolom. Ukupna RNA je obrnuto transkribirana i PCR amplifikacija je izvedena u Robo-cycler termocikleru 81,84. Relativna količina transkripata procijenjena je pomoću peterostrukih serijskih razrjeđenja RT produkta (200 ng). Količina RNA normalizirana je na gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH), a vrijednosti su izražene kao omjer TFR/GAPDH ili DMT1/GAPDH.

Statistika i ponovljivost

Za statističku analizu koristili smo jednosmjernu analizu varijance (ANOVA) nakon koje je uslijedio Tukey's ili Dunnettov post hoc test višestruke usporedbe za nejednake replikacije koristeći softver GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) i softver SPSS 24 ( International Business Machines Corp., NY, SAD). Jednosmjerna ANOVA za usporedbe koja uključuje više od dvije grupe nesparenog dvostranog t-testa za usporedbe dvije grupe. Svi statistički podaci u tekstu prikazani su kao srednja vrijednost ± SD, vrijednost značajnosti je postavljena na str & lt 0,05.

Sažetak izvješćivanja

Dodatne informacije o dizajnu istraživanja dostupne su u Sažetku izvješća o istraživanju prirode povezanom s ovim člankom.


Rezultati

CLN-5 mjesta su povećana blizu površine mikrovaskulature mozga u mozgu AD

Budući da se za CLN-5 pozitivne EV-e koje oslobađaju mikrovaskularne endotelne stanice mozga sugeriralo da su mehanizam za transendotelnu migraciju leukocita tijekom neuroupala (Paul i sur., 2016.), procijenili smo prisutnost ovih CLN-5+ struktura u blizini mikrovaskulature u CNT-u , SAD i FAD ljudski mozak. Bojanje je otkrilo značajno povećanje mikrovaskularnog CLN-5 i u SAD i u FAD tkivima u usporedbi s CNT tkivima (slike 1A, B i dopunska slika S1). Zanimljivo je da je u SAD-u i FAD-u uočen obilan mikrovaskularni uzorak bojenja (crni vrhovi strelica i umetci), dok su uzorci CNT-a pokazali suptilnu CLN-5 reaktivnost. Kako bismo okarakterizirali ovaj obrazac, označili smo mikrovaskularnu bazalnu laminu (UEA I+) i proveli konfokalnu slikovnu analizu ograničenu na ove strukture. Unatoč širokom i raspršenom profilu označavanja CLN-5 duž tkiva, opazili smo posebno intenzivne fluorescentne signale s CLN-5+ mrlja unutar i oko mikro posuda u tkivima CNT i AD (slike 1C, C ’). Analizom slike otkriveno je deseterostruko povećanje broja ovih CLN-5+ mrlja u uzorcima SAD-a u usporedbi s uzorcima CNT-a i oko četverostruko povećanje u usporedbi s uzorcima FAD-a (slika 1D), dok se FAD nije značajno razlikovao od CNT-a.

Da bismo procijenili jesu li te mrlje CLN-5+ bile morfološki različite među eksperimentalnim skupinama, usporedili smo njihov prosječni volumen. Međutim, utvrđeno je da je prosječni volumen mrlja CLN-5+ u tri uvjeta sličan i da se kreće od 𢏀.017 do 0.022 μm 3 (slika 1E). Na kraju, budući da smo promatrali CLN-5 mrlje luminalno (crvene vrhove strelica, slike 1C, C ’), apsolutno (bijele vrhove strijela) i na različitim udaljenostima od površina mikro posuda (prazne vrhove strelica), odredili smo postotak ukupnog broja CLN-5+ mrlje prisutne unutar mikrovaskulature i postotna raspodjela ovih čestica u proizvoljnom rasponu od 5 μm od površine abluminalne mikro posude (slika 1F). Reprezentativne 3D rekonstrukcije mikro posuda i mrlja prikazane su na slici 1G. I u tkivima CNT-a i AD-a većina ukupnih mrlja CLN-5+ prisutnih u blizini mikro posuda odgovara luminalnim česticama (㹢% Slika 1F, lijeva ploča). Štoviše, SAD je pokazao 28% više luminalnih CLN-5+ mrlja od CNT-a i 15% više od FAD-a. S obzirom na abluminalnu raspodjelu mrlja CLN-5+, tkivo SAD-a pokazalo je veći postotak čestica postavljenih izravno na površinu posude (čestice prisutne između 0 do 1 μm od površine posude) u usporedbi s tkivom CNT-a (㺙% u SAD vs. �% u CNT-u) (slika 1F, desna ploča) tkivo SAD-a također je sadržavalo nešto širu raspodjelu CLN-5+ mrlja na cijeloj procijenjenoj udaljenosti. Iako je raspodjela mrlja CLN-5+ u FAD-u bila slična onoj u SAD-u (㺔% čestica blizu površine), razlika u usporedbi s CNT grupom nije bila statistički značajna. Zajedno su naši rezultati pokazali da su CLN-5+ mrlje povezane s mikrovaskulaturom mozga i da su povećane u SAD.

EV se povećavaju u AD pacijenata

Na temelju nalaza da su CLN-5+ točke povećane u mikrovaskulaturi mozga s AD, izolirali smo sistemske EV i otkrili da su CLN-5 i Flotillin-1 dio molekularnog sastava u tim EV (dodatna slika S2A). Zatim smo za karakterizaciju sistemskih EV-ova usporedili distribuciju veličine i koncentraciju CNT-, SAD- i FAD-EV. Pojedinačni histogrami NTA prikazani su na dopunskoj slici S2B. Otkrili smo čestice veličine od 50 do 700 nm, koje odgovaraju veličini egzosoma i MV -a. Među uzorcima nisu pronađene razlike u koncentraciji (dopunska slika S2C).Utvrdili smo značajno povećanje srednje veličine SAD- (prosjek = 173,4 nm) i FAD-EV (prosjek = 178,3 nm) u usporedbi s CNT-EV (prosjek = 143,8) (slika 2A). D10 prikazuje donju granicu od 10% izmjerenih čestica, D50 prikazuje polovicu izmjerenih čestica (50%), a D90 gornju granicu od 90% izmjerenih čestica. Nije uočena razlika u D10 i D50 među uzorcima (slike 2B, C). Nasuprot tome, otkrili smo značajno povećanje D90 u SAD-u i FAD-EV u usporedbi s CNT-EV (slika 2D).

Slika 2. Koncentracija i broj EV povećani su u plazmi AD pacijenata. (A) Prosječna veličina EV -a mjerena NTA -om kod pacijenata sa CNT (crna), SAD (narančasta) i FAD (crvena). (B) D10, (C) D50, i (D) D90 parametri dobiveni NTA -om. (E) Reprezentativni konturni prikaz populacije kontrolnog uzorka EV i referentne kuglice različitih veličina. (Ž) Koncentracija EVs/mL mjerena protočnom citometrijom u cijelom području i (G) u različitim intervalima veličine: SN, 0,1 𠄱 apoptotička tijela, 1 𠄶. Za (A 𠄽), reprezentativni podaci CNT -a, n = 6 SAD, n = 5 FAD, n = 6. Za ploče (E –G), reprezentativni podaci CNT -a, n = 6 SAD, n = 6 FAD, n = 6. Podaci se iscrtavaju kao srednji i SEM. Jednosmjerni ANOVA, Tukeyjev test za višestruku usporedbu. * označava str < 0,05 * * * označava str < 0,001.

Pomoću protočne citometrije otkrili smo čestice veličine od 100 do 6000 nm, što je odgovaralo veličinama MV-a i apoptotičkih tijela (AB) (slika 2E). Utvrdili smo značajno povećanje koncentracije SAD- i FAD-EV u usporedbi s CNT-EV (slika 2F). Nadalje, upotrijebili smo referentne kuglice veličine kako bismo pojasnili u kojem se intervalu veličine EV razlikuju. Intervali veličine bili su: 0,1 𠄱, 1 𠄳 i 3 𠄶 μm. Utvrdili smo značajno povećanje koncentracije EV samo u području 0,1 𠄱 μm, što odgovara MV (slika 2G). Utvrdili smo nižu koncentraciju MV i AB u cerebrospinalnoj tekućini u usporedbi s plazmom (dopunska slika S2F), ali nismo pronašli razliku u CSF-EV među različitim skupinama (dopunska slika S2G). Ovi rezultati ukazuju na to da su sistemski EV povećani u AD.

Diferencijalni fenotip sistemskih električnih vozila u FAD i SAD

Kako bismo utvrdili fenotip sistemskih EV-a, analizirali smo markere krvi i moždanih stanica, mitohondrije i izloženost PS-om pomoću protočne citometrije (strategija gatiranja prema onoj prikazanoj na Dodatnoj slici S3). Kao vizualni prikaz postotka pozitivnih događaja i MFI, prikazane su dvije toplinske karte sa šest uzoraka po skupini (slike 3A, D). Samo je SAD pokazao povećan postotak EV -a pozitivnih na leukocitne (CD45+), endotelne (CD105+) i eritrocitne (CD234a) markere (slike 3A, B), ovo povećanje je također primijećeno u MFI za biljege leukocita i eritrocita te za mitohondrije (DIOC6) u SAD-EV-ima u usporedbi s CNT-EV-ovima (slike 3D, E). Zanimljivo je da je samo FAD imao povećan postotak pozitivnih EV i MFI za marker trombocita (CD41a+) (slike 3A, B, D, E). Nadalje, SAD-EV su pokazali povećani MFI za endotelne i eritrocitne markere (slike 3D, E) te su imali EV koji su bili dvostruko pozitivni na leukocitne i endotelne biljege (CD45+/CD105+) u usporedbi s FAD-EV (slika 3C). Štoviše, AD-EV su pokazali tendenciju povećanja postotka EV-a pozitivnih na markere mitohondrija, astrocita (AQ4) i neurona (CD90) u usporedbi s kontrolnim EV-ima. Ovi rezultati sugeriraju da SAD-EV imaju endotelno-leukocitni fenotip i da FAD-EV imaju fenotip trombocita.

Slika 3. Diferencijalni fenotip SAD- i FAD-EV. (A) Toplinska karta postotaka EVs pozitivnih na stanične markere (CD41, trombociti CD45, leukociti CD105, endotel CD235a, eritrociti AQ4, astrociti CD90, aneksin sličan neuronima, fosfatidilserin i DIOC6, mitohondriji) iz svakog uzorka CNT, FAD i SAD. (B) Usporedba postotaka EV -a pozitivnih na stanične markere u grupiranim podacima na ploči (A). (C) Postoci EV-ova dvostruko pozitivni na markere (CD45, leukocitni CD105, endotel) u CNT-u, FAD-u i SAD-u. (D) Toplinska karta normaliziranog MFI staničnih markera (znači podaci od CNT pojedinaca). (E) Usporedba normaliziranih MFI staničnih markera za grupirane podatke na ploči (C). Reprezentativni podaci CNT -a, n = 6 SAD, n = 6 FAD, n = 6. Podaci se iscrtavaju kao srednji i SEM. Jednosmjerni ANOVA, Tukeyjev test za višestruku usporedbu. * označava str < 0,05 * * označava str < 0,01 * * * označava str < 0,001.

Različite količine sastava proteina u SAD i FAD-EV

Za određivanje proteinskog sastava EV-a koristili smo pristup bez oznaka LC-MS i analizirali uzorke pacijenata s CNT-om, FAD-om i SAD-om. Ukupno je identificirano 130 proteina (FDR 0,1%, dopunska tablica S1) s različitom količinom za svaki uzorak. Prikazana je toplinska karta profila proteina od 130 proteina (slika 4A), gdje svaka boja predstavlja log2 (omjer) prosječne količine u različitim uzorcima normaliziranim na prosjek CNT-EV. Hijerarhijsko grupiranje generirano je pomoću algoritma za pridruživanje susjeda s Euklidovom mjerom sličnosti udaljenosti log2 omjera proteina svakog uzorka (za jednu skupinu) ili svake skupine (za više skupina). PLS-DA analiza pokazala je profil proteina za sve eksperimentalne skupine, koje su razlikovale tri faktora (slika 4B i dodatna tablica S2). Za razlikovanje skupina korišteni su proteini SORD, SAA4, LBP, SERPINF1, PLPT, APOE, APOA2, IGKV1D-33 i IGKV1-33, C8A. Osim toga, PLS-DA analiza pokazala je da se kontrolna skupina nalazila u diferencijalnoj prostornoj ravnini od grupa FAD (slika 4C) i SAD (slika 4D). Proteini gama, alfa i beta lanca fibrinogena (FGG, FGA, FGB), komplement C6, peroksireoksin 2 (PRDX2), protein 1 koji veže fosfatidiletanolamin (PEBP1), karboksipeptidaza N podjedinica 2 (CPN2), faktor izveden iz pigmentnog epitela (SERPINF1 ), protein 1 koji veže masne kiseline (FABP1) i inhibitor serin proteaze 10 (SERPINA 10) korišteni su za razlikovanje SAD grupe od CNT skupine (slika 4C). Komplement C2 i C8A, SORD, PLPT, imunoglobulini (IGKV1D-33, IGKV1-33, IGVH3-7 i IGVK1-8), LBP i APOA2 korišteni su za razlikovanje FAD skupine od CNT skupine (slika 4D). Dodatno, PLS-DA analiza pokazala je da se FAD nalazio u drugačijoj prostornoj ravnini od SAD-a (slika 4D). Inhibitor inter-alfa-tripsina teški lanac H3 (ITIH3), alfa-2-HS-glikoprotein (AHSG), trombospondin-1 (THBS1) PEBP1, protein ekstracelularnog matriksa sličan fibulinu koji sadrži EGF (EFEMP1), imunoglobulin lambda poput polipeptida 5 (IGLL5), plazmin (PLG), inhibitor C1 inhibitora proteaze u plazmi (SERPING1) i imunoglobulini (IGKV1-17 IGLV1-51) također se mogu koristiti za razlikovanje ovih skupina (slika 4E).

Slika 4. Proteinski sastavi SAD- i FAD-EV. (A) Toplinska karta proteinskog nabora mijenja se za svaki uzorak u usporedbi sa srednjom vrijednosti CNT-EV. Ukupno je uzeto u obzir 130 proteina korištenjem promjene 1,2 puta i FDR ≤ 1%. (B) Više varijabilnih analiza iz CNT-, SAD- i FAD-EV. PLS-DA je korišten za razlikovanje broja proteina u CNT-u u usporedbi s SAD-om (C), CNT u usporedbi s FAD -om (D), i SAD u usporedbi s FAD (E). Za ploče (A 𠄾), reprezentativni podaci CNT -a, n = 5 SAD, n = 5 FAD, n = 5.

Koristeći DAVID bioinformatiku za funkcionalne GO izraze, promatrali smo proteine ​​iz: 𠇎 Izvanstanične egzosome, ” 𠇎 Izvanstanične regije, ” 𠇎 Izvanstaničnog prostora, ” 𠇋lood mikročestica, ” “R Eceptor-Media , ” 𠇊ktiviranje komplementa, ” i 𠇊 vezanje antigena ” (slika 5A). Pomoću PANTHER GO-Slim-a u analizu su uključeni sljedeći termini molekularnih funkcija GO: 𠇋inding, ” �talytic Activity, ” i “Molecular Function Regulator ” bile su glavne funkcije povezane s otkrivenim proteinima u električnim vozilima (slika 5B). Nadalje, pojmovi klase GO proteina, kao što su 𠇎nzyme modulator, ” �nse/Immunity Protein, ” i “Hydrolase, ” and the GO pathway terms �ss Coagulation, ” “Plasminogen Put aktivnosti, ” i “Inflamacija posredovani kemokinom i citokinom Signalni put ” bili su glavne komponente povezane s proteinima otkrivenim u EV (slike 5C, D).

Slika 5. Putevi uključeni u sastav proteina EV i različit sastav proteina u SAD i FAD-EV. (A) Funkcionalne napomene temeljene na DAVID -u, (B) Molekularna funkcija, (C) Klasa proteina i (D) Signaling Pathway temeljen na PANTHER GO-Slim bilješci od 130 proteina analiziranih u EV-ovima. Nacrt vulkana koji prikazuje proteine ​​u kojima je povećana ili smanjena vrijednost (E) SAD-EV u usporedbi s CNT-EV, (Ž) u FAD-EV-ima u usporedbi s CNT-EV-ovima (G) i u SAD-EV-ima u usporedbi s FAD-EV-ovima. Imena su prikazana za proteine ​​s log2-kraćom promjenom većom od 1. Za ploče (A 𠄾), reprezentativni podaci CNT -a, n = 5 SAD, n = 5 FAD, n = 5.

Na vulkanskim tablicama prikazani su različito izraženi proteini u različitim uzorcima. Proteini su prikazani kao log2-kratna promjena veća od 1 i sa značajem od str < 0,05 (slike 5E –G i dodatna tablica S2). SORD i PLTP (protein za fosfolipidni prijenos) smanjeni su u FAD -u u usporedbi s CNT komplementom C6 je smanjen u SAD -u u usporedbi s CNT -om i SERPINF1, THBS1, AHSG i imunoglobulini su smanjeni u SAD -u u usporedbi s FAD. Imunoglobulini su povišeni u FAD-u u usporedbi s CNT PEBP1, a faktor komplementa D (CFD) u SAD-u u usporedbi s CNT-om i proteinom koji veže IgGFc (FGCBP), ITH3 i EFEMP1 povećani su u SAD-u u usporedbi s FAD-om. Zajedno, naši rezultati ukazuju na različit sastav proteina EV-a iz SAD-a i FAD-a, koji bi mogao biti povezan s kaskadom koagulacije, upalom i metabolizmom lipida i ugljikohidrata.

AD-EV prelaze ljudske stanice mikrovaskulature i izazivaju endotelni poremećaj i hiperreaktivnost astrocita

Kako bismo procijenili prelaze li sistemski EV-ovi kroz mikrovaskulaturu i stupaju li u interakciju s stanicama moždanog parenhima, proveli smo test transcitoze pomoću hCMEC/D3 humanih stanica mikrovaskulature. Više od 70% CNT-, SAD- i FAD-EV prelazi mikrovaskulaturu (slika 6A). Nakon toga, monokulture i kokulture stanica NVU tretirane su EV -ovima. Iako je postotak inducirane citotoksičnosti bio sličan između SAD-EV i FAD-EV u monokulturama, samo su SAD-EV izazvali značajno povećanje citotoksičnosti astrocita i endotela

Slika 6. AD-EV prelaze BBB i izazivaju endotelnu disfunkciju i hiperaktivnost astrocita. (A) Postotak transcitoze CNT-, SAD- i FAD-EV kroz hCMEC/D3 stanice mikrovaskulature ljudskog mozga. (B) Citotoksičnost u neuronskim, astrocitnim i endotelnim monokulturama, i (C) citotoksičnost u astrocitno-endotelnim kokulturama izražena kao postotak LDH oslobođenog iz stanica 24 sata nakon tretmana CNT-, SAD-, FAD-EV. (D) Morfološka karakterizacija astrocita: F-aktin je prikazan crvenom bojom, GFAP citoskelet zelenom bojom, a jezgre plavom bojom. Povećanje 20 ×, ljestvica 100 μm. Endotel: F-aktin je prikazan crvenom bojom, p120 katenin zelenom bojom, a jezgre plavom bojom. Povećanje 20 ×, ljestvica 100 μm. Preklopna promjena GFAP -a (E) i p120 katenin (Ž) intenziteta (MFI) u astrocitima i endotelu tretiranim CNT-, SAD-, FAD-EVs. Preklopna promjena veličine praznine (G) i postotak površine razmaka (H) endotela tretiranog CNT-, SAD-, FAD-EV. Za ploču (A), reprezentativni podaci CNT -a, n = 3 SAD, n = 3 FAD, n = 3. Za ploče (B –H), reprezentativni podaci CNT -a, n = 5 SAD, n = 5 FAD, n = 5. Podaci se iscrtavaju kao srednji i SEM. Jednosmjerni ANOVA, Tukeyjev test za višestruku usporedbu. * označava str < 0,05 * * označava str < 0,01 * * * označava str < 0,001.

(Slika 6B). Štoviše, u kokulturi endotela i astrocita samo su SAD-EV uzrokovali povećanje citotoksičnosti (slika 6C).

Kako bismo procijenili stanični učinak induciran EV-om u kokulturama, analizirali smo astrocitne i endotelne specifične markere (slika 6D). Unatoč tome što su i SAD i FAD-EV povećali MFI proteina glijalne fibrilarne kiseline (GFAP) u astrocitima i područje razmaka između endotelnih stanica (slika 6E), samo su SAD-EV smanjili MFI proteina adhezivnog spoja p120 katenina ( Slika 6F) i povećali veličinu praznina unutar endotela (slike 6G, H). Ovi rezultati pokazuju da obje vrste AD-EV prelaze BBB i izazivaju poremećaj endotela i hiperreaktivnost astrocita, dok su ti učinci pojačani SAD-EV.

AD-EV povećavaju neurotoksičnost i izazivaju disregulaciju kalcija u organoidima ljudskog mozga

Budući da su AD-EV inducirali aktivaciju i poremećaj endocita-endotela, testirali smo učinak sistemskih EV-a na neuroglijalne komponente. Neuronske i astrocitne mono- i kokulture tretirane su SAD-om i FAD-EV-om. Obje vrste AD-EV izazvale su citotoksičnost neurona u monokulturama, međutim, samo SAD-EV izazvale su povećano oslobađanje LDH u astrocitno-neuronskim kokulturama (slike 6B, 7A). Ti su učinci bili povezani s astrocitnom hiperaktivnošću, što je pokazano povećanjem GFAP-a, te smanjenom površinom neuronskih grana, što je pokazano smanjenjem područja F-aktina (slike 7B 𠄽).

Slika 7. AD-EV induciraju neurotoksičnost, hiperreaktivnost astrocita i disregulaciju kalcija. (A) Citotoksičnost astrocitno-neuronskih kokultura izražena je kao postotak LDH oslobođenog iz stanica 24 sata nakon CNT-, SAD-, FAD-EV tretmana. (PRIJE KRISTA) Podaci o promjenama nabora izračunati su dijeljenjem vrijednosti s vrijednostima dobivenim iz stanica bez EV tretmana. (B) Preklopna promjena intenziteta GFAP-a (MFI) astrocita tretiranih CNT-, SAD-, FAD-EV. (C) Preklopna promjena postotaka F-aktina po polju neurona tretiranih CNT-, SAD-, FAD-EV. (D) Morfološka karakterizacija pokazuje sljedeće: Astrociti: F-aktin je prikazan crvenom bojom, GFAP citoskelet je prikazan zelenom bojom, a jezgre plavom bojom. Povećanje 20 ×, ljestvica 100 μm. Neuroni: F-aktin je prikazan crvenom bojom, a jezgre su obojene Hoechstom (plavo). Povećanje 20 ×, ljestvica 100 μm. (E) Citotoksičnost humanih organoida izražena je kao postotak LDH oslobođenog iz stanica 48 sati nakon CNT-, SAD-, FAD-EV tretmana. (Ž) Ljudski kortikalni organoidi tretirani s CNT-, SAD-, FAD-EV tijekom 48 sati inkubirani su s Fluo4 (citoplazmatskim kalcijem) i snimani su svakih 20 s ukupno 30 minuta (15 minuta za mjerenje osnovne aktivnosti i 15 minuta nakon dodavanja 200 μM glutamata). ΔŽ/Žo omjer fluorescencije kvantificiran je u pet polja. Za ploču (A 𠄿), reprezentativni podaci CNT -a, n = 5 SAD, n = 5 FAD, n = 5. U ploči (E), reprezentativni podaci CNT -a, n = 6 SAD, n = 5 FAD, n = 6. U ploči (Ž), podaci predstavljaju skup EV -ova iz CNT -a, n = 3 SAD, n = 3 FAD, n = 3. Podaci se iscrtavaju kao sredstva i SEM. Jednosmjerni ANOVA, Tukeyjev test za višestruku usporedbu. * označava str < 0,05 * * označava str < 0,01.

Kako bismo dodatno razumjeli implikaciju sistemskih EV-a na 3D model kulture, tretirali smo 90 dana stare ljudske kortikalne moždane organoide. Zanimljivo je da su i SAD- i FAD-EV izazvali povećanu citotoksičnost (slika 7E). Nadalje, kao funkcionalni eksperiment, mjerili smo regulaciju kalcija (ΔŽ/Ž0) nakon stimulacije EV -ovima. Snimili smo signal bazalnog kalcija i promjene signala nakon dodavanja glutamata. Zanimljivo je da je analiza promjene kalcija na cijelom polju (ΔŽ/Ž0) pokazalo je da su EV-ovi smanjili odgovor kalcija nakon dodavanja glutamata, ali je to smanjenje bilo drastičnije kao odgovor na FAD i SAD-EV (slika 7F). Podaci ukazuju na to da obje vrste AD-EV induciraju citotoksičnost i umanjuju dinamiku kalcija nakon izlaganja glutamatu u ljudskim kortikalnim organoidima.


Rezultati

Propusnost kalcija nikotinskog receptora 㬙 𻄐 određuje podjedinica 㬙

Injekcija Xenopus laevioociti s cRNA koji kodiraju različite podjedinice nAChR rezultiraju ekspresijom funkcionalnih kanala na staničnoj membrani. Znatna veličina oocita (𢏁 mm), zajedno s visokom razinom ekspresije heterolognog proteina, omogućuje mjerenje struja koje proizlaze iz otvora kanala kao odgovor na primjenu agonista, pomoću tehnike s dvije elektrode naponske stezaljke. S ciljem utvrđivanja je li akumulacija aminokiselina u podjedinici 𻄐 (Franchini i Elgoyhen 2006.) rezultirala poželjnim doprinosom ove podjedinice prijavljenoj visokoj propusnosti kalcija za sisavce 㬙 𻄐 nAChRs (Lipovsek i sur. 2012), prvo smo proučavali relativni doprinos svake podjedinice ovom svojstvu. Analizirali smo odgovore homomernih receptora (sastavljenih samo od identičnih podjedinica) heterologno izraženih u Xenopus jajne stanice. Kako bismo procijenili Ca 2+ flux putem rekombinantnih nAChR -ova, proučavali smo doprinos JaClCa na reakcije izazvane acetilkolinom (Ach). JaClCa je Ca 2+ -ovisan Cl − kanal prisutan u Xenopus oocita, koji ima visoku osjetljivost na Ca 2+ i optimalan je detektor ulaska kalcija u oocit (Barish 1983 Miledi i sur. 1989). Receptori s visokom propusnošću za Ca 2+, kao što su 㬗 (Seguela i sur. 1993) i nAChRs štakora 㬙 𻄐 (Elgoyhen i sur. 2001), imaju značajan doprinos JaClCa na odgovore izazvane ACh-om, u usporedbi sa skromnim doprinosom u nAChR-ovima s nižom propusnošću Ca 2+, kao što su 㬔 㬢 i piletina 㬙 𻄐 (Lipovšek i sur. 2012.).To se može dokazati inkubacijom oocita s membranom propusnim brzim Ca 2+ kelatorom 1,2-bis (2-aminofenoksi) etan-N,N,N′,N′-tetraoctena kiselina-acetoksimetil ester (BAPTA-AM), kojim se ukida komponenta Cl − ukupne izmjerene struje. Slika 1 prikazuje reprezentativne odgovore na 100 μM ACh, pri potencijalu držanja membrane (Vdržati) � mV, prije i nakon 3-satne inkubacije s BAPTA-AM. Radi usporedbe, uključeni su prethodno prijavljeni odgovori heteromernih 㬙 𻄐 nAChR -ova (Lipovšek i sur. 2012.) (slika 1 A). Struje izazvane ACh-om značajno su smanjene amplitude nakon tretmana BAPTA-AM u slučaju štakora 㬙 𻄐 (odgovor nakon BAPTA: 14,8 ± 3,1% početnog odgovora, n = 12), ali je ostalo nepromijenjeno u slučaju pilećih 㬙 𻄐 nAChRs (100,3 ± 14,1%, n = 6, sl. 1 A i dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Zabilježeno je da homomerni receptor štakora ima visoku permeabilnost za kalcij (Katz i sur. 2000), slično onom kod heterogenih receptora štakora 㬙 𻄐 (Elgoyhen i sur. 2001 Lipovsek i sur. 2012 Weisstaub et al. 2002). U skladu s tim, struje izazvane ACh značajno su smanjene nakon inkubacije BAPTA-AM, što ukazuje na snažan doprinos JaClCa na početni odgovor i stoga u flux Ca 2+ kroz ovaj homomerni receptor (slika 1 B, gornji tragovi). Dakle, postotak preostalog odgovora nakon BAPTA-AM (14,3 ± 2,9%, n = 7) bilo je slično onom prije opisanom za štakorske 㬙 𻄐 nAChR (dodatna tablica S1, Dopunski materijal na Internetu Elgoyhen i sur. 2001 Lipovsek i sur. 2012). Nasuprot tome, odgovori na ACh ostali su nepromijenjeni nakon inkubacije BAPTA-AM u oocitima koji eksprimiraju pileći homomerni receptor (99,5 ± 15,1%, n = 4 sl. 1 B, srednji tragovi i dopunska tablica S1, Dodatni materijal na mreži), kako je primijećeno za pileći 㬙 𻄐 nAChR (slika 1 A Lipovšek i sur. 2012), što ukazuje na zanemariv doprinos JaClCa.

Receptori koji sadrže pile i#x003b19 ne aktiviraju oocit JaClCa. Reprezentativni tragovi odgovora izazvanih 100 μM ACh u oocitima koji izražavaju bilo heteroromerične (A), homomerna (B) ili hibridni (C), nAChRs, prije (lijevi 𠅌rni trag) i nakon (desni —sivi trag) 3-satna inkubacija s brzim kalcijevim kalcijem BAPTA-AM (Vdržati = � mV [Ca 2+]izvanstanični = 1,8 mM). Tragovi su reprezentativni za n = 4 � po grupi.

Podjedinice sisavaca (štakori i ljudi) 𻄐 nisu sposobne formirati funkcionalne homomerne receptore (Elgoyhen i sur. 2001 Sgard i sur. 2002). Međutim, injekcija Xenopus oociti s cRNA kodirajućom za podjedinicu piletine rezultirali su ekspresijom funkcionalnih receptora (slika 1 B, niži tragovi). Struje izazvane ACh kroz pileće receptore smanjene su nakon inkubacije BAPTA-AM (12,7 ± 4,7% početnog odgovora, n = 10), što ukazuje na snažan doprinos od JaClCa na ACh odgovor, a time i u flux Ca 2+ (dopunska tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Ovi rezultati sugeriraju da podjedinica 㬙 određuje opseg propusnosti kalcija 㬙 𻄐 nAChR. Kako bismo dodatno ispitali ovu mogućnost, ubrizgali smo Xenopus jajne stanice s dvije alternativne kombinacije podjedinica 㬙 i 𻄐, tako da izražavaju hibridne receptore među vrstama. Struje izazvane ACh značajno su smanjene nakon inkubacije BAPTA-AM, što ukazuje na snažan doprinos JaClCa na početni odgovor, a time i u flux Ca 2+ kroz štakorski 㬙/pileći 𻄐 hibridni receptor (slika 1 C). Postotak odgovora preostalog nakon tretmana BAPTA -om za ovaj međuvrsni hibrid (21,8 ± 8,2%, n = 5 dopunska tablica S1, Dodatni materijal na Internetu) bila je slična onoj opaženoj s receptorima za štakore 㬙 𻄐 (P = 0,3329 sl. 1 A i dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Nasuprot tome, ACh odgovori pilećeg 㬙/štakora 𻄐 hibridnog receptora ostali su nepromijenjeni nakon BAPTA-AM inkubacije (103,4 ± 20,0%, n = 7 sl. 1 C), slično ponašanju receptora za piletinu 㬙 𻄐 (slika 1 A i dodatna tablica S1, Dodatni materijal na mreži), koja ukazuje na nizak priljev kalcija.

Konfiguracija naponske stezaljke s dvije elektrode omogućuje nam primjenu rampe napona na oocite koji izražavaju nAChRs, mjerenje struje kroz aktivirane kanale pri različitim potencijalima zadržavanja, a zatim iscrtavanje krivulja struje/napona (I –V). 㬙 𻄐 receptori su nespecifični kationski kanali, propusni za Na +, K + i Ca 2+, u fiziološkim uvjetima. Kako bismo procijenili relativnu Ca 2+ propusnost rekombinantnih receptora, izmjerili smo obratni potencijal (Erev) u funkciji izvanstanične koncentracije Ca 2+ (0,2 𠄵 mM) i uklopio je podatke u proširenu Goldmanovu –Hodgkin –Katz (GHK) jednadžbu. Erev je potencijal nulte struje na slici 2, na primjer, potencijal pri kojem struja mijenja znak. Na E će utjecati samo promjene u izvanstaničnoj koncentraciji prožimajućih ionarev. Za homomerni štakorski 㬙 receptor, Erev pokazala je ovisnost o izvanstaničnom kalciju sličnu onoj kod heterometrijskih receptora za štakore 㬙 𻄐 (slika 2 A lijevu ploču i B umetci prikazuju zum u blizini slova Erev za 0,5 i 5 mM Ca2+). U skladu s tim, uklapanje ovih podataka u proširenu GHK jednadžbu dalo je visoki omjer propusnosti kalcija (pCa/pNa, 6,1 ± 1,2, n = 4), poput receptora štakora 㬙 𻄐 (7,9 ± 0,6, n = 11 P = 0,1820 dopunska tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Obrnuto, vrijednost pCa/pNa za pileći 㬙 receptor (2,6 ± 0,3, n = 12) bilo je slično onom dobivenom za pileći 㬙 𻄐 receptor (2.3 ± 0.3, n = 9 P = 0,5098 sl. 2 A središnja ploča i B dopunska tablica S1, Dodatni materijal na mreži), ali više od tri puta niža od one štakora 㬙 𻄐 (P < 0,0001 dopunska tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Konačno, homomerni receptor pilećeg 𻄐 imao je visok pCa/pNa (6,9 ± 1,0, n = 8), slično onom kod receptora za štakore 㬙 𻄐 (P = 0,3907 sl. 2 A desnu ploču i B dopunska tablica S1, Dodatni materijal na mreži). Slika 2 C prikazuje reprezentativne I –V krivulje za štakorske 㬙/pileće##x003b110 hibridne receptore i sliku 2 D, Erev kao funkcija koncentracije izvanstaničnog kalcija. U skladu s rezultatima dobivenim procjenom aktivacije JaClCa ( Sl. 1 C), hibrid štakora i#x003b19/piletine 𻄐 imao je visok pCa/pNa (9,0 ± 1,0, n = 7), slično onom kod receptora za štakore 㬙 𻄐 (P = 0.3013 dopunska tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Dakle, pileća podjedinica nema odrednica sposobnih utjecati na propusnost kalcija receptora 㬙 𻄐.

Homomerni i hibridni receptori imaju različitu relativnu propusnost kalcija. (A) Reprezentativne krivulje I –V dobivene primjenom naponskih rampi (� do +50 mV, 2 s) na platou odgovora na 100 μM ACh u oocitima superfuziranim otopinama na bazi NMG + koje sadrže različite Ca 2+ koncentracije (0,5 mM, sivo i 5 mM, crno) za jajne stanice koje izražavaju nAChRs štakorske 㬙 (gore lijevo), pileće 㬙 (gornja srednja) ili pileća 𻄐 (gore desno). Umetci: Povećanje u blizini slova Erev. (B) Zemljište Erev vrijednosti u funkciji izvanstanične koncentracije Ca 2+ za štakorske 㬙, pileće 㬙 i pileće 𻄐 homomerne nAChR. Erev vrijednosti za štakore 㬙 𻄐 (crveno) i piletinu 㬙 𻄐 (plavo) prikazane su za usporedbu. Vrijednosti su srednje ± SEM od 4 � pokusa po skupini. Pune linije odgovaraju GHK jednadžbi (vidi Materijali i metode). (C) Idem kao u (A) za oocite koji eksprimiraju štakorske 㬙/pileće##x003b110 hibridne nAChR. (D) Idem kao u (B) za štakorski 㬙/pileći 𻄐 hibridni nAChR.

Slika 3 sažima zaključke izvedene iz gornjih pokusa: Kad god receptor ima štakorsku podjedinicu (crveni krug), bilo homomernu, heteromerijsku ili hibridnu, aktivacija JaClCa je visok (smanjen postotak odgovora nakon BAPTA -e, slika 3 A) pa je relativna propusnost kalcija velika (slika 3 B). Naprotiv, kad god receptor sadrži pileću podjedinicu (plavi krug), aktiviranje JaClCa je niska (slika 3 A) pa je relativna propusnost kalcija niska (slika 3 B). Stoga visoka relativna propusnost kalcija nikotinskog receptora sisavaca rezultira iz molekularnih determinanti prisutnih u podjedinici 㬙, a ne iz podjedinice 𻄐, kako je ranije sugerirala analiza maksimalne vjerojatnosti pozitivne selekcije na temelju kodona (Franchini i Elgoyhen 2006. Lipovšek i sur. 2012.).

Podjedinica 㬙 nAChR definira opseg propusnosti kalcija receptora 㬙 𻄐. (A) Postotni odgovor na 100 μM ACh nakon 3-satne inkubacije s brzim kalcijevim kelatorom BAPTA-AM za heteromerne, homomerne i hibridne nAChR. Postotak početnog odgovora preostalog nakon inkubacije BAPTA određen je za svaki oocit pojedinačno, a zatim je prosječan za svaki receptor. Vrijednosti su srednje ± SEM. (B) Relativna propusnost kalcija (pCa/pNa) prema mjerenju Erev podaci, kao funkcija izvanstanične koncentracije kalcija, u jednadžbu GHK proširenu na dvovalentne katione. Vrijednosti su srednje ± SEM. Imajte na umu da je kad god je prisutna podjedinica štakora##x003b19 propusnost kalcija velika, a kad god je prisutna podjedinica piletine#propusnost kalcija je niska.

Molekularna evolucija podjedinica sisavaca 㬙

Pokusi opisani u prvom odjeljku dodjeljuju razlike u opsegu propusnosti kalcija receptora 㬙 𻄐 za podjedinicu 㬙. Međutim, prethodna analiza provedena na kodirajućim nizovima 㬙 od 13 vrsta kralježnjaka nije pronašla dokaze pozitivne selekcije u bilo kojoj regiji proteina 㬙 ili u bilo kojoj lozi filogenije kralježnjaka (Franchini i Elgoyhen 2006). Sada proširujemo ovu analizu na kodirajuće sekvence 㬙 podjedinica iz 52 vrste kralježnjaka, uključujući relevantno dodavanje šest vrsta ptica/gmazova. Poravnanje na dopunskoj slici S1, Dopunski materijal na mreži, prikazuje sve postojeće sekvence korištene u analizi pristupni brojevi navedene u dodatnoj tablici S2, Dodatni materijal na mreži. Proveli smo test pozitivne selekcije na grani, koji otkriva prisutnost mjesta pod pozitivnom selekcijom unutar datog gena u specifičnim lozama filogenije (Yang i Nielsen 2002, Zhang i sur. 2005). Loze sisavaca, euterijanaca i sauropsida korištene su kao grane u prvom planu u odvojenim analizama. Kao što je prikazano u tablici 1, nismo pronašli statistički značajne dokaze o pozitivnoj selekciji na kodirajućoj sekvenci podjedinice 㬙. Bez obzira na to, budući da funkcionalne studije nedvosmisleno ukazuju na to da su razlike u propusnosti kalcija određene podjedinicom 㬙, to bi se moglo potvrditi malim brojem aminokiselinskih razlika uočenih među lozama i koje nisu otkrivene analizama pozitivne selekcije.

Stol 1.

Procjene vrijednosti vjerojatnosti za modele grana i nulte hipoteze.

Modeli grana web mjestaVjerojatnost dnevnikaLRTP(χ 2 1)
Sisari
       Podružnica�,543.1773310.0089440.9246
       Nučna hipoteza�,543.186275
Eutheria
       Podružnica�,546.5292180.1122040.7376
       Nučna hipoteza�,546.641422
Sauropsida
       Podružnica�,548.67749201
       Nula hipoteza�,548.677494

NAPOMENA. —Testovi pozitivne evolucije na grani provedeni su odvojeno tri puta koristeći sisavce (Sisavci), placentne sisavce (Eutheria) i ptice/gmazove (Sauropsida) kao prednju liniju. LRT = 2 × (u LHA − u LH0). HA, model podružnice H0, nulta hipoteza ln L, vjerojatnost dnevnika.

Kako bismo unaprijedili naš uvid u evolucijsku povijest kodirajućih podjedinica 㬙 podjedinica i njihov ograničen broj nesinonimnih zamjena po lozama, izvršili smo rekonstrukciju predaka za sve čvorove filogenije prikazane na dopunskoj slici S2, Dopunski materijal na mreži . Naš je cilj bio odrediti pojavu zamjena aminokiselina specifičnih za svaku veliku skupinu. Poravnanje dodatne slike S1, Dopunski materijal na mreži, prikazuje sve postojeće sekvence korištene u analizi, zajedno s predviđenim nizovima predaka glavnih čvorova.

Sve u svemu, primijećen je veći stupanj odstupanja od zajedničkog pretka amniota za sisavce nego za sauropsidnu (ptice i gmazovi) lozu (vidi i duljine grana na dodatnoj slici S2, Dopunski materijal na mreži). Pomno ispitivanje poravnanja postojećih sekvenci i onih predviđenih za glavne čvorove pokazalo je da su, uspoređujući sekvence sisavaca sa sauropsidom 㬙 aminokiselinskih sekvenci, obje granaju od prednjeg amniota, 42 mjesta pokazale nesinonimne grane specifične zamjene (istaknute u poravnanje). Dopunska tablica S3, Dopunski materijal na mreži, prikazuje stanje karaktera i njegovu odgovarajuću marginalnu stražnju vjerojatnost za svako od ovih mjesta za sve glavne čvorove filogenije i reprezentativne vrste svake skupine. Slika 4 A sažima evolucijsku povijest ovih mjesta, prikazujući samo ostatke koji odgovaraju postojećim nizovima štakora i kokoši 㬙, predviđene sekvence predaka za njihove odgovarajuće skupine (Eutheria i Diapsida), te predviđeni slijed predaka zajedničkih amniota i#x003b19. Slijed predaka amniota dijelio je 36 od ovih 42 aminokiseline s lozom diapsida (i sauropsida). S druge strane, dijelio je samo šest aminokiselina s euterijom (pet s boreoeuterijom) (slika 4 A). Uočena asimetrija divergencije sekvenci nakon odvajanja od amniota predaka sugerira da bi visoka propusnost kalcija uočena na receptorima sisavaca 㬙 𻄐 mogla biti divergentno stanje karaktera, odnosno da bi receptor amnijta 㬙 𻄐 mogao imati imao nisku propusnost kalcija. Da je to slučaj, neke od nesinonimnih zamjena koje su se akumulirale tijekom evolucijske povijesti loze sisavaca trebale bi podariti visoku propusnost kalcija uočenu u receptorima 㬙 𻄐 postojećih sisavaca.

Rekonstrukcija sekvenci predaka dodjeljuje nesinonimne zamjene lozi sisavaca. (A) Ostaci aminokiselina prisutni na 42 klade specifična mjesta za postojeće sekvence štakora i kokoši i euteriju, diapsidu i amniot predviđene sekvence predaka i#x003b19. Crveni, sisavački ostatak plav, sauropsidni ostatak zelen, tetrapodni ostatak. Imajte na umu da većina ostataka prisutnih u predviđenom slijedu amniota predaka odgovara ostacima sauropsida. (B) Struktura Torpedo kalifornica nAChR (2bg9 Unwin 2005), plavom bojom, prikazuje homologno mjesto mjesta koja predstavljaju nesinonimne supstitucije specifične za kladu, a pozicionirana su uz put ionske vodljivosti. Mjesta specifična za kladu K433, L435, K436, T441, N442, S443 i S446 MA α-spirale također su označena plavom bojom. Dvije podjedinice su uklonjene radi boljeg pregleda kanala. Transmembranska domena 2 α-spirala obložena porama označena je ružičastom bojom. (C) Shematska filogenija koja prikazuje evolucijsku povijest šest mjesta analiziranih mutagenezom usmjerenom na mjesto: 110 i 127 u izvanstaničnom predvorju te 24 ′, 11 ′, 7 ′ i 𢄤 ′ na, ili s bočne strane TM2 domena (numeriranje štakora 㬙 i Miller 1989.). Za svako mjesto prikazano je stanje karaktera (aminokiselina) i stražnja vjerojatnost marginalne rekonstrukcije. Crveni, sisavački ostatak plavi, sauropsidni ostatak bijeli, ostatak prisutan samo u monotremovima.

Tri supstitucije aminokiselina specifične za sisavce daju visoku propusnost kalcija za sisavce 㬙 𻄐 nAChR

Kako bismo utvrdili koja je od 37 nesinonimnih supstitucija stečenih tijekom evolucijske povijesti podjedinica sisavaca 㬙 odgovorna za rezultirajuće povećanje propusnosti kalcija, prvo smo izdvojili one različite ostatke koji se nalaze u regijama receptora za koje je poznato da utječu na selektivnost iona ( označeno plavom bojom na slici 4 B). Dva ostatka nalaze se u izvanstaničnom predvorju (D110 i S127), četiri na domeni oblaganja pora TM2 (ili uz nju), (A264 (-4 ′), I275 (7 ′), M279 (11 ′) i A292 (D) 24 ′)), dok je preostalih sedam ostataka (K433, L435, K436, T441, N442, S443 i S446) u membrani povezanoj (MA) α-spirali unutarstanične domene (numeriranje štakora 㬙 & #x02014i za domenu TM2, numeriranje nakon Millera [1989]). Filogenija na slici 4 C prikazuje evolucijsku povijest šest mjesta smještenih na izvanstaničnoj i TM2 domeni, jasno ilustrirajući da su nesinonimne zamjene isključivo za lozu sisavaca.

Kako bi se ispitao učinak na propusnost kalcija nesinonimnih supstitucija specifičnih za granu sisavaca smještenih u izvanstaničnim i transmembranskim domenama, svaka aminokiselina prisutna na podjedinici štakora##x003b19 preokrenuta je u odgovarajući ostatak na predviđenoj podjedinici amniota predaka. Kako bismo procijenili učinak svih supstitucija na koje se dolazi u visoko varijabilnoj unutarstaničnoj domeni, uključujući sedam supstitucija specifičnih za kladu smještenih u konzerviranijoj MA α-spirali, konstruirali smo himernu podjedinicu u kojoj je cijela unutarstanična domena štakora i Podjedinica#x003b19 zamijenjena je unutarstaničnom domenom pileće 㬙 podjedinice. Podjedinice mutanata ili himernih štakora 㬙 su koinjektirane sa podjedinicom štakora divljeg tipa. Propusnost kalcija procijenjena je, kao i prije, analizom aktivacije oocita. JaClCa (slika 5 A i dodatna tablica S1, Dodatni materijal na mreži) i određivanjem relativne propusnosti kalcija (pCa/pNa slika 5 B i dodatna sl. S3, Dodatni materijal na mreži).

Mutacije u izvanstaničnom predvorju i izlaz iz pore kanala mijenjaju propusnost kalcija receptora štakora 㬙 𻄐. (A) Reprezentativni tragovi odgovora izazvanih 100 μM ACh u oocitima koji eksprimiraju štakorske 㬙 𻄐 pojedinačne mutantne receptore: štakor �N 𻄐 (lijeva ploča), štakor 㬙S127F 𻄐 (srednja ploča i #x003b19 A-4 𠌭 𻄐 (desna ploča), prije (lijevi 𠅌rni trag) i nakon (desni — sivi trag) 3-satna inkubacija s brzim kelatorom kalcija BAPTA-AM (Vdržati = � mV [Ca 2+]izvanstanični = 1,8 mM). Tragovi su reprezentativni za n = 4 𠄶 po grupi. (B) Zemljište Erev vrijednosti kao funkcija izvanstanične koncentracije Ca 2+ za štakora �N 𻄐 (lijeva ploča), štakora 㬙S127F 𻄐 (srednja ploča) i štakora 㬙 A-4 𠌭 𻄐 (desna ploča) pojedinačno mutantni receptori. Erev vrijednosti za štakore 㬙 𻄐 (crveno) i piletinu 㬙 𻄐 (plavo) prikazane su za usporedbu. Vrijednosti su srednje ± SEM od 5 � eksperimenata po skupini. Pune linije odgovaraju GHK jednadžbi (vidi Materijali i metode).

Štakorski mutantski receptor koji nosi supstituciju D110N, smješten na izvanstaničnom predvorju, aktivirao je oocite. JaClCa u manjoj mjeri (59,8 ± 11,9% preostale struje nakon tretmana BAPTA, n = 6 sl. 5 A lijeva ploča i dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži) nego što je to bio slučaj pacova 㬙 𻄐 divljeg tipa (14,8 ± 3,1%, n = 12, P = 0,0002 sl. 1 A i dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži), koja ukazuje na smanjenje priljeva kalcija. Ova zamjena također je smanjila relativnu propusnost kalcija mutantnog receptora (5,5 ± 0,3, n = 7 sl. 5 B lijeva ploča i dodatna tablica S1, Dodatni materijal na mreži), u usporedbi s receptorima za štakore divljeg tipa 㬙 𻄐 (7,9 ± 0,6, n = 11, P = 0,0206). Zamjena S127F također je dovela do značajnog smanjenja priljeva kalcija (49,4 ± 8,4% preostale struje nakon BAPTA, n = 5, P = 0,0002 sl. 5 A srednja i dopunska tablica S1, Dopunski materijal na mreži) i značajno smanjenje pCa/pNa (5,4 ± 0,4, n = 5, P = 0,0408 sl. 5 B srednji i dopunski S1, dopunski materijal na mreži), u usporedbi s receptorima za štakore divljeg tipa 㬙 𻄐. Ovi rezultati ukazuju da ova dva ostatka smještena u predvorju receptora, dalje od pora kanala, doprinose selektivnosti za dvovalentne nasuprot monovalentnim kationima u štakorskom receptoru.

Kako bismo dalje analizirali međusobno li ti ostaci predvorja u interakciji s prolazećim ionima kalcija, izveli smo MD simulaciju na homološkom modelu receptora štakora. Primijenili smo vektor sile na hidratizirani ion kalcija i izmjerili takvu silu kad je kalcij gurnut u predvorje. Povećanje amplitude sile potrebno da bi se kalcij pomaknuo dublje u kanal, kako vrijeme simulacije odmiče, pokazatelj je jačine njegove interakcije s ostacima predvorja. Slika 6 A prikazuje prikaz sile povezane s prolaskom kalcija kroz kanal u funkciji vremena simulacije (1,25 ns — pet ponavljanja). Vrhovi (crvene strelice pri 0,1, 0,7 i 1,1 ns) ukazuju na simulacijska vremena u kojima kalcij jače stupa u interakciju s određenim ostacima unutar predvorja. Dakle, dok prelazi izvanstanični predvorje, kalcijev ion najprije stupa u interakciju s ostacima D110 i E129 podjedinice 㬙 (slika 6 B, pri 0,1 ns) i ostaci F39 i Y42 podjedinice 𻄐 (svi su numerirani nakon štakora 㬙). Zatim stupa u interakciju s ostacima D124/D125 podjedinice 㬙 (slika 6 C, pri 0,7 ns). Konačno, kalcijev ion stupa u interakciju s brojnim visoko očuvanim ostacima koji se nalaze na ušću pore kanala: ostatci E294 podjedinica 㬙 i 𻄐, smješteni u odgovarajućim TM2 –TM3 petljama, te ostaci N74 iz & #x003b19 podjedinica i D71 i N74 podjedinice 𻄐, smještene u odgovarajućim 㬡 – 㬢 petljama (slika 6 D, pri 1,1 ns). Dakle, ovi dokazi pokazuju izravnu interakciju ostatka D110 s kalcijem koji prožima. Osim toga, pozicionira ostatak S127 između dva uzastopna mjesta interakcije, E129 i D124/D125, označavajući važnost dviju specifičnih supstitucija sisavaca, smještenih na receptorskom predvorju, na mehanizmu prožimanja kalcija.

MD simulacija prikazuje interakciju kalcija s ostacima u izvanstaničnom predvorju. (A) Sila povezana s prolaskom hidratiziranog kalcija kroz predvorje kanala, u funkciji vremena simulacije. Crvene strelice označavaju vrhove sila koji označavaju interakcije s ostacima kanala u različitim vremenima duž putanje. (B 𠄽) Struktura homolognog modela štakorskog receptora za##x003b19 𻄐 koji prikazuje prolaz iona kalcija (ljubičaste boje) kroz predvorje kanala u različito vrijeme simulacije. Ostaci D110 i S127, analizirani mutagenezom usmjerenom na mjesto, označeni su svijetloplavom bojom. Ostali ostaci u interakciji s kalcijevim ionima označeni su žutom (㬙 podjedinica) i zelenom (𻄐 podjedinica). Tamnosive, 㬙 podjedinice svijetlosive, 𻄐 podjedinice. Dvije 𻄐 podjedinice i molekule vode uklonjene su radi boljeg pregleda predvorja. Krupni plan interakcija prikazan je u srednjim pločama. Isprekidane plave linije ukazuju na interakcije kalcijevog iona s ostacima kanala, odgovarajuće udaljenosti interakcije prikazane su zajedno u Å. (B) 0,1 ns: kalcij stupa u interakciju s ostacima D110 i E129 podjedinice 㬙 i s ostacima F38 i Y41 jedne od uklonjenih 𻄐 podjedinica. (C) 0,7 ns: kalcij stupa u interakciju s D124 i D125 podjedinice 㬙. (D) 1,1 ns: kalcij stupa u interakciju s ostacima E294 podjedinice 㬙 i E293 podjedinice 𻄐, koja se nalazi u odgovarajućim petljama TM2 –TM3, te s ostacima N74 podjedinice 㬙 i D70 i N73 iz & #x003b110 podjedinica, smještena u odgovarajućim 㬡 – 㬢 petljama.

Prilikom razmatranja ostataka koji se nalaze na ili blizu domene obloge TM2 pore receptora štakora 㬙 𻄐, niti supstitucije A24 ′P, I7 ′V niti M11 ′L nisu imale značajan utjecaj ni na aktivaciju oocita ’s JaClCa ili relativnu propusnost kalcija (pCa/pNa) (dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži i slika S3). Nasuprot tome, supstitucija A-4 𠌭, smještena u unutarstaničnom prstenu nabijenih ostataka (Imoto i sur. 1988), dovela je do značajnog smanjenja aktivacije oocita. JaClCa (59,5 ± 5,9% struje preostale nakon tretmana BAPTA, n = 4 sl. 5 A desna i dopunska tablica S1, Dopunski materijal na mreži), u usporedbi s pacovskim 㬙 𻄐 uzorkom divljeg tipa (14,8 ± 3,1%, n = 12, P < 0.0001 sl. 1 A i dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Sukladno tome, zamjena A-4 𠌭 također je dovela do značajnog smanjenja relativne propusnosti kalcija (4,8 ± 0,3, n = 11 sl. 5 B desna ploča i dodatna tablica S1, Dodatni materijal na mreži), u usporedbi s štakorskim 㬙 𻄐 receptorom divljeg tipa (7,9 ± 0,6, n = 11, P = 0,0002). Konačno, potpuna izmjena unutarstanične domene, koja obuhvaća sedam supstitucija MA α-heliksa specifičnih za kladu, kako bi štakorski 㬙 (IC-pileći 㬙) 𻄐 himerijski receptor bio bez učinka, relativna propusnost kalcija (dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži i slika S3).

Ukratko, samo su supstitucije D110N, S127F i A-4 𠌭 smanjile propusnost kalcija za štakore 㬙 𻄐 receptora za divlji tip, iako ništa do pune mjere niske propusnosti kalcija uočene za piletinu 㬙 & #x003b110 nAChR. Stoga smo naknadno uključili sve tri supstitucije u podjedinicu štakora 㬙. Ovaj trostruki mutantni štakorski receptor pokazao je nizak priljev kalcija (100,5 ± 13,9% preostale struje nakon BAPTA, n = 6 sl. 7 A i dodatna tablica S1, Dodatni materijal na Internetu), slično onoj koja je primijećena za pileći 㬙 𻄐 nAChR (P = 0,9924). Sukladno tome, prisutnost sve tri supstitucije smanjila je gotovo 3 puta relativnu propusnost kalcija za pacovske 㬙 𻄐 trostruki mutirani nAChR na vrijednost pCa/pNa (3.2 ± 0.4 n = 7) usporedivo s onima pilećeg kolege (2,3 ± 0,3, n = 9, P = 0,0541 sl. 7 B i dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Ovi rezultati ukupno pokazuju da je pojava samo tri nesinonimne supstitucije unutar podjedinice 㬙 bila dovoljna za povećanje propusnosti kalcija receptora sisavaca 㬙 𻄐, evolucijski događaj koji se dogodio nakon odvajanja od pretka amniota.

Pacovski 㬙N110D/S127F/A-4 𠌭 𻄐 trostruki mutant pokazuje nisku propusnost kalcija sličnu pticama. (A) Reprezentativni tragovi odgovora izazvanih 100 μM ACh u oocitima koji izražavaju štakorov 㬙N110D/S127F/A-4 𠌭 𻄐 trostruki mutantni receptor, prije (lijevi 𠅌rni trag) i poslije (desni —gramov trag) 3-satna inkubacija s brzim kelatorom kalcija BAPTA-AM (Vdržati = � mV [Ca 2+]izvanstanični = 1,8 mM). Tragovi su reprezentativni za n = 6. (B) Zemljište Erev vrijednosti u ovisnosti o izvanstaničnoj koncentraciji Ca 2+ za trostruki mutantni receptor štakora. Erev vrijednosti za štakore 㬙 𻄐 (crveno) i piletinu 㬙 𻄐 (plavo) prikazane su za usporedbu. Vrijednosti su srednje ± SEM od 7 � pokusa po skupini. Pune linije odgovaraju GHK jednadžbi (vidi Materijali i metode).

Povećanje propusnosti kalcija isključuje isključivo lozu sisavaca

Tri aminokiseline identificirane kao determinante povećanja propusnosti kalcija za receptore sisavaca 㬙 𻄐 predstavljaju nesinonimne supstitucije, koje su ekskluzivne za sisavce. Zatim smo pitali može li uvođenje ovih aminokiselina u podjedinicu piletine 㬙 dovesti do visokopropusnog pilećeg 㬙 𻄐 receptora. Sukladno tome, mutirali smo svaki od tri aminokiselinska ostatka u podjedinici piletine 㬙 na odgovarajući ostatak prisutan u podjedinicama sisavaca 㬙 i eksprimirali mutantne receptore s podjedinicom piletine divljeg tipa.

Zamjene N110D i F127S u izvanstaničnom predvorju nisu promijenile relativnu propusnost kalcija, kada su mutirale pojedinačno (slika 8 A i dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži). Zamjena D-4 𠌪 proizvela je značajno povećanje relativne propusnosti kalcija (pCa/pNa: 3,7 ± 0,4, n = 11 sl. 8 B i dodatna tablica S1, Dopunski materijal na mreži), u usporedbi s receptorom za piletinu divljeg tipa 㬙 𻄐 (2.3 ± 0.3, n = 9, P = 0,0070). Kada su N110D i F127S ugrađeni zajedno sa supstitucijom D-4 𠌪, relativna propusnost kalcija prema monovalentnoj nije se razlikovala od one u pilećeg receptora divljeg tipa (pCa/pNa = 2,7 ± 0,3, n = 6 P = 0,3238 sl. 8 B). Ovi rezultati ukazuju na to da uvođenje supstitucija specifičnih za sisavce u kontekstu receptora za piletinu 㬙 𻄐 ne reproducira visoku propusnost kalcija opisanu za receptore sisavaca 㬙 𻄐, te dodatno podupire zaključak da je povećani kalcij propusnost 㬙 𻄐 nAChR-a događaj je specifičan za sisavce.

Mutacije specifične za sisavce ne povećavaju propusnost kalcija receptora piletine 㬙 𻄐. Zemljište Erev vrijednosti u funkciji izvanstanične koncentracije Ca 2+ za pileće 㬙N110D 𻄐 i pileće �SF 𻄐 vanćelijske vestibule mutante (A) i pileći 𻆝-4 𠌪 𻄐 TM1 –TM2 mutant petlje i piletina �N/F127S/D-4 𠌪 𻄐 trostruki mutantni receptor (B). Erev vrijednosti za štakore 㬙 𻄐 (crveno) i piletinu 㬙 𻄐 (plavo) prikazane su za usporedbu. Vrijednosti su srednje ± SEM od 5 � eksperimenata po skupini. Pune linije odgovaraju GHK jednadžbi (vidi Materijali i metode).

Kako bismo dalje istražili vjerojatni temeljni mehanizam za ovo paradoksalno opažanje, generirali smo homološke modele za štakore i piletine 㬙 𻄐 divljeg tipa i mutirane receptore na položajima 110, 127 i 4 ′ te proveli analizu elektrostatičkog potencijal vestibula kanala. Slika 9 A prikazuje štakorski 㬙 𻄐 receptor divljeg tipa, kao primjer zasjenjen sivom bojom je elektrostatički potencijal uzdužne ravnine koja presijeca usred sagitalnog dijela kroz receptor (položaj ravnine prikazan je u zakrenutom gornjem pogledu receptora u lijeva ploča). Vrijednosti potencijala mjerene su duž središnjeg dijela Z osi (isprekidana linija na slici 9 A) i prikazani su za sva četiri receptora na slici 9 B. U neposrednoj blizini mutacija (ljubičaste zvjezdice) primijetili smo samo male izmjene elektrostatičkog potencijala, iako očekivanog predznaka, na primjer, promjenu negativnog D110 i polarnog S127 podjedinice štakora za#i x x hidrofobni F, rezultirao je manje negativnim potencijalom, dok su suprotne promjene unutar podjedinice piletine izazvale obrnuti učinak. Primjetno je da su ove mutacije imale snažniji dugoročni učinak na elektrostatički potencijal u najdubljem dijelu predvorja, neposredno prije ulaska u transmembransko područje (TM), područje koje odgovara trećem mjestu interakcije kalcija, pri 1,1 ns simulacije vrijeme, kako je opisano u simulacijama MD (vidi sliku 6). Dakle, u slučaju štakora 㬙 𻄐 receptora, prisutnost zamjena D110N i S127F smanjila je elektrostatički potencijal u ovom dubokom području predvorja, u mjeri sličnoj onoj kod piletine divljeg tipa 㬙 & #x003b110 receptor u skladu s predviđenim i uočenim smanjenjem propusnosti kalcija. Naprotiv, obrnute zamjene, N110D i F127S, na receptoru piletine 㬙 𻄐 nisu približile elektrostatički potencijal manje elektronegativnom potencijalu uočenom za receptore divljeg tipa štakora, već dalje, u skladu sa nedostatak povećanja propusnosti kalcija uočen za mutantski pileći 㬙 𻄐 receptor. Ovo nadalje podupire zaključak da je nakupljanje nesinonimnih supstitucija unutar podjedinice 㬙 koje utječu na propusnost kalcija specifičan događaj za sisavce.

Homološko modeliranje pokazuje da supstitucije točkastih aminokiselina u izvanstaničnoj domeni imaju dugoročne učinke na elektrostatički potencijal. (A) Homološki model štakora 㬙 𻄐 receptora divljeg tipa koji pokazuje, u sivoj ljestvici, elektrostatički potencijal u uzdužnoj ravnini u sredini sagitalnog prema predvorju. Položaj ravnine prikazan je na gornjem dijelu receptora (lijeva ploča). Prikazane su samo podjedinice u ravnini presjeka. Isprekidana crna linija označava položaj središnjice Z os. Isprekidane svijetloplave linije označavaju mjesto tri mjesta interakcije kalcija koje odgovaraju vremenu simulacije od 0,1 -, 0,7 -i 1,1 ns, kako je prikazano na slici 6. Položaj dviju proučavanih zamjena aminokiselina označen je ljubičastim zvjezdicama. (B) Elektrostatički potencijal određen u središtu Z os za štakore i piletinu 㬙 𻄐 receptore divljeg tipa i mutanta, koji se protežu cijelom duljinom predvorja. Ljubičaste zvjezdice označavaju mjesto supstituiranih ostataka 110 i 127.


6. Rasprava

Izvorna rxd paket proširilo višeslojno modeliranje u NEURON -u iz elektrofizioloških ljestvica neurita, stanica i mreža u kemofiziološke ljestvice bodlji, podstaničnih organela, interaktomike, metabolomike, proteomike. Ovaj daljnji razvoj modula u domenu izvanstaničnog prostora značajno proširuje opseg kemofiziologije na velike udaljenosti interneuronskog prostora. Računske performanse za ovaj veliki problem poboljšane su upotrebom višestruke niti paralelizacije DG-ADI algoritma za difuziju, višeprocesorske paralelizacije za elektrofiziologiju i JIT kompilacijom reakcija. Implementacija ECS modula provjerena je prema analitičkom rješenju, testu očuvanja i usporedbom s uspostavljenim simulatorom.

Proširenje na simulaciju cijelog organa u mozgu osobito je važno za razvoj multiscale modeliranja za kliničke primjene (Hunt i sur., 2018. Mulugeta i sur., 2018.).U prošlosti su velike neuronske simulacije obično bile neuronske mreže koje su usredotočene isključivo na električnu aktivnost neurona i njihov međusobni utjecaj putem kemijskih i električnih sinapsi. Takve simulacije neuronskih mreža učinkovito su djelovale u vakuumu, izostavljajući učinke nesinaptičkih neuromodulatora, neuromodulacijskih plinova, iona, glije, metabolita itd. Ova fiziološka sredstva također imaju patofiziološke uloge, na primjer prekomjerne koncentracije iona uočene u širenju depresije, a nedostatak metabolita koji uzrokuje oštećenje tkiva zbog ishemije i moždanog udara. Farmakološka sredstva koja se koriste u liječenju također se emitiraju difuzno, kao i agensi i učinci povezani s mikroglijom. Mehanički čimbenici od traume mozga i struje u električnoj stimulaciji slijede njihove granice impedancije tkiva. Mnogi patološki poremećaji, osobito moždani udar i traumatska ozljeda mozga, uključuju velike količine tkiva. Iz tog razloga, početni razvoj našeg novog proširenja bio je usredotočen na grubu prostornu diskretizaciju kako bi se prilagodile velikim udaljenostima, dopuštajući da reprezentativne neuronske mreže budu zasijane u mozaik mjesta unutar volumena.

6.1. Pristup prosjeka velikih količina

Elektrofiziološki modeli u NEURON -u mogu specificirati struje u apsolutnim izrazima ili kao gustoće struje. U potonjem slučaju, površina membrane mora se koristiti za izračun struje. ECS rxd Modul identificira ionski tok iz struja, koje se zatim smještaju u odgovarajući voksel simulacije ECS -a. Makroskopska mjera difuzije iona u masovnom tkivu promatrana eksperimentalno pomoću senzora za odabir iona, biosenzora i cikličke voltametrije brzog skeniranja može se koristiti za ograničavanje parametara (Budygin i sur., 2000 Dale i sur., 2005 Nicholson i Hrab ětov á, 2017.).

Trenutno podržavamo dva granična uvjeta: Neumannove rubne uvjete (konstantni granični tok) i Dirichletov uvjet (konstantna granična koncentracija). Neumannovi granični uvjeti prikladni su za in-vivo modeli u kojima simuliramo dio mozga u kontinuitetu s drugim sličnim dijelovima mozga. U tom bi slučaju svaka tvar koja napusti simulirani prostor zamijenjena tvari iz susjednih regija. Obrnuto, Dirichletovi uvjeti (konstantna granica) prikladni su ako modelirano područje nije reprezentativno, što se događa u patološkim uvjetima kao što je područje jezgre moždanog udara. U ovom slučaju očekuje se da će se poremećaji u izvanstaničnim koncentracijama vratiti dovoljno daleko od izvora. U oba slučaja, klirens se još uvijek može modelirati pomoću NEURON modela ili izvanstaničnih reakcija za predstavljanje transporta kroz krvno-moždanu barijeru. Ako je ECS dovoljno velik u odnosu na trajanje simulacije, izbor graničnih uvjeta neće imati značajan utjecaj na rezultate.

6.2. Višestruka uporaba simulacije izvanstanične reakcije-difuzije

Postoje mnogi oblici izvanstanične ekstra-sinaptičke signalizacije između stanica. Ovdje smo ilustrirali korisnost modula jednostavnim modelom za širenje depresije, gdje je “signal ” promjena koncentracije iona. Izvanstanični rxd Modul ima širok raspon potencijalnih primjena koje prate različite tvari fiziološke i patološke važnosti. Na primjer, neurotoksične tvari poput slobodnih radikala difundiraju dalje od područja oštećenog tkiva amiloida-β oligomera mogu se difundirati dalje od specifičnih stanica stvarajući pogrešno savijanje proteina u udaljenim stanicama (Waters, 2010). I sinaptičko prelijevanje i nesinaptičko oslobađanje osiguravaju širenje neurotransmitera (npr. Glutamata i ekscitotoksičnosti), te neuromodulatora: dopamina, acetilkolina, norepinefrina, adenozina itd. Na primjer, dopamin (DA) u strijatu se oslobađa aksonalnim projekcijama iz srednjeg mozga i širi se u lokalnoj regiji prije ponovnog preuzimanja DA transporterom (Sulzer i sur., 2016). Modeli strijatalne aktivnosti u fiziološkim (Humphries i sur., 2010.) ili patološkim stanjima (Migliore i sur., 2008. Blackwell i sur., 2018.) imali bi koristi uključivanjem ovog izvanstaničnog širenja dopamina. Simulacija izvanstaničnog dopamina slijedila bi isti postupak opisan u odjeljku 3.1 koji specificira regiju s tortuoznošću i poroznošću, vrstu s njezinim koeficijentom difuzije i rubnim uvjetima te reakcije koje je uklanjaju iz ECS -a, uključujući kinetiku transportera DA.

6.3. Budući razvoj

Ovdje razvijena simulacija ECS -a pružit će najširu prostornu ljestvicu za buduće modele s više razmjera koji će dodati dodatne metode u manjim razmjerima. Ove više metoda će se međusobno povezati kako bi se koristile zajedno u pojedinačnim simulacijama na više razina koje koordiniraju širok raspon prostornih i vremenskih ljestvica, koje se ne mogu ocijeniti pomoću jedinstvene fine diskrecije ili jedinstvenih algoritama u cijelosti. Na najfinijim mjerilima, stohastičke će se metode koristiti za bolje razumijevanje varijabilnosti koja se vidi u malim razmjerima, na primjer u sinaptičkim rascjepima. Dodatna metoda simulacije koja se trenutno obrađuje uključuje tehnike za razumijevanje protoka struje u velikom tkivu za simulaciju duboke i transkranijalne stimulacije struje. Bilo da su inducirani izvana ili proizvedeni lokalnim potencijalima polja (Lind én i sur., 2014.), efekti masovnog električnog polja neće samo depolarizirati ili hiperpolarizirati stanice, već će utjecati i na difuziju iona i drugih nabijenih vrsta, tj. Na fenomen elektrodifuzije. Ne samo da ioni utječu na polje, ioni također stvaraju polje koje će utjecati na druge ione, potencijalno proizvodeći polja reda stotina mikrovolti na 1 mm tkiva (Halnes i sur., 2016. Solbr å i sur., 2018.). Takvi gradijenti će vjerojatno imati još veći utjecaj u SD -u, gdje postoji velika preraspodjela iona.

Postoji niz drugih važnih procesa na razini organa koji su osobito važni za patologiju mozga. To uključuje protok krvi koji je važan za razumijevanje moždanog udara i mehanička svojstva važna za razumijevanje traumatske ozljede mozga. Dodatni procesi koji su jedinstveni za mozak uključivali bi proizvodnju, protok i ponovnu apsorpciju cerebrospinalne tekućine te stanje krvno-moždane barijere. Kontroverznija je uloga advekcije i protoka tekućine#x02014. Mozgu nedostaje limfni sustav za uklanjanje otpada, a mali prostori između stanica, 繀 nm, premali su da bi podržali advekciju (Jin i sur., 2016. Holter i sur., 2017.). Pretpostavljeno je da se umjesto toga koristi a glimfatički sustav koji uspostavlja protok tekućine putem glijalnih astrocitnih kanala aquaporin-4, potaknut pulsacijama iz disanja i otkucaja srca. Tekućina bi tekla preko astrocita orijentiranih da osiguraju puteve koje intersticij ne može podržati (Iliff i sur., 2012.).

Svi su ti procesi trenutno predmet višeslojnog modeliranja na različitim stupnjevima sofisticiranosti (Anderson i Vadigepalli, 2016. Linninger i sur., 2016. Calvetti i sur., 2018. Durka i sur., 2018. Zhao i sur., 2018.). Iako ne bi bilo praktično uvrstiti ove mnoge vrste simulacija u NEURON, postojat će mogućnosti za međusobnu simulacijsku komunikaciju koja će u budućnosti omogućiti složene multifizičke simulacije (Djurfeldt i sur., 2010.). U međuvremenu se neki aspekti ove složenosti mogu lako ugraditi bez razmatranja pojedinosti: na primjer, vaskularizacija mozga može se modelirati kao “metabolitsko polje ” koje bi uzelo u obzir veću dostupnost kisika i glukoze na mjestima unutar, i smanjenu dostupnost u slivna područja koje se nalaze između, glavnih stabala distribucije arterija.

Uvjet modeliranje mozaika mogu se koristiti za opisivanje ovih složenih višerazmjernih, multifizičkih, multilgoritmičkih, višedimenzionalnih simulacija —mozaik uključuje komade stanice ili mozga simulirane različitim dimenzijama, različitim algoritmima i različitim diskrecijama. Primjer na staničnoj razini su bodlje, s kojima se najbolje rukuje stohastički i u tri dimenzije, dok se s ostatkom stanice rukuje deterministički i kao jednodimenzionalna razgranata struktura drveta (Lin i sur., 2017a, b). Slično, u ECS -u, mali prostori poput sinapsi zahtijevaju mikroskopski pristup koji nije praktičan za modeliranje masovnog tkiva. U budućnosti će ti komadi mozaika biti prilagođeni pristupima koje trenutno koriste drugi simulatori. Na primjer, jedan pristup na malim mjerilima je praćenje pojedinačnih čestica, što su učinili Smoldyn (Andrews, 2012.) i MCell (Stiles i Bartol, 2001. Franks i sur., 2002.). Druga tehnika malog volumena koristi prosječne volumetrijske podatke kao što je to učinila platforma ENOS, koja se također koristila za modele glutamatergičnih sinapsi visoke rezolucije i njihovu interakciju s glijom (Bouteiller i sur., 2008). Druge platforme koje podržavaju unutarstaničnu difuziju bit će također minirane za dodatne tehnike, uključujući STEPS (Wils i De Schutter, 2009.), NeuroRD (Brandi i sur., 2011.), MOOSE (Ray i Bhalla, 2008.).


(BBB). Fiziološka barijera koju stvaraju endotelne stanice CNS -a za regulaciju prometa molekula između krvi i mozga.

(NVC). Proces kojim lokalna neuronska aktivacija može brzo povećati lokalni protok krvi, osnova je funkcionalne MRI.

Zbirni izraz za opisivanje vrsta stanica koje se obavijaju oko krvnih žila, uključujući stanice glatkih mišića na arterijama i pericite na kapilarama

Mjehuričaste strukture u obliku tikvice koje čine kaveolini, promjera približno 70 nm.

Toksin koji inhibira sintezu proteina, što dovodi do stanične smrti.

Rast novih krvnih žila iz postojećih krvnih žila.

(CVO). Srednje moždane strukture s propusnom vaskulaturom omogućuju gotovu razmjenu molekula između neurona i krvi.

Sintetički oponašanje dvolančane RNK oponaša učinak virusne infekcije na imunološki sustav.


Gledaj video: Desh Deshantar- Doubling Farmers Income Formula vs Farmers Distress (Svibanj 2022).