Informacija

Optimizacija transfekcije posredovana kationskim lipidima za posuđe od 150 mm

Optimizacija transfekcije posredovana kationskim lipidima za posuđe od 150 mm



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Moram optimizirati protokol transfekcije kako bih privremeno izrazio plazmid koji kodira himeru eyfp -a vezanu za c pojam signalne molekule Golgijevog aparata) u hela stanicama i hepg2 stanicama i postigao što veću ekspresiju.

Trebam dovoljno proteina za oko 100 wb -ova. Posijao sam hela ćelije u 12 posuda od 150 mm. I isto s hepg2. Pripremio sam mg plazmida.

Koristim invitrogene izvornik reagens lipofektamina; ne 2000, ili ltx ili bilo što od toga.

Svi prijedlozi o protokolu za hela i hepg2 plazmidnu dna i lipofektamin posredovanu transfekciju na tako velikoj veličini ploče.

Pretpostavljam da bi samo povećanje trebalo djelovati, ali ovdje postoje neke zamke. Pogledajte ovu tablicu, na primjer, kad prijeđete od 60 do 100 mm, udvostručit ćete površinu, pa ćete tako i udvostručiti volumen kulture. Međutim, kad prijeđete sa 100 na 150 mm, utrostručujete površinu, ali samo povećavate volumen kulture dva puta. Ovo čini da moji izračuni proširenja za transfekciju izgledaju jako loše:


Dakle, za svaki redak u protokolu antene cijeli je proces uvećan za diskretnu vrijednost. U slučaju od 100 mm do 150 mm, vrijednosti se povećavaju za oko 2,76 u svim vrijednostima:

(a) 152/55 = 2,76, (b) 1,52e7/5,5e6 = 2,76, (c) | prosjek (30,4-45,6)/prosjek (11-16,5) | = 2,76

(kako je odgovoreno u komentarima)


Sažetak

Ovdje izvještavamo o karakterizaciji i optimizaciji sustava za isporuku gena za peptide/nekationske lipide koji uspješno proizvodi visoku razinu ekspresije gena kada se mikroinjekcijom isporučuje u embrije kokoši in vivo. Osim plazmidne DNA, kompleks za isporuku sastojao se od četiri komponente: 1) "kondenziranog" peptida sa segmentima hidrofobnih i kationskih aminokiselina 2) "fusogenog" peptida s membranskom ugradnjom i amfipatskim spiralnim segmentima 3) relativno kratkim lanac fosfatidilkolina (14: 1 cis-9) i 4) polietilenglikol konjugiran s dioleoilfosfatidiletanolaminom preko disulfidne veze. Optimalne količine svake komponente određene su mjerenjem ekspresije reporter gena luciferaze nakon 24-satne inkubacije sa stanicama fibroblasta embrija pileća (CEF) u kulturi. Kada su relativno male količine kondenzacijskog peptida, fuzogenog peptida ili lipida okupljene u komplekse, potrebne su relativno velike koncentracije kompleksa kako bi se postigla maksimalna ekspresija gena. Kad su povećane količine peptida ili lipida, za postizanje maksimalne ekspresije bilo je potrebno manje kompleksa, ali je ekspresija znatno pala s većim količinama dodanog kompleksa. Komponenta polietilenglikola značajno je povećala ekspresiju gena. S nekim pripravcima, aktivnosti luciferaze u stanicama CEF dosegle su 1 × 10 10 relativnih svjetlosnih jedinica u sekundi po mg proteina u roku od 24 sata. Nakon eksperimenata optimizacije s CEF stanicama, formulacije koje sadrže niske, srednje i visoke razine komponenti sustava za isporuku sastavljene su sa zelenom fluorescentnom proteinsko plazmidnom DNA, a zatim mikroinjektirane u somitna područja pilećih embrija in vivo. Utvrđeno je da su srednje razine komponenata dale najpouzdanije formulacije za izazivanje lokalizirane ekspresije gena u somitnim stanicama.


[35] - Kationic Liposome -Mediated RNA Transfection

Postoje dva načina za postizanje razumijevanja funkcije gena: jedan zahtijeva „izbacivanje“ funkcije gena iz stanice, a drugi uključuje uvođenje gena u stanicu. Dostupne su različite metode za uvođenje genetskog materijala u stanice. To uključuje jednostavne manipulacije, kao što je miješanje DNK velike molekulske mase s kalcijevim fosfatom, DEAE-dekstranom, polilizinom ili poliornitinom. Druge metode uključuju mikroinjekciju, elektroporaciju, fuziju protoplasta, liposome, rekonstituirane ovojnice virusa i virusne vektore. Različite učinkovitosti transfekcije RNA u različitim staničnim tipovima mogu biti posljedica diferencijalne transfektabilnosti, suboptimalnih omjera lipofektin: RNA, translacijske učinkovitosti ili stabilnosti glasničke RNA (mRNA). Tehnika transfekcije RNA može se koristiti za istraživanje različitih parametara koji utječu na translacijsku učinkovitost mRNA izravnom transfekcijom generiranih transkripata mRNA in vitro iz DNK konstrukata koji sadrže specifične sekvence. Postupak RNA-lipofectin ima sposobnost transfekcije širokog spektra tipova stanica. Ovaj postupak se također može koristiti za proučavanje učinka različitih elemenata sekvence na stabilnost mRNA.


REZULTATI

Kako bismo utvrdili mogu li se kationski reagensi za transfekciju na bazi lipida optimizirati ili izmijeniti kako bi se proizvela prihvatljiva učinkovitost transfekcije za tkiva u cijelim zametcima, prvo smo identificirali formulacije reagensa koje najviše obećavaju (tj. Koncentracije i omjere naboja) u testu stanične kulture, a zatim smo testirao te reagense u razvoju embrija kralježnjaka. Testirane su tri različite formulacije reagensa: Lipofektamin, Lipofektamin 2000 i Lipofektamin pojačan pegilacijom.

Pegilacija

Pegilacija, vezivanje polietilen glikolnih lanaca, uobičajena je tehnika koja se koristi za povećanje vremena cirkulacije in vivo i bioraspoloživost terapeutika smanjenjem prepoznavanja i klirensa (Caliceti i Veronese, 2003.). PEG (polietilen glikol), fleksibilan i netoksičan polimer, stvara sterički barijerni sloj koji sprječava adsorpciju proteina, a time i inaktivaciju i uklanjanje terapijskog sredstva. Osim malih molekula, pegilacija je pokazala veliko obećanje kada se koristi na makromolekulima, a posebno na liposomima, značajno usporavajući opsonizaciju i klirens in vivo. Najčešće korištena metoda za pegiliranje liposoma je ugradnja lipida s kovalentno vezanim PEG molekulama u liposomski dvosloj. Za naš reagens sintetizirali smo mPEG-SS-DOPE, polietilen glikol od 5000 molekulske mase konjugiran s lipidom DOPE (dioleoil fosfatidiletanolamin) putem disulfidne veze koja se može hidrolizirati. Konjugacijom PEG lanca u DOPE pomoću disulfidnog umreživača stvaraju se pH osjetljivi liposomi u kojima se PEG lanac hidrolizira s površine lipopleksa u okruženju niskog pH endosoma. Pokazalo se da hidroliza PEG lanca destabilizira endocitozirane liposome, što zauzvrat potiče endosomolizu zbog fuzogenosti lipida DOPE, povećavajući otpuštanje sadržaja liposoma u citoplazmu stanice (Kirpoten i sur., 1996.).

Naš pegilirani transfekcijski reagens optimizirana je formulacija tri lipida: kationski lipid DOSPA (2,3-dioleiloksi-N- [2 (sperminkarboksamido) etil] -N, N-dimetil-1-propanaminij trifluoroacetat), neutralni lipidni DOPE, i mPEG-SS-DOPE. Lipofektamin, široko korišteni reagens za komercijalnu transfekciju, je 3: 1 (w/w) liposomska formulacija DOSPA i DOPE. Kompleksi DNK/liposomi, lipoplekse, nastaju elektrostatičkim interakcijama između pozitivno nabijenih aminskih skupina na DOSPA -i i negativno nabijenih fosfatnih skupina na kralježnici DNA riboze. Odlučili smo se koristiti DOSPA/DOPE formulaciju iz Lipofektamina kao temelj za naš pegilirani reagens jer je dobro karakteriziran i sposoban proizvesti visoku učinkovitost transfekcije u mnogim staničnim vrstama u kulturi. Međutim, lipopleksi DOSPA/DOPE imaju dva velika nedostatka koji ograničavaju njihovu sposobnost transfekcije stanica in vivo: nemaju zaštitu od opsonizacije i klirensa komponenti seruma, te se ne mogu visoko koncentrirati zbog stvaranja velikih neaktivnih agregata nakon kompleksacije DNA. Kako bismo prevladali ove probleme, našoj formulaciji reagensa dodali smo mPEG-SS-DOPE i upotrijebili postupak dijalize deterdženta za formiranje lipopleksa.

Formiranje pegiliranog lipopleksa

Većina komercijalno dostupnih kationskih transfekcijskih reagensa na bazi liposoma koristi jednostavan protokol miješanja u jednom koraku s prethodno oblikovanim kationskim liposomima i plazmidnom DNA, tvoreći lipoplekse gdje je plazmidna DNA ionski vezana za vanjske površine liposoma. Međutim, vanjsko vezanje plazmidne DNA na liposome ostavlja DNK izloženu potencijalnoj razgradnji i opsonizaciji komponentama seruma. Osim toga, elektrostatičke interakcije između DNA i lipida koje su odgovorne za kompleksaciju lipopleksa također stvaraju vezanje između samih lipopleksa, uzrokujući da lipopleksi stvaraju velike agregate, značajno smanjujući učinkovitost transfekcije. Kako bismo riješili te probleme, odabrali smo tehniku ​​dijalize deterdžentom za formiranje naših lipopleksa, minimizirajući razgradnju i čišćenje plazmida, kao i agregaciju lipopleksa. Pokazalo se da dijaliza deterdženta učinkovito inkapsulira plazmidnu DNA u male, lipoplekse stabilne u serumu, čak i pri visokim koncentracijama DNA i visokim omjerima naboja lipid-plazmida ((Hofland i sur., 1996., 1997. Wheeler i sur., 1999. Tam i sur. , 2000.).

Neionski deterdžent oktilglukopiranosid (OGP) korišten je za otapanje smjese plazmidne DNA, lipofektamina i pegiliranog lipida mPEG-SS-DOPE kako je prikazano na slici 1. Lipoplekse su formirali u visokim koncentracijama, ∼ 1 mg/ml DNA, pogodno za pokuse mikroinjekcija. U fiziološkom puferu, visoke koncentracije komponenata odmah se talože i ispadnu iz otopine, unatoč prisutnosti otapajućeg deterdženta, zbog snažnog elektrostatičkog privlačenja između koncentrirane DNA i DOSPA. Kako bi se spriječilo taloženje, suspenziji i puferima za dijalizu dodane su visoke koncentracije soli. Vjeruje se da sol djeluje kao haotropno sredstvo, pomažući u održavanju stabilnosti mješavine DNA/lipida u otopini (Hofland i sur., 1997.). Otkrili smo da je 3 M NaCl bilo dovoljno da spriječi trenutačno taloženje nakon miješanja u rasponu komponenti reagensa koje smo testirali, omjerima 1 mg/ml DNA i D/N od 0,5-2. Omjer D/N odnosi se na omjer DOSPA prema nukleotidu (mol/mol) u smjesi, mjerenje pozitivno nabijenih aminskih skupina na DOSPA prema negativno nabijenim fosfatnim skupinama na kralježnici DNA riboze. Komponente reagensa pomiješane su u Hepes puferiranoj fiziološkoj otopini (HBS) s 3 M NaCl i 2% OGP i dijalizirane protiv HBS s 3 M NaCl radi uklanjanja deterdženta (slika 1).

Komponente reagensa i stvaranje lipopleksa. Plazmidna DNA, lipidi DOPE, DOSPA i mPEG-SS-DOPE pomiješani su zajedno u prisutnosti anionskog deterdženta oktilglukopiranozida (OGP) i 3 M NaCl. Deterdžent pomaže pri otapanju i raspršivanju lipida, dok visoka koncentracija soli ublažava elektrostatičke interakcije između DNA i kationskog lipida i sprječava nakupljanje kompleksa. OGP se zatim polako uklanja dijalizom protiv HBS 3M (5 mM HEPES, 3 M NaCl, pH 7,4) tvoreći lipoplekse stabilne s otopinom DNA. Konačno, koncentracija soli u otopini lipopleksa snižena je na fiziološku razinu uzastopnom dijalizom protiv HBS s 1,5 M, 0,5 M i 0,15 M NaCl.

Nakon uklanjanja deterdženta, lipopleksi su bili stabilni, prema vizualnoj procjeni bistrih dijalizata, bez taloga u bilo kojoj od formulacija reagensa. Međutim, koncentracija soli, pri 3 M NaCl, bila je previsoka za in vivo eksperimente mikroinjekcije. Koncentracija soli pufera smanjena je na fiziološku koncentraciju kroz niz koraka dijalize u odnosu na smanjenje koncentracije soli sve dok lipopleksi nisu bili u konačnom HBS puferu s 0,15 M NaCl, pH 7,4. Nakon smanjenja koncentracije soli, mnoge formulacije postale su neprozirne i mliječne, pri čemu su se neke formulacije s visokim omjerom naboja/niskom pegilacijom taložile u različitim stupnjevima kako je dolje opisano.

Dijaliza deterdženta i mPEG-SS-DOPE omogućuju nam stvaranje lipopleksa koji su stabilni pri mnogo većim koncentracijama nego što je to moguće kod nepegiliranih lipopleksa. Visoko koncentrirani, stabilni lipopleksi važno su razmatranje za eksperimente s izravnim ubrizgavanjem. Mikroinjekcija na mjesta unutar embrija u razvoju zahtijeva reagens koji može proizvesti značajnu ekspresiju transgena iz volumena u rasponu nanolitara. Većina komercijalnih reagensa za transfekciju loše je prilagođena za mikroinjekciju jer nemaju mehanizam za sprječavanje elektrostatičkog vezanja između složenih lipopleksa i stoga tvore agregate tijekom vremena i u visokim koncentracijama. Protokoli za Lipofektamin i Lipofektamin 2000 zahtijevaju specifičnu DNK: koncentracije reagensa i vrijeme inkubacije prije dodavanja stanica u kulturu, ostavljajući dovoljno vremena za učinkovito stvaranje kompleksa DNK: reagens, ali prije stvaranja neaktivnih agregata lipopleksa. S vremenom čak i niske koncentracije, poput onih koje se preporučuju za transfekciju stanične kulture, stvaraju agregate nesposobne za učinkovitu transfekciju (podaci nisu prikazani). Ugradnja mPEG-SS-DOPE-a u lipidni dvosloj DOSPA/DOPE lipopleksa rezultiralo je slabljenjem agregacijskih sila i omogućilo nam je formiranje stabilnih otopina lipopleksa koje su zadržale svoju učinkovitost transfekcije čak i nakon nekoliko mjeseci na 4 ° C. Lipopleksi s omjerom D/N 0,5 zahtijevali su minimalno 5% mPEG-SS-DOPE za sprječavanje taloženja lipopleksa s omjerom D/N 1 potrebno je 7,5% mPEG-SS-DOPE i lipoplekse s omjerom naboja 2 potrebno 12,5 % mPEG-SS-DOPE. One formulacije lipopleksa koje su imale značajnu taloženje nisu uspjele učinkovito transficirati uzgojene stanice. Lipopleksi s minimalnom ili nešto većom količinom mPEG-SS-DOPE nego što je potrebno za sprječavanje taloženja imali su neprozirni mliječni izgled, dok su lipopleksi znatno iznad minimalne koncentracije mPEG-SS-DOPE bili jasni.

Rezultati in vitro transfekcije

Većina stanica ima male neto negativne naboje na vanjskim staničnim membranama. Kationski lipidi vežu se na staničnu membranu elektrostatičkim interakcijama između pozitivno nabijenih aminskih skupina na lipidima i negativnih naboja prisutnih na staničnim površinama. Potrebna je pažljiva optimizacija omjera naboja kako bi se osiguralo da je inkapsulacija DNA maksimalna, dok lipoplekse zadržavaju dovoljno neto pozitivnog naboja za promicanje učinkovitog vezanja na staničnu površinu. Testirali smo nekoliko različitih omjera naboja lipofektamina, lipofektamina 2000 i pegiliranog lipofektamina na njihovu sposobnost da transficiraju stanice fibroblasta embrija pilića (CEF) u kulturi s minimalnom toksičnošću. Transfekcije su provedene sa i bez seruma u mediju za kulturu kako bi se procijenio učinak koji opsonizacija komponentama seruma ima na pojedinačne formulacije reagensa, što je važno uzeti u obzir pri projektiranju transfekcijskog reagensa za uporabu in vivo.

Koristeći in vitro sustav stanične kulture CEF, istražili smo učinke dodavanja pegilacije u lipoplekse DOSPA/DOPE na bazi lipofektamina. Iako dodavanje pegilacije u lipoplekse pomaže u sprječavanju taloženja, također se očekuje da će inhibirati elektrostatičke interakcije odgovorne za vezanje stanične membrane, smanjujući učinkovitost transfekcije. Kako bi se utvrdilo postoji li formulacija pegiliranog reagensa koja sprječava značajne taloženje kada se koncentrira, ali ipak dopušta dovoljno elektrostatičkih interakcija za vezanje stanične membrane da proizvede visoku učinkovitost transfekcije, nastao je niz pegiliranih lipopleksa, mijenjanjem omjera D/N i mPEG -a -SS-DOPE sadržaj lipida, a zatim ispitati učinkovitost transfekcije (dodatne slike S1-S3, koje se mogu vidjeti na http://www.interscience.wiley.com/jpages/1058-8388/suppmat). Učinkoviti in vivo eksperimenti misekspresije zahtijevaju transfekcijsku metodu s minimalnom toksičnošću kako bi se smanjila i smrt stanica i anomalna endogena genetska ekspresija zbog transfekcijskog reagensa ili metode. Očekuje se da sve metode transfekcije imaju određenu toksičnost. Stoga je toksičnost pegiliranih lipopleksa kvantificirana mjerenjem ukupnog staničnog proteina 24 sata nakon dodavanja lipopleksa kao kod Lipofektamina i Lipofektamina 2000 (dodatne slike S1, S3).

Iz ovih rezultata identificirali smo D/N = 1, 7,5% mPEG-SS-DOPE kao najbolju formulaciju pegiliranog reagensa. Za usporedbu, prikazana je učinkovitost transfekcije i toksičnost D/N = 1, 7,5% mPEG-SS-DOPE pegiliranog lipofektamina zajedno s učinkovitošću transfekcije i toksičnošću 1: 4 lipofektamina 2000 u prisutnosti seruma. Rezultati (slika 2) pokazuju da in vitro optimizirani pegilirani reagens proizvodi sličnu učinkovitost i toksičnost transfekcije u usporedbi s optimiziranim lipofektaminom 2000. Oba reagensa odabrana su za daljnja ispitivanja in vivo transfekcije. Pegilirani reagens zahtijeva približno × 6 veću koncentraciju DNA kako bi se postigla ista učinkovitost transfekcije kao i Lipofektamin 2000. Međutim, toksičnost D/N = 1, 7,5% mPEG-SS-DOPE lipopleksa je niža od one Lipofektamina 2000 lipoplekse (83% ukupnog proteina za pegilirani lipofektamin sa 7,5% ukupnog sadržaja lipida mPEG-SS-DOPE i omjer D/N 1: 1 pri 3 μg DNA/jažici u usporedbi sa 77% ukupnog proteina za 1: 4 lipofektamin 2000 pri 0,5 μg DNA/jažici).

Usporedba učinkovitosti transfekcije i toksičnosti najboljih formulacija reagensa: 7,5% mPEG-SS-DOPE pegilirano D/N = 1 lipofektamin (crvena i narančasta krivulja) i 1: 4 lipofektamin 2000 (plava i zelena krivulja). Učinkovitost transfekcije mjerena je aktivnošću β-galaktozidaze, a toksičnost mjerena ukupnim proteinom preostalim nakon eksperimenata transfekcije CEF stanične kulture s 24 jažice.

Rezultati transfekcije pilića In vivo

Pileći embriji Hamburger i Hamilton (HH) stupnja 16 mikroinjektirani su i s optimiziranom formulacijom reagensa Lipofectamine 2000 i s pegiliranim D/N = 1, 7,5% mPEG-SS-DOPE reagensom kako je identificirano iz eksperimenata in vitro transfekcije. Odabrana su dva načina primjene: sustavne injekcije i lokalizirane injekcije. Za sistemske injekcije, ∼2,5 μl lipopleksa koji sadrže plazmid koji eksprimira zeleni fluorescentni protein (GFP) pCX -GFP ubrizgano je izravno u srce, a transfekcija je vizualno procijenjena praćenjem ekspresije GFP -a fluorescentnim mikroskopom. Za lokalizirane injekcije, ∼100 nl pCX-GFP lipopleksa izravno je mikroinjektirano u neuralnu cijev embrija u fazi razvoja 16.

Formulacija reagensa Lipofectamine 2000 u omjeru 1: 1 inicijalno je ubrizgavana u embrije pilića u razvoju u razrijeđenim koncentracijama (0,01 mg/ml) preporučenim za transfekciju stanične kulture. Međutim, otkrili smo vrlo malu transfekciju pomoću ovog nekoncentriranog reagensa. Kad su ubrizgane u neuralnu cijev, samo 2 od 21 embrija pokazala su bilo kakvu fluorescenciju i ta fluorescencija je bila vidljiva samo u vrlo malom broju stanica (& lt10). Lipofektamin 2000 1: 1 je zatim kompleksiran pri većim koncentracijama, 0,025 mg/ml i 0,05 mg/ml, i testiran na njihovu sposobnost transfekcije stanica in vivo.Utvrdili smo da je koncentriranje 1: 1 formulacije Lipofectamine 2000 proizvelo mnogo bolju transfekciju od nekoncentriranog 1: 1 Lipofectamina 2000, osobito koncentracije 0,05 mg/ml nakon sistemske injekcije. Međutim, koncentrirani 1: 1 Lipofectamine 2000 imao je vrlo kratko radno vrijeme jer su se neaktivni agregati taložili iz otopine. S lipopleksom smo mogli raditi samo <20 minuta prije nego što je bila vidljiva značajna količina taloga, a učinkovitost transfekcije značajno opala.

In vivo transfekcija koncentriranim 1: 1 reagensom Lipofectamine 2000 i 7,5% mPEG-SS-DOPE pegiliranim, D/N = 1 Lipofektamin reagens je zatim uspoređen. Povećanje i vrijeme ekspozicije slika bili su konstantni za sve embrije kako bi se osigurala točnost usporedbe reagensa. Nakon sustavnih injekcija oba reagensa (slika 3A -J), većina je embrija pokazala ekspresiju GFP -a u vaskulaturi. Lipofektamin 2000 je proizveo ekspresiju GFP -a u 18 od 19 embrija, dok je pegilirani lipofektamin proizveo ekspresiju GFP -a u 12 od 12 embrija. Lipofektamin 2000 proizveo je ekspresiju GFP -a koja je općenito bila ograničena na srce i nekoliko stanica u embrionalnoj vaskulaturi (slika 3F -J). Međutim, pegilirani lipofektamin reagens je očito proizveo značajno jaču transfekciju u mnogo širem broju stanica u vaskulaturi (slika 3A -E), a posebno u srcu (slika 4I, J, L). Nakon injekcija oba reagensa u leđnu moždinu (slika 3K – T), 11 od 12 pegiliranih embrija lipofektamina pokazalo je ekspresiju GFP -a (slika 3K -O), ali samo 4 od 11 embrija ubrizganih s lipofektaminom 2000 pokazalo je ekspresiju GFP -a (slika 3P –T). Kao i kod injekcija krvnih žila, pegilirani lipofektamin reagens je očito proizveo najbolju in vivo transfekciju u živčanoj cijevi, a u većini slučajeva došlo je do značajne ekspresije GFP -a duž cijele duljine leđne moždine. Za usporedbu, umetak na slici 3K prikazuje tipičnu ekspresiju GFP -a s elektroporacijom nakon ubrizgavanja plazmida u neuralnu cijev. Izraz je širok i snažan, ali ograničen na područje između elektroda.

Usporedba transfekcije in vivo transfekcije embrija pilića između optimiziranih pegiliranih lipopleksa i optimiziranog lipofektamina 2000. Za usporedbu je prikazano pet reprezentativnih embrija za svaku injekciju. A – J: In ovo ubrizgavanje volumena ∼2,5 µl koncentriranih lipopleksa koji sadrži ekspresijski vektor zelenog fluorescentnog proteina (GFP) pCX-GFP u srce pilećih zametaka u fazi 16 u Hamburgeru i Hamiltonu (HH) i vizualizirano 24 sata kasnije. Embriji ubrizgani s optimiziranim pegiliranim lipopleksom (A -E) proizveli su značajno bolju ekspresiju zelenog fluorescentnog proteina (GFP) od embrija ubrizganih s optimiziranim koncentriranim lipofektaminom 2000 (F – J). K – T: Injekcija volumena ∼100-nl koncentriranih lipopleksa koji sadrže pCX-GFP u leđnu moždinu pilećih embrija HH stupnja 16. Optimizirani pegilirani lipoplekse (K – O) proizveli su značajno bolju ekspresiju GFP -a od embrija ubrizganih s optimiziranim koncentriranim Lipofektaminom 2000 (P – T), koji je proizveo vrlo malu ekspresiju GFP -a. Umetnuta kutija u K prikazuje rezultate tipične elektroporacije leđne moždine za usporedbu.

Ekspresija zelenog fluorescentnog proteina (GFP) pilića embrija nakon injekcija optimizirane formulacije lipopleksa. A – H: Lipopleksi koji sadrže plazmid koji eksprimira GFP pCX-GFP injicirani su in ovo u odabrana tkiva embriona pilića stadija 16 i vizualizirani 24 sata kasnije pod fluorescencijom (A – D) i mikroskopijom svijetlog polja (E – H). A – J: Injekcija leđne moždine (A, E), injekcija mezoderme bočne ploče (B, F), injekcije somita (C, G), injekcija mezenhima glave (D, H) i srce (I, J). K, L: Ovi presjeci od 20 μm parafina uzeti su 24 sata nakon injekcije optimizirane formulacije lipopleksa u leđnu moždinu (K) i srce (L). Zametci su obojeni s Alexa Fluor 488 anti-GFP antitijelima, a presjeci su vizualizirani fluorescentnom mikroskopijom. L: Strelice označavaju GFP-pozitivne stanice u presjeku srca.

Transfekcija stanica po cijeloj duljini vaskulature može se pripisati dugoj cirkulacijskoj prirodi lipopleksa dobivenih dodatkom pegilacije. Sposobnost pegiliranog lipofektaminskog reagensa da transficira lokalizirana područja u embriju pilića dodatno je ispitana ubrizgavanjem nekoliko različitih mjesta unutar embrija u fazi razvoja 16 (slika 4). Izvrsna lokalizirana transfekcija opažena je nakon ubrizgavanja u lumen neuralne cijevi (slika 4A, E), mezoderma bočne ploče (slika 4B, F), somita (slika 4C, G) i mezenhima glave (slika 4D, H). Posljednja tri tkiva teško je transficirati pomoću elektroporacije. Presjeci legiranih leđnih moždina pegiliranih lipofektaminom transficiranih anti-GFP-om pokazali su ekspresiju GFP-a u živčanim stanicama, kao i ganglijskim stanicama leđnog korijena koje su migrirale iz živčane cijevi (slika 4K).

Miš in vivo rezultati transfekcije

Kako bi se provjerila učinkovitost pegiliranog lipofektaminskog reagensa u drugom organizmu, embriji miša su mikroinjektirani s optimiziranom formulacijom reagensa. Kao i kod pilećih embrija, dva su načina davanja primijenjena za ispitivanje potencijala reagensa za eksperimente misekspresije na embrijima miša: sustavne injekcije i lokalizirane injekcije. Sistemske injekcije provedene su ubrizgavanjem ∼1 μl ∼1 mg/ml GFP lipopleksa u lijevi dovodni kanal srca kultiviranog embrionalnog dana (E) 8,5 embrija miša i transfekcija je vizualno procijenjena fluorescentnim mikroskopom. Dvadeset četiri sata nakon injekcije, značajna ekspresija GFP-a bila je vidljiva u cijeloj vaskulaturi žumanjčane vrećice (slika 5A, C) i samog embrija (slika 5B, D). Nisu uočeni nedostaci ili anomalije zbog sustavnog ubrizgavanja reagensa za transfekciju. Lokalizirano ubrizgavanje optimizirane formulacije reagensa u perikardijalnu regiju kultiviranih embrija miša E8.5 rezultiralo je snažnom ekspresijom GFP -a u srcu (slika 5E, F). Osim toga, lokalizirano ubrizgavanje u živčanu cijev embrija miša E9.5 rezultiralo je snažnom ekspresijom GFP -a ograničenom na neuralnu cijev (slika 5G, H).

Mišji embrioni in vivo izražavaju zelene fluorescentne proteine ​​(GFP) nakon sustavnih i lokalnih injekcija optimizirane formulacije lipopleksa. OGLAS: Lipoplekse koji sadrže plazmid koji eksprimira GFP pCX-GFP ubrizgali smo u lijevi dovodni kanal embrionalnog dana (E) 8,5 mišjih embrija i vizualizirali 24 sata kasnije pod fluorescencijom. Prikazana su dva različita embrija (A i B isti zametak i C i D isti zametak), oba s još pričvršćenom žumanjčanom vrećicom (A, C) i s uklonjenom žumanjčanom vrećicom (B, D). Zametci su pokazali fluorescenciju u cijeloj vaskulaturi, uključujući žumanjčanu vrećicu (A, B) i unutarnju embrionalnu vaskulaturu (C, D). EH: Ekspresija GFP -a nakon injekcija na mjestu optimizirane formulacije lipopleksa u perikardijalnu regiju embrija miša E8.5 (E, F) i u neuralnu cijev embrija E9.5 (G, H). Slike A i B prikazuju isti zametak s još pričvršćenom žumanjčanom vrećicom (E) i s uklonjenom žumanjčanom vrećicom (F). Slike G i H prikazuju isti zametak pri manjem povećanju (E) i pri većem povećanju (H). Zametci su pokazali jaku fluorescenciju samo u ubrizganim tkivima srca (E, F) i neuralnoj cijevi (G, H).


Uvod

Stanična isporuka egzogenih molekula DNA za manipuliranje fiziološkim funkcijama na genetskoj razini bila je nezamjenjiv alat u studijama molekularne biologije i biotehnološkim primjenama. Klinički prijevod isporuke gena kao oblika molekularne terapije sporo je napredovao uglavnom zbog nedostatka vektora za isporuku gena (GDV) koji mogu zadovoljiti zahtjeve učinkovitosti i sigurnosti. Dis-naoružani rekombinantni virusni vektori ostaju trenutno najučinkovitija metoda isporuke gena. Međutim, rizik od imunogenosti, rezidualne infektivnosti i insercijske mutageneze trenutno isključuje njihovu široku upotrebu [1]. Kontinuirani napori u razvoju nevirusnih GDV-a dali su veliku biblioteku biokompatibilnih materijala sposobnih za dovoljnu količinu DNK pakiranja i sposobnosti isporuke u pretkliničkim modelima, ali još uvijek nisu postigli učinkovitost koju virusni vektori mogu potaknuti. Strategije za poboljšanje učinkovitosti i biokompatibilnosti kationskih reagensa za isporuku gena obično uključuju cijepljenje funkcionalnih liganda kao što su peptidi, lipidi, šećeri ili njihova kombinacija, radi poboljšanja stabilnosti, ciljanja, preuzimanja i sposobnosti podstaničnog prometa vektora [2] . S tim u vezi, pokazano je da hidrofobna modifikacija kationskih reagensa s lipidnim ostacima poboljšava vezivanje za membranu i povećava učinkovitost isporuke gena [3]. Naša skupina pokazala je izvedivost ovog pristupa cijepljenjem nekoliko endogenih lipida na polietilenimin (PEI2) niske molekularne mase (2 kDa). Najučinkovitiji polimer, naime PEI2 supstituiran linolnom kiselinom (PEI2LA), pokazao je izrazito povećanu učinkovitost transfekcije u odnosu na svoju relativno neučinkovitu molekulu prekursora i u kultiviranim staničnim linijama i u primarnim stanicama dobivenim iz tkiva [4], [5]. Prethodno smo pokazali da je povećana učinkovitost PEI2LA djelomično posljedica jače povezanosti s nuklearnom membranom, što je povezano s boljim preuzimanjem jezgre i naknadnom ekspresijom transgena [5]. Međutim, potrebno je razjasniti koji se specifični put preuzimanja, kao i kasniji događaji unutarstanične trgovine posredovani PEI2LA.

Očekuje se da će supstitucija lipida povećati isporuku gena promicanjem jačeg vezanja kompleksa polimer/DNA na hidrofobne domene plazma membrane kako bi se povećala apsorpcija. Hidrofobne modifikacije također mogu promijeniti fizikalno -kemijska svojstva kompleksa, što dovodi do promjene u putovima usvajanja. Putevi preuzimanja od vitalnog su značaja za određivanje učinkovitosti GDV -a jer se odnose na unutarstaničnu preradu, trgovinu i recikliranje internaliziranih kompleksa. Općenito se smatra da unos sastavljenih kompleksa nastaje putem endocitoze [6], [7]. Endocitoza se općenito definira u dvije kategorije, pinocitozu i fagocitozu, od kojih je potonja ograničena na specijalizirane tipove stanica poput limfocita i makrofaga. Pinocitoza se dalje dijeli na endocitozu ovisnu o klatrinu (CME), endocitozu posredovanu kavelolinom (CvME), makropinocitozu i put nezavisan od klatrina/kaveolina. Smatralo se da je CvME put preuzimanja koji je najpogodniji za transfekciju zbog svog nekiselog, nerazgradivog okruženja, koje je održavalo unutarstanični integritet tereta nukleinske kiseline. Pokazalo se da je CvME endocitni put koji vodi do učinkovite ekspresije transgena u stanicama COS-7 i HeLa za PEI-posredovanu transfekciju [8], [9], [10]. Međutim, drugi su predložili CME kao najučinkovitiji put preuzimanja, jer ne samo da je stvorio kiselo okruženje za PEI komplekse kako bi se olakšao poremećaj endosoma putem učinka protonske spužve, već je i olakšao kretanje transgenog tereta proksimalno do perinuklearnog područja, što kasnije povećala sklonost nuklearnom uvozu [11]. Ipak, nedavne studije su također pokazale da je preuzimanje putem makropinocitoze najučinkovitiji put ulaska koji dovodi do transfekcije u PEI25 [12]. Bez obzira na to koji je endocitni put najučinkovitiji put transfekcije, predodžba da jedan put može biti optimalan za sve GDV -ove možda nije realna. Putevi transfekcije razlikuju se među različitim tipovima stanica [13], [14] i vjerojatno će ovisiti o biokemijskoj prirodi GDV -a i fizikalno -kemijskim svojstvima nastalih kompleksa [15]. U tom smislu, mehanističke studije i daljnje optimizacije dizajna za nevirusne GDV-e trebalo bi idealno istražiti u klinički relevantnim primarnim staničnim linijama kako bi klinički prijevod na oboje ex vivo i in vivo postavke isporuke mogu se pojednostaviti. To nije bio slučaj u prethodnim studijama koje su istraživale ulogu endocitnih puteva u učinkovitosti nevirusnih GDV-a, gdje su se rutinski koristile transformirane stanične linije [8], [9], [13], [14], [16], [17], [18].

U ovom smo istraživanju koristili normalne stanice fibroblasta prepucijuma (NHFF) za rasvjetljavanje mehanizma ulaska u stanice i prometa polimernih GDV -a. NHFF stanice su u tom pogledu svestrana platforma jer imaju kliničku važnost kako u staničnoj terapiji za indukciju pluripotentnih stanica, tako i u kožnoj genskoj terapiji za regeneraciju kože i popravak rana [19], [20], [21], [ 22]. Cilj nam je bio identificirati prevladavajući endocitni put uključen u preuzimanje kompleksa PEI2LA u stanicama NHFF u usporedbi s nativnim PEI (PEI2 i PEI25). Primijenili smo niz farmakoloških inhibitora koji su selektivno inhibirali CME, CvME i makropinocitozu kako bismo odredili put preuzimanja redukcijom. Specifične aktivnosti inhibitora definirane su titriranjem koncentracija lijeka u odnosu na vitalnost stanica i učinkovitost transfekcije. Nadalje smo ispitali unutarstaničnu raspodjelu kompleksa i ulogu oslobađanja endosoma kao koraka koji ograničava brzinu u ukupnoj transfekciji. Zaključci izvedeni iz ove studije ne samo da bi dali mehanički uvid u utjecaj lipidnih dijelova na trgovinu GDV-om, već bi također imali izravne implikacije na budući dizajn polimernih GDV-a za terapijsku isporuku gena u stanice NHFF-a.


Stabilna transfekcija

Odabir stabilno transficiranih stanica

Optimizacija za stabilnu transfekciju počinje uspješnom prijelaznom transfekcijom. Međutim, stanice treba transficirati plazmidom koji sadrži gen za rezistenciju na lijekove, poput neomicin fosfotransferaze (neo). Kao negativna kontrola, transficirajte stanice pomoću DNA koja ne sadrži marker rezistencije na lijekove.

  1. Prije transfekcije odredite selektivnu koncentraciju lijeka potrebnu za ubijanje netransficiranih stanica.
  2. Četrdeset i osam sati nakon transfekcije, tripsinizirajte slijepljene stanice i zamijenite u nekoliko različitih razrjeđenja (npr. 1: 100, 1: 500) u mediju koji sadrži odgovarajući selekcijski lijek. Za učinkovitu selekciju, stanice bi trebale biti subkonfluentne jer su konfluentne, nerastuće stanice otporne na učinke antibiotika poput G-418.
  3. Sljedećih 14 dana mijenjajte medij koji sadrži lijek svaka 3 do 4 dana.
  4. Tijekom drugog tjedna pratite ćelije u potrazi za različitim "otocima" preživjelih stanica. Klonovi rezistentni na lijekove mogu se pojaviti za 2–5 tjedana, ovisno o vrsti stanice. Stanična smrt trebala bi se dogoditi nakon 3–9 dana u kulturama transficiranim s plazmidom negativne kontrole.
  5. Prenesite pojedinačne klonove standardnim tehnikama (npr. Pomoću cilindra za kloniranje) na ploče s 96 jažica i nastavite održavati kulture u mediju koji sadrži odgovarajući lijek.

Tablica 4 daje pregled uobičajenih antibiotika za odabir i održavanje stabilnih transfektanata.

Tablica 4. Antibiotici koji se koriste za odabir stabilnih transfektanata.

Antibiotik Gen za otpor Radna koncentracija Stock rješenje
G-418 ili Geneticin® aminoglikozid (npr. neomicin) fosfotransferaza G-418 se često koristi za početnu selekciju pri 500 µg/ml u rasponu od 50 do 1 000 µg/ml 50 mg/ml u vodi ili 100 mM HEPES -a (pH 7,3) potonji pufer pomaže u održavanju pH medija kulture
Higromicin (Hygro) hph 10-400 µg/ml 100 mg/ml u vodi
Puromicin (Puro) pac 1-10 μg/ml 10 mg/ml u vodi ili HEPES puferu (pH 7,0)

Izračun stabilne učinkovitosti transfekcije

Sljedeći postupak može se koristiti za određivanje postotka dobivenih stabilnih transfektanata.

Bilješka: Obojene stanice neće biti održive nakon ovog postupka.


Uvod

Od svog otkrića prije gotovo 30 godina 1, antisens tehnologija se naširoko koristila kao istraživački alat za utišavanje gena specifičnih za sekvencu u rasvjetljavanju funkcije gena i u potvrđivanju cilja lijeka 2, a trenutno se razvija i prema kliničkoj primjeni 3, 4. U teoriji, koncept antisense tehnologije je elegantan. Kratki sintetski oligodeoksinukleotidi (ODN) selektivno se vežu za komplementarni mRNA transkript ciljanog gena putem Watson-Crickove hibridizacije, čime se inhibira translacija mRNA u odgovarajući protein putem bilo kojeg od nekoliko mehanizama, poput translacijskog zaustavljanja ili cijepanja mRNA ribonukleazom H 5. Međutim, praktična primjena antisens oligonukleotida pokazala se izazovnom, uglavnom zbog njihove osjetljivosti na razgradnju staničnim nukleazama i poteškoća u isporuci učinkovitih i sigurnih doza. Kako bi se povećala njihova stabilnost protiv nukleolitičke razgradnje, kao i povećao njihov afinitet za metu i smanjila njihova toksičnost, sintetizirani su antisense oligonukleotidi s različitim kemijskim modifikacijama. To uključuje, među ostalim, fosforotioatne ODN-ove, metilfosfonate i fosforamidatne ODN-ove, 2 ′-O.-modificirana RNA, zaključane nukleinske kiseline i peptidne nukleinske kiseline 3, 6, 7. Drugi dugogodišnji problem postoji u isporuci antisens oligonukleotida u stanice i tkiva. Različiti nevirusni sustavi isporuke oligonukleotida razvijeni su kako bi zadovoljili nekoliko kriterija, poput poboljšane stabilnosti u fiziološkim uvjetima, učinkovite internalizacije ciljanih stanica, rezistencije na unutarstanične nukleaze i smanjene nespecifične interakcije s drugim makromolekulima. Unatoč značajnim istraživanjima na ovom području, učinkovitost i specifičnost isporuke još uvijek nisu zadovoljavajući u mnogim slučajevima 8.

Jezgrena komponenta većine sustava za isporuku oligonukleotida je sintetički polimer ili lipid (ili smjesa lipida). Obično se koriste za isporuku plazmida koji nose terapeutske gene, kationski lipidi su također obećavajući reagensi za isporuku oligonukleotida. 9, 10 Kationski kompleksi lipida/DNA obično se formuliraju pomoću viška pozitivnog naboja (doprinosi lipidnoj komponenti), čime se dobivenoj čestici daje učinkovitija interakcija s negativno nabijenom staničnom membranom. Nakon stanične internalizacije, endosomi se zakiseljuju i napreduju do lizosoma, gdje se njihov sadržaj razgrađuje. Ključno za uspjeh antisense regulacije je učinkovito oslobađanje oligonukleotida s ovog endosomalno-lizosomskog puta u citoplazmu 11. S obzirom na to, neki sintetski vektori formulirani su s endosomalnim ostacima bijega (kemijske skupine osjetljive na pH) koji potiču poremećaj membrane i oslobađanje DNA iz endosoma u citoplazmu. Jedan pristup je ugradnja neutralnog fosfolipida, poput dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), koji podliježe destabilizaciji dvosloja pri nižem pH (5 do 6) endocitnog odjeljka, stapa se s endosomalnom membranom i destabilizira endosom, oslobađajući tako DNK tereta u citoplazmu. 12 Sintetički amfipatski peptidi koji reagiraju na pH, poput GALA i JTS-1, osmišljeni su kao alternativa pomoćnom lipidnom pristupu 13, 14.

Prethodne studije pokazale su da vezanje negativno nabijenih komponenti seruma na pozitivno nabijene komplekse DNA može značajno smanjiti učinkovitost transfekcije 15, 16. Kako bi se smanjio ili preokrenuo ukupni naboj čestica i time smanjila opsonizacija seruma, anionski polimeri korišteni su kao dodatna komponenta vektora isporuke 17 - 19. Ranije je pokazano da je sintetski anionski polimer, poli (propilakrilna kiselina) (PPAA), mogao poboljšati unutarstaničnu isporuku plazmidne DNA komercijalno dostupnim kationskim liposomom, DOTAP, čak i u prisutnosti do 50% seruma. Prisutnost PPAA također je povećala transfekciju plazmida koji kodiraju antisense RNA u modelu miša 20. Iako je kombiniranjem PPAA s DOTAP -om dokazano poboljšano isporučivanje plazmida, ovaj sustav prethodno nije proučavan s obzirom na isporuku oligonukleotida. Unatoč značajnim razlikama u molekularnoj masi i topologiji plazmidne DNA i oligonukleotida, svaka vrsta DNA elektrostatički stupa u interakciju s DOTAP -om 14, 15. Pretpostavili smo da bi uključivanje PPAA u formulaciju omogućilo poboljšanje kationske liposomom posredovane dostave oligonukleotida. Kako bismo riješili ovo pitanje, izvještavamo o fizikalno -kemijskim karakteristikama DOTAP/ODN kompleksa koji uključuju stupnjevana opterećenja PPAA (tj. Uzrokuju različite omjere naboja), njihovu staničnu apsorpciju od strane CHO stanica i njihovu antisens inhibiciju u modelnom sustavu koji se sastoji od CHO stanica koje stabilno eksprimiraju pd1EGFP.


REZULTATI

SAINT-2 𠄽OPE (1: 1) učinkovito posreduje u preuzimanju antisens S-ODN-a na gotovo netoksičan način

U prethodnom radu pokazali smo da SAINT-2 𠄽OPE (molarni omjer 1: 1), kada je kompleksiran s plazmidnom DNA, učinkovito transficira eukariotske stanice (13). Doista, učinkovitost transfekcije do 90 % postiže se pri omjeru naboja (+ / –) od približno 2,5 (10 � µM lipida ˱ µg DNA). Sljedeći cilj je, dakle, bio ispitati može li SAINT-2 𠄽OPE na sličan način prenijeti antisensne ODN-ove u stanice kako bi regulirao ekspresiju gena u terapeutske ili stanične biološke svrhe. Koristeći fluorescentno označene ODN-ove, ustanovili smo da su 㺕 % dodanih ODN-a, pod svim uvjetima opisanim u ovoj studiji, povezani sa vezikulama SAINT-2 𠄽OPE pripremljenim kako je opisano u Materijalima i metodama, čime se postiže učinkovita učinkovitost sklop lipoplexa (nije prikazan). Kako bi se odredio optimalan omjer između SAINT-2 𠄽OPE i S-ODN u smislu učinkovitosti isporuke ODN-a, CHO stanice su tretirane ili s 20 µM SAINT-2 𠄽OPE, u kompleksu s različitim koncentracijama S- označenog S- ODN ili s kompleksom koji se sastoji od 100 nM S-ODN i različitih koncentracija SAINT-2 𠄽OPE. Tretirane stanice sakupljene su nakon razdoblja inkubacije od 4 sata, a isporuka S-ODN u smislu učinkovitosti i broja stanica koje sadrže internalizirani kompleks tada je izmjerena pomoću FACS-a. Kao što je prikazano na slici ​ Slika1A 1 A pri fiksnoj koncentraciji lipida od 20 µM, i apsolutna isporuka i broj stanica koje su zauzele kompleks povećavale su se s povećanjem koncentracije S-ODN. Dakle, pri koncentraciji ODN od 80 � nM, u biti su sve stanice pokazale prisutnost kompleksa. Nasuprot tome, dodavanjem kompleksa stanicama u#istim uvjetima, sastavljenim od različitih količina  SAINT-2 𠄽OPE-a i fiksne koncentracije S-ODN od 򠄀  nM, nije postignuto daljnje povećanje apsolutne isporuke u odnosu na dobiveno za 100 nM ODN ⼠ µM SAINT-2 𠄽OPE (sl. ​ (slika 1B). 1 B). Stoga je potonji sastav korišten u ovoj studiji za daljnje ispitivanje mehanizma i definiranje učinkovitosti antisense isporuke. Kako bismo ocijenili učinkovitost kapaciteta isporuke sadašnjeg sustava, prvo smo istražili stanično uzimanje nekompleksiranog S-ODN-a i učinak seruma. U tu svrhu, stanice su inkubirane samo sa S-ODN-ovima ili kompleksom S-ODN –SAINT-2 𠄽OPE tijekom 24 sata u različitim uvjetima, a stanični unos je određen mjerenjem ukupne stanično povezane fluorescencije, pomoću fluorescentno označenog S- ODN. Kao što je prikazano na slici ​ Slika1C, 1 C, SAINT-2 𠄽OPE poboljšala je staničnu apsorpciju S-ODN za 100 � puta u odnosu na unos samo S-ODN. Zanimljivo je da se apsolutna količina unosa, odražena ukupnom stanično povezanom fluorescencijom, povećala za 𢏁,5 puta u prisutnosti 10 % FCS-a. Imajte na umu, međutim, da su u oba slučaja u biti sve stanice pokazale prisutnost stanično povezane fluorescencije.

Optimizacija parametara za SAINT-2 𠄽OPE posredovanu dostavu antisens S-ODN u stanice. Lipoplekse, koji sadrže 5 ′ fluorescein-označen S-ODN, ili nekompleksirani ODN inkubirali su sa stanicama kako je opisano u Materijali i metode, a količina antisense povezane sa stanicama određena je mjerenjima FACS-a. (A) Intenzitet fluorescencije povezan s stanicom (pruge, lijevo y-os) i postotak fluorescentno označenih stanica (linija, desno y-os), u funkciji koncentracije antisense ODN-a kompleksiranog s 20 µM SAINT-2 𠄽OPE (1: 1). (B) Povezivanje ODN-a (100 nM) u funkciji koncentracije SAINT-2 𠄽OPE. Broj stanica koje su pokazale lipoplekse povezane s stanicama označen je linijom (desno) y-os). (C) CHO stanice su tretirane samo sa S-ODN-ima (AS), ili kada su kompleksirane sa SAINT-2 𠄽OPE (AS + SD), u prisutnosti (zasjenjene trake) ili odsutnosti seruma (ispunjene šipke). Linija označava broj stanica označenih u svakoj populaciji pri različitim naznačenim uvjetima. Imajte na umu da se S-ODN u kombinaciji s SAINT-2 𠄽OPE (100 nM ⼠ µM lipida) isporučuje S-ODN-om 100 puta, dok je složeno unošenje u prisutnosti seruma poboljšano. Podaci su srednje vrijednosti (±SD) tri određivanja.

Primjena sintetskih amfifila i liječenje antisens ODN često su patili od ozbiljnih citotoksičnih nuspojava. Iako je naš prethodni rad (13,17,18) jasno implicirao relativnu netoksičnu prirodu SAINT amfifila u usporedbi s drugim kationskim lipidima, mi smo zatim provjerili njegovu potencijalnu toksičnost zajedno s primjenom ODN-a. CHO stanice inkubirane su samo sa 20 µM SAINT-2 𠄽OPE, samo 100  nM antisens S-ODN ili ODN – amfifilskim kompleksom u prisutnosti ili odsutnosti 10 % seruma. Nakon 24 sata, stanice su sakupljene i citotoksičnost je određena MTT testom. Kao što je prikazano na slici ​ Slika2, 2, stanice tretirane antisens S-ODN nisu pokazale nikakvu citotoksičnost. Stanice tretirane samo SAINT-2 𠄽OPE i kompleks SAINT-2 𠄽OPE i S-ODN pokazali su samo skromnu citotoksičnost koja je bila 㰐 % u prisutnosti seruma. Zaključujemo stoga da pri odgovarajućem molarnom omjeru SAINT-2 𠄽OPE (20 µM) učinkovito isporučuje ODN-e (100 nM) stanicama, što dovodi do složenog preuzimanja od strane gotovo svih stanica u sustavu kulture u gotovo neotrovnom stanju način, koji se više potiče nego inhibira prisutnošću (10 %) seruma. Kako bi se dodatno definirali parametri unosa, mehanizam internalizacije i nastali biološki učinci, poduzeti su sljedeći pokusi.

Antisense tretman i toksičnost stanica. CHO stanice inkubirane su 24 sata bilo u prisutnosti (zasjenjene trake) ili odsutnosti 10 % seruma (ispunjene šipke). Toksičnost je određena pomoću MTT testa, a podaci su izraženi kao postotak preživjelih stanica, u odnosu na netretirane CHO stanice (100 %). Srednje vrijednosti ± SD dobivene su iz dva do tri eksperimenta, izvedena u dva primjerka.

Uzimanje S-ODN posredovano SAINT-2 ovisi o vremenu i potiče ga serum

Kako bi se odredila kinetika stanične apsorpcije amfifilnog –ODN kompleksa, stanice su inkubirane s antisense kompleksom S-ODN obilježenim FITC-om, pripremljenim u CHO mediju (vidi Materijali i metode), u prisutnosti ili odsutnosti seruma. Nakon različitih vremenskih intervala, stanice su sakupljene i fluorescencija povezana sa stanicama određena je mjerenjima FACS. Kao što je prikazano na slici ​, na slikama 3, 3, već nakon 1 sata inkubacije bila je vidljiva značajna povezanost fluorescentno označenih S-ODN sa stanicama, a količina se povećavala u vremenskom intervalu od 12 sati. Nakon ovog vremenskog intervala, naknadno povećanje u sljedećih 12 sati bilo je samo neznatno, što je iznosilo dodatnih � � % ukupnog unosa. Zanimljivo je da je, kao što je već gore navedeno, učinkovitost preuzimanja mogla biti povećana kada su stanice inkubirane sa kompleksom u prisutnosti 10 % seruma, pri čemu razlika između oba stanja postaje najizraženija nakon 4 sata inkubacije. Nadalje je važno napomenuti da tijekom cijelog razdoblja inkubacije sve stanice pokazuju sposobnost preuzimanja kompleksa, čak i nakon 1 sata, sve stanice populacije pokazuju fluorescenciju povezanu sa stanicama, štoviše, na taj unos ne utječe prisutnost seruma.

Kinetika preuzimanja S-ODN i učinak seruma. Stanice su inkubirane s kompleksima S-ODN –SAINT-2 𠄽OPE označenim FITC-om u naznačenim vremenskim intervalima, bilo u prisutnosti ili u odsutnosti seruma. Nakon opsežnog ispiranja, stanice su sakupljene i fluorescencija povezana sa stanicama (ispunjene šipke, bez tračnica zasjenjenih serumom, u prisutnosti seruma) i broj fluorescentno označenih stanica u populaciji (trokutići i križevi, prisutnost i odsutnost seruma, respektivno) izmjerene su FACS -om. Rezultati su srednje vrijednosti ±SD tri različita pokusa, izvedena u dva primjerka.

Dosad smo provodili svoja istraživanja koristeći S-ODN u očekivanju potencijalne nukleaze posredovane degradacije ODN-a. Kako bi se racionalizirala njegova uporaba, bilo je od interesa ispitati jesu li stanice različito obradile isporuku D-ODN-a, koristeći trenutni sustav nosača. Kao što je prikazano na slici ​ Slika4, 4, čini se da je to zaista tako. Dok se stanični dio tioliranog ODN-a kontinuirano povećavao u ovisnosti o vremenu inkubacije, stanično povezana D-ODN frakcija, iako se povećava s prilično sličnom kinetikom tijekom prva 4 sata inkubacije, kao i ona opažena za S-ODN, brzo smanjila tijekom sljedećih 8 sati inkubacije. Ovi podaci stoga impliciraju da veliki dio ODN postaje izložen mehanizmu koji mora uključivati ​​razgradnju prije istjerivanja stanica unutar 4 i 12 sati nakon početka inkubacije. Kako bismo dodatno ispitali unutarstaničnu obradu, naknadno smo odredili (unutar) staničnu lokalizaciju stanično povezanih kompleksa konfokalnom laserskom skenirajućom mikroskopijom, koristeći fluorescentno označen S-ODN, dok je sam nosač označen izmjenjivom lipidnom sondom N-Rh-PE (19).

Usporedba kinetike obrade D-ODN u odnosu na S-ODN u CHO stanicama. CHO stanice inkubirane su ili s FITC-obilježenim S-ODN-ima ili s Cy5-obilježenim D-ODN-ovima, koje su kompleksirane sa SAINT-2 𠄽OPE. Stanice su inkubirane s tim kompleksima na 37 ଌ različito vrijeme, a fluorescencija povezana sa stanicom mjerena je FACS-om. Količina staničnih S-ODN kontinuirano se povećavala tijekom 24 sata inkubacije (zasjenjene trake). Međutim, D-ODN-i povezani sa stanicama samo su se privremeno povećali, a stanična se frakcija ponovno smanjila nakon 4 sata inkubacije. Rezultati su srednje vrijednosti ±SD tri određivanja.

Prisutnost seruma ne utječe na učinkovitu nuklearnu lokalizaciju S-ODN

CHO stanice inkubirane su s fluorescentno obilježenim (S-ODN i lipidni) kompleksom, pripremljenim u CHO-mediju, 3  h na 37 ଌ u prisutnosti ili odsutnosti seruma. Nakon tog vremenskog intervala, dodan je medij koji sadrži serum, a stanice su dalje inkubirane na 37 ଌ. Nakon 21 h, stanice su opsežno isprane i pregledane izravno ili nakon fiksacije s 2,5 % paraformaldehidom pomoću konfokalne laserske skenirajuće mikroskopije (slika ​ (slika 5). 5). Podaci otkrivaju da, bez obzira na prisutnost seruma u inkubacijskom mediju (početna 3 sata), u biti sve stanice sadrže fluorescenciju, koja je uglavnom lokalizirana u jezgrama. U prisutnosti seruma vrlo malo, ako se fluorescencija nakuplja na staničnoj periferiji (što bi se očitovalo kao neujednačena fluorescencija), što znači da su većinu stanica povezane stanične fluorescencije internalizirale stanice. Internalizirani crveno označeni N-Rh-PE, koji označava nosač lipida, može se razabrati kao fino točkasta fluorescencija, koja se primarno lokalizira u perinuklearnim regijama. Povremeno se opaža određena kolokalizacija (što se odražava žutom bojom) lipida i ODN -a. Imajte na umu da bočno difuzno membransko bojenje N-Rh-PE se ne može otkriti. Perinuklearna lokalizacija odražava prisutnost nosača u endosomalnom i#lizosomskom putu, što je dokazano istaknutom kolokalizacijom (žuto) lizosomskog markera FITC-dekstrana (zeleno), internaliziranom u razdoblju od 12 sati, i N-Rh-označeni (crveni) kompleksi, internalizirani za sljedeći vremenski interval od 4 h (Sl. ​ (Sl. 5C). 5 C). U odnosu na njegovu distribuciju u prisutnosti seruma, nepravilniji izgled N-Rh-PE fluorescencija se opaža u odsutnosti seruma (slika ​ (slika 5A). 5 A). Dakle, za razliku od fino točkastog izgleda u njegovoj prisutnosti, u odsutnosti seruma pojavljuju se velike nakupine koje su često lokalizirane na staničnoj periferiji, vjerojatno odražavajući nesposobnost stanica da internaliziraju takve komplekse. U skladu s tim pojmom, apsolutni unos kompleksa u odsutnosti seruma manji je nego u njegovoj prisutnosti (slika ​ (slika 3). 3). Jasno je da ovo smanjenje ne utječe na konačnu sudbinu internaliziranih S-ODN-ova jer je njegova nuklearna lokalizacija, barem u kvalitativnom smislu, toliko istaknuta kako se opaža u prisutnosti seruma (sl. ​ (sl. 5A 5 A naspram B). Konačno, kada je inkobirana nekompleksirana fluorescentno označena S-ODN u sličnim uvjetima, primijećena je povremena fluorescentna točka u citoplazmi u υ % stanica. jezgra (nije prikazano).

Slike konfokalnog mikroskopa unutarstaničnog uzorka preuzimanja i distribucije S-ODN-a posredovane SAINT-2 𠄽OPE. CHO stanice inkubirane su s kompleksima, pripremljenim od S-ODN označenog sa FITC, i SAINT-2 𠄽OPE, označenog s 1 mol % N-Rh-DOPE, na 37 ଌ tijekom 24 sata u prisutnosti ili odsutnosti 10 % seruma. Slike prikazuju polja živih ćelija u kojima su S-ODN-i prikazani zelenom bojom, dok su vozila SAINT-2 𠄽OPE prikazana crvenom bojom. (A) Distribucija ODN -a i nosača nakon inkubacije u odsutnosti seruma. Obratite pozornost na prisutnost S-ODN u staničnim jezgrama (zeleno), dok je SAINT-2 𠄽OPE bio prisutan kao velike, heterogene točke (crvene) u citoplazmi i na površini stanice. (B) Stanice su inkubirane s kompleksima, pripremljenim kao u (A), u prisutnosti seruma. S-ODN su lokalizirani u jezgri stanice (zeleni), dok je u ovom slučaju nosač SAINT-2 𠄽OPE viđen kao relativno male i homogene točkice (crvene) u citoplazmi, što dovodi do fino-točkaste raspodjele. Imajte na umu da se i u (A) i (B) samo povremeno vide žute točkice koje odražavaju kolokalizaciju fluorescentnog ODN -a i lipida. Perinuklearna lokalizacija crvenog označenog lipidnog nosača (u A i B) najvjerojatnije potječe iz prisutnosti nosača u endosomalnom –lysosomalnom putu. Kad su stanice inkubirane s lizosomskim markerom FITC-dekstranom (zeleno) tijekom 12 sati, nakon čega slijedi inkubacija od 4 sata s kompleksima S-ODN (neoznačenih) i N-Rh-PE –SAINT-2 𠄽OPE (crven u odsutnosti seruma), bila je vidljiva izrazita kolokalizacija lizosomskog markera i SAINT-2 𠄽OPE, što se odrazilo žutom fluorescencijom (C). (D) Kad su kompleksi pripremljeni u prisutnosti 10 % seruma, unutar stanica su se vidjeli samo nedisocirani kompleksi, što se odrazilo na gotovo isključivu pojavu žute fluorescencije.

Samo proteini seruma koji prodiru u lipopleks utječu na lokalizaciju ODN-a

Gore prikazani podaci ukazuju na to da prisutnost seruma u izvanstaničnom mediju može imati dubok utjecaj na veličinu kompleksa, a shodno tome i na učinkovitost internalizacije kompleksa. Osim toga, moguće je da proteini u serumu mogu prodrijeti u različitom stupnju u kompleks, čime utječu na stabilnost kompleksa, a time i na oslobađanje ODN -a. I složena internalizacija i oslobađanje ODN -a iz kompleksa vjerojatno su važni parametri u upravljanju eventualnim antisense učinkom. Tijekom ovih studija primijetili smo da se mogu dobiti različite veličine lipopleksa, ovisno o metodologiji pripreme, kako je navedeno u Materijalima i metodama (vidi odjeljak pod naslovom Priprema kompleksa SAINT-2 𠄽OPE 𠄺ntisense). Tako su pri pripremi u CHO mediju bez seruma dobiveni kompleksi promjera do 1000 nm, što je utvrđeno analizom veličine čestica. Kad su se takvi kompleksi pomiješali u mediju koji sadrži serum unutar 20 minuta nakon pripreme, veličina kompleksa je bila � nm. Zanimljivo je da kada je sklop ODN –lipid kompleksa izveden u puferu (0,9 % NaCl ⼐ mM HEPES), dobivene su čestice promjera samo 80 nm. Nasuprot tome, kada je za sastavljanje kompleksa pufer zamijenjen CHO medijem koji sadrži serum, čime se simulira potencijalni prodor proteina seruma u lipidnu jezgru, veličina kompleksa je bila � � nm. Ono što je važno, u svim uvjetima, lipopleksi su učinkovito sastavljeni, uključujući 㺕 % dodanog ODN -a (nije prikazano). Prilikom dodavanja u stanice i ispitivanja stanične lokalizacije kompleksa, tj. Kako je pripremljeno ili u CHO-mediju, u NaCl –HEPES puferu, ili u CHO mediju koji sadrži serum, uočeno je da je u svim slučajevima osim u jednom očita nuklearna fluorescencija, i bitno se ne razlikuju po izgledu od podataka prikazanih na slici ​. Slika 5A 5 A i B. Izuzetak se odnosio na komplekse koji su sastavljeni u CHO mediju koji sadrži serum. U ovom slučaju, razina fluorescencije povezane sa stanicama bila je slična onoj koja je viđena za komplekse pripravljene u odsutnosti seruma, ali intrigantno, u jezgri nije bila vidljiva fluorescencija. Umjesto toga, prisutna je samo točkasta fluorescencija, raspoređena po citoplazmi, što ukazuje na to da se tijekom inkubacije nije dogodilo niti skupljanje mjehurića niti rast, u skladu s inkubacijama kompleksa sastavljenih u medijima bez seruma, ali inkubiranim sa stanicama u prisutnosti seruma.Tipična citoplazmatska raspodjela i perinuklearna lokalizacija, zajedno s kolokalizacijom nukleotida i lipida, što se reflektira žutom bojom, vjerojatno predstavlja zarobljavanje kompleksa u endosomalnom i#x02013 lizosomskom putu (slika & C#C u odnosu na D ), što znači da nije došlo do disocijacije ODN -a iz kompleksa. U skladu s tim, kao inkubacija s česticama od 80 nm, dobivena pripravljanjem kompleksa u NaCl –HEPES, rezultira učinkovitom isporukom, podaci ukazuju da disocijacija, a ne veličina čestica predstavlja korak ograničenja isporuke ODN -a.

Nakon disocijacije i dolaska u jezgru, konačno smo ispitali je li se tako isporučeni ODN pokazao učinkovitim u prenošenju biološkog odgovora.

Isporuka antisensnih S-ODN-a posredovanih SAINT-2 učinkovito snižava razinu mRNA i proteina CRF-R

Kako bi se odredio kapacitet SAINT-2 𠄽OPE za isporuku ODN-a u farmakološki aktivnim količinama, sposobnost antisense ODN-a usmjerena na CRF-R štakora smanjila je razinu mRNA-e analizom notern blot. CHO stanice inkubirane su 3 sata sa kompleksom, koji se sastoji od 100 nM antisens S-ODN i 20 µM SAINT-2 𠄽OPE u odsutnosti seruma, nakon čega je slijedilo dodavanje 10 % medija koji sadrži serum. Nakon 24 sata inkubacije, stanice su sakupljene, a ukupna RNA ekstrahirana i prenesena na najlonske membrane. Mrlje su prvo ispitane pomoću 32 sonde označene CRF-R s oznakom P, a zatim su uklonjene i ponovno ispitane pomoću 32 sonde GAPDH označene s P. GAPDH je korišten kao interna kontrola za učitavanje RNA. Relativne količine mRNA određene su denzitometrijskim mjerenjem autoradiografa skeniranjem definiranog područja koje obuhvaća točke, koje je bilo isto za sve mrlje, a količina CRF-R mRNA normalizirana je na onu GAPDH mRNA. Korištenje antisense S-ODN kako je primijenjeno dovelo je do smanjenja CRF-R mRNA za � %. Bilo koji antisense slijed (1 i 2, vidi Materijali i metode) pokazao je približno istu učinkovitost. Nije primijećen nikakav učinak kada su stanice tretirane samo antisens S-ODN ili kompleksom koji se sastoji od neusklađenih ODN-ova i SAINT-2 𠄽OPE, naglašavajući specifičnost opaženog učinka. Potonja kontrola također pokazuje da sama smjesa kationskih lipida ne utječe značajno na ekspresiju CRF-R na nespecifičan način, poput utjecaja na staničnu citotoksičnost. To je u potpunosti u skladu s podacima prikazanim na slici ​, slika 2, 2, na kojima je toksičnost izravno nadzirana. Naizgled blago smanjenje aktivnosti vidljivo u traci 9 (sl. ​ (slika 6), 6), u koju su dodani slobodni mjehurići, a ne kompleksi, moglo je stoga biti uzrokovano fluktuacijama viđenim u ekspresiji GAPDH, a ne otrovni učinak amfifila. U svakom slučaju, podaci zajedno s onima koji su prikazani na slici ​ Slika2 2 podržavaju ideju da ODL –lipidni kompleksi pokazuju malu ili nikakvu toksičnost prema stanicama. Tako je SAINT-2 𠄽OPE bio u stanju učinkovito isporučiti antisense ODN-ove u CHO stanice koje eksprimiraju CRF-R i posljedično izazvati snažnu i selektivnu inhibiciju ekspresije gena.

Specifična donja regulacija CRF-R glasničke RNA antisensnim S-ODN-ovima. CHO stanice koje eksprimiraju CRF-R tretirane su lipopleksom pripremljenim od 100 nM S-ODN i 20 µM SAINT-2 𠄽OPE kroz 3 sata (u odsutnosti seruma), a zatim su inkubirane 24 sata u 10 % serumu -medij koji sadrži. Tada je izolirana ukupna RNA, frakcionirana na gelovima od agaroza formaldehida i izbrisana na najlonskoj membrani kako je opisano u materijalima i metodama. Ova membrana je ispitana s 32 P-radioaktivno označenom CRF cDNA (CRF-R), a zatim je ogoljena i ponovno ispitana s 32 P-radioaktivno označenom GAPDH cDNA (GAPDH). GAPDH se koristi kao unutarnja kontrola za učitavanje RNA. Imajte na umu da je smanjenje CRF-R mRNA primijećeno samo kada je antisense ODN isporučio SAINT-2 𠄽OPE (SD). Svaki od gornjih pokusa ponovljen je u dva primjerka i dobiveni su slični rezultati. Korištene su dvije antisense sekvence, antisense 1 i antisense 2 (za sekvence pogledajte Materijali i metode). MAS1 (2) + SD označava rezultate dobivene lipopleksom koji sadrži neusklađen antisens (AS) 1 ili 2. Kao negativna kontrola, CHO stanice bez ekspresije CRF-R tretirane su i analizirane na sličan način (CHO-stanice, bez CRF-R)

Za provjeru posljedica smanjene regulacije mRNA u smislu donje regulacije u ekspresiji receptora po sebi, naknadno smo utvrdili razinu ekspresije CRF-R zapadnim imunoblotom, nakon antisense ODN tretmana. Stanice su inkubirane s kompleksima kako je gore opisano, tj. 100 nM ODN i 20 µM SAINT-2 𠄽OPE u odsutnosti seruma 3 sata, nakon čega je dodan medij koji sadrži serum, a stanice su ostavljene 24 sata . Kompleksi ODN su zatim uklonjeni ispiranjem stanica, te je dodan svježi medij. Nakon još 48 sati, stanične membrane su izolirane, a prisutnost CRF-R je određena kako je opisano u Materijali i metode. Kao što je prikazano na slici 7, 7, značajno smanjenje 㹐 % u CRF-R primijećeno je samo kada su stanice tretirane ili antisens 1 ili antisense 2 ODN, u kompleksu sa SAINT-2 𠄽OPE. Sukladno tome, podaci pokazuju da je isporukom CRF-R antisense posredovanom SAINT-2 𠄽OPE učinkovito snižena i razina mRNA i proteina.

Učinak antisens S-ODN na ekspresiju CRF-R. CRF-R je analiziran zapadnim imunoblotom. CHO stanice koje eksprimiraju CRF-R pod kontrolom CMV promotora tretirane su sa 100 nM S-ODN i 20 µM SAINT-2 𠄽OPE kroz 3 sata u odsutnosti seruma, nakon čega je uslijedila inkubacija od 24 sata u 10 % medij koji sadrži serum. Lipopleksi su uklonjeni ispiranjem i dodan je svježi medij sa serumom. Nakon još 48 sati, stanične membrane su izolirane, proteini su odijeljeni na PAGE, ispitani s kozjim anti-štakornim CRF-R, a zatim sa zečjim protutijelom konjugiranim alkalnom fosfatazom. Smanjenje CRF-R primijećeno je samo kada je antisense ODN isporučio SAINT-2 𠄽OPE (antisense 1 i 2). MAS predstavlja tretman s neusklađenim antisensom 1 i 2. Svaki od gornjih pokusa ponovljen je u dva primjerka, a dobiveni su slični rezultati.


Optimizacija transfekcije posredovana kationskim lipidima za posude od 150 mm - Biologija

Ovo je podjela prijave Ser. 08/220,376, podnesenom 29. ožujka 1994., sada patent br. 5,651,981.

1. Agregat liposom-lijek koji sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina i jedan ili više liposoma, pri čemu svaki liposom sadrži jedan ili više kationskih fosfolipida koji imaju strukturu: ## STR10 ## gdje R1 je H ili C1 do otprilike C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanci po izboru supstituirani s karbocikličkim, aromatskim ili heterocikličkim dijelom,

R2 je H ili C10 do otprilike C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanci po izboru supstituirani s karbocikličkim, aromatskim ili heterocikličkim dijelom,

R3 je vodik ili metil,

R4 je q do približno C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanac po izboru supstituiran s karbocikličkim, aromatskim ili heterocikličkim dijelom, ili R4 je C1 do otprilike C6 ester ravnog ili razgranatog lanca, aldehid, keton, eter, haloalkil, azidoalkil ili tetraalkilamonij,

pod uvjetom da R1 i R2 nisu oba H i da kada je R1 H, s je 0, te da kada je R2 H, t je 0, i dalje pod uvjetom da R4 nije alkenil ili alkinil supstituiran s fenil.

2. Agregat liposom-lijek koji sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina i jedan ili više liposoma, pri čemu svaki liposom sadrži jedan ili više kationskih fosfolipida koji imaju strukturu: ## STR11 ## R1 i R2 neovisno su H ili C1 do otprilike C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanci po izboru supstituirani s karbocikličkim aromatima ili heterocikličkim dijelom,

R3 je vodik ili metil,

R4 je C1 do otprilike C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanac po izboru supstituiran s karbocikličkim aromatskim ili heterocikličkim dijelom, ili R4 je C1 do otprilike C6 ester ravnog ili razgranatog lanca, aldehid, keton, eter, haloalkil, azidoalkil ili tetraalkilamonij,

R5 je H ili C1 do otprilike C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanci po izboru supstituirani s karbocikličkim aromatskim ili heterocikličkim dijelom.

3. Agregat liposom-lijek prema zahtjevu 1, naznačen time što je heterociklički dio odabran iz skupine koju čine danzil, nitrobenzofurazan i 1,6 difenil-1,3,5-heksatrien.

4. Agregat liposom-lijek prema zahtjevu 2, naznačen time što je heterociklički dio odabran iz skupine koju čine dansil, nitrobenzofurazan i 1,6 difenil-1,3,5-heksatrien.

5. Postupak liječenja bolesti povezane s patogenom, naznačen time, da se sastoji od davanja terapeutski učinkovite količine agregata lijeka liposoma prema zahtjevu 1, naznačen time što lijek inhibira bitnu mataboličku ili reproduktivnu funkciju patogena.

6. Postupak liječenja bolesti povezane s patogenom, naznačen time, da se sastoji u primjeni terapeutski učinkovite količine agregata liposoma-lijeka prema zahtjevu 2, naznačen time, da lijek inhibira bitnu mataboličku ili reproduktivnu funkciju patogena.

Pozadina izuma

Ovaj se izum odnosi na nove kationske fosfolipide i metode za njihovu proizvodnju. Ovaj izum se također odnosi na nove liposome i agregate koji sadrže fosfolipide ovog izuma koji su korisni za isporuku nukleinskih kiselina i lijekova stanicama, in vitro i in vivo. Ovaj se izum također odnosi na liječenje bolesti genskim terapeuticima koji uključuju transfekciju s DNA i uvođenje antisensnih nukleotida u stanice, kao i stabilnu transfekciju s DNA projektiranom da se uključi u genom živih stanica.

2. Opis povezane umjetnosti

Uvođenje stranih nukleinskih kiselina i drugih molekula vrijedna je metoda za manipulaciju stanicama i ima veliki potencijal i u molekularnoj biologiji i u kliničkoj medicini. Za umetanje endogenih nukleinskih kiselina u eukariotske stanice korištene su mnoge metode. Na primjer, Graham i Van der Eb, Virology 52, 456 (1973) (ko-taloženje DNA s kalcijevim fosfatom) Kawai i Nishizawa, Mol. Stanica. Biol. 4, 1172 (1984) (polikacija i DMSO) Neumann i sur., EMBO Journal 1, 841 (1982) (elektroporacija) Graessmann i Graessmann u tehnikama mikroinjekcije i transplantacije organela, str. 3-13 (Cells et al., Eds. , Academic Press 1986.) (mikroinjekcija) Cudd i Nicolau u tehnologiji liposoma, str. 207-221 (G. Gregoriadis, ur., CRC Press 1984.) (liposomi) Cepko i sur., Ćelija 37, 1053 (1984.) (retrovirusi) i Schaffner, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 77, 2163 (1980) (fuzija protoplasta). Dokazana je i prolazna i stabilna transfekcija gena.

Neki od prvih radova na liposomskoj isporuci endogenih materijala stanicama dogodili su se prije dvadesetak godina. Strane nukleinske kiseline uvedene su u stanice (Magee i sur., Biochim. Biophys. Acta 451, 610-618 (1976), Straub i sur., Infekt. Imun. 10, 783-792 (1974)), kao i strani lipidi (Martin i MacDonald, J. Cell Biol. 70, 515-526 (1976)), Proteini (Magee i sur., J. Cell. Biol. 63, 492 (1974), Steger i Desnick, Biochim. Biophys. Acta 464,530 (1977)), fluorescentne boje (Leventis i Silvius) i lijekove (Juliano i Stamp, Biochem. Pharm. 27, 21-27 (1978), Mayhew i sur., Cancer Res. 36, 4406 (1976), Kimelberg, Biochim. Biophys. Acta 448, 531 (1976)), svi koriste pozitivno nabijene lipide.

Od mnogih metoda koje se koriste za olakšavanje ulaska DNK u eukariotske stanice, kationski liposomi su među najučinkovitijima i našli su široku uporabu kao nositelji DNA u eksperimentima transfekcije. Vidi općenito Thierry i sur. u Regulacija gena: Biologija antisense RNA i DNA, str. 147 (Erickson i Izant, ur., Raven Press, New York, 1992.) Zagrljaj i uspavanost, Biochim. Biophys. Acta 1097, 1 (1991) i Nicolau i Cudd, Crit. Ther. Drug Carr. Sys. 6, 239 (1989) Proces transfekcije pomoću liposoma naziva se lipofekcija. Senior i sur., Biochim. Biophys. Acta 1070, 173 (1991) sugerira da je ugradnja kationskih lipida u liposome povoljna jer povećava količinu negativno nabijenih molekula koje se mogu povezati s liposomom. U svojoj studiji interakcije između pozitivno nabijenih liposoma i krvi zaključili su da se štetne nuspojave povezane s makroskopskom agregacijom liposoma i plazme mogu izbjeći ograničenjem doziranja kod ljudi.

Felgner i sur., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 84, 7413 (1987), pokazalo je da liposomi dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) i sintetski kationski lipid N- 1- (2,3-dioleiloksi) propil! -N, N, N-trimetilamonijev klorid (DOTMA) mogu oboje prolazna i stabilna transfekcija DNA. Rose i sur., BioTechiques 10, 520 (1991.), testirali lipofekciju liposomima koji se sastoje od DOPE i jednog od kationskih lipida cetildimetiletilamonijevog bromida (CDAB), cetiltrimetiletilamonijevog bromida (CTAB), dimetildioktadecilammonijevog bromida (DDA), (DDA) stearilamin. Svi liposomi (osim onog s CTAB -om) uspješno su transficirali DNA u HeLa stanice. U visokim koncentracijama, međutim, CDAB i MBC uzrokovali su lizu stanica. Utvrđeno je da je samo DDAB učinkovit u posredovanju učinkovite transfekcije DNA u niz drugih staničnih linija. Malone i sur., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 86, 6077 (1989), uspješno transfektiranu RNA, in vitro, u veliki broj staničnih linija. Zhou i Haung, J. kontrolirano izdanje 19, 269 (1992), otkrili su uspješnu lipofekciju DOPE liposomima stabiliziranim u lamelarnoj fazi kationskim kvarternim amonijevim deterdžentima. Autori su međutim primijetili da bi relativno visoka citotoksičnost ovih spojeva ograničila njihovu upotrebu in vivo.

Hawley-Nelson i sur., Focus 15, 73 (1990, BRL publikacije), otkrili su kationski lipid "LIPOFECTAMINE", reagens koji sadrži 2,3-dioleiloksi-N-2 (sperminkarboksiamido) etil! -N, N-dimetil- 1-propanamini u trifluoroacetatu (DOSPA). Utvrđeno je da "LIPOFECTAMINE" ima veću transfekcijsku aktivnost od nekoliko monokacijskih lipidnih spojeva ("LIPOFECTIN", "LIPOFECTACE" i DOTAP) u šest od osam testiranih tipova stanica. Opazili su toksičnost kada su i lipid i DNA bili uključeni u istu smjesu.

Farhood et al., Biochim. Biophys. Acta 1111, 239 (1992) i Gao i Huang, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991), otkrivaju kationske derivate kolesterola kao komponente liposoma sposobne transficirati stanice in vitro.

Liposomi koji sadrže kationske lipide također se mogu naći kao nositelji za gensku terapiju u aplikacijama in vivo. Neke od prvih in vivo primjena isporuke endogenih materijala putem liposoma pokazane su prije dvadeset godina. Vidi, npr., Straub i sur., Gore, i Magee i sur., Gore, (nukleinske kiseline) i Mayhew i sur., Gore (lijekovi).

Holt i sur., Neuron 4, 203 (1990), opisuju DOTMA dioleoksilfosfatidiletanolamin liposom koji je uspješno transficirao vektor koji eksprimira cDNA luciferaze u embrionalni mozak Xenopusa in vivo.

Malone, Focus 11, 4 (1989., BRL publikacije), izvijestio je o istoj studiji na živčanom tkivu Xenopus kao i Ono i sur., Neurosci. Lett. 117, 259 (1990), u mozgu miša.

Brigham i sur., Am J. Med. Sci. 298, 278 (1989), otkrivena intravenozna injekcija "LIPOFECTIN" i plazmida kloramfenikol acetil transferaze (CAT) u pluća miša.

Nabel i sur., Science 249, 1285 (1990), izvijestili su o ekspresiji gena β-galaktozidaze u specifičnom arterijskom segmentu in vivo u svinja Yucatan transfekcijom DNA kationskim liposomima. Lim i sur., Circulation 83, 2007 (1991), otkrili su in vivo prijenos gena reporterskih gena (β-galaktozidaza i luciferaza) u arterije pasa pomoću kationskih liposoma.

Hazinski, Sem. Perinatol. 16, 200 (1992) otkrivaju kationski liposom posredovani prijenos gena fuzijskog reportera u epitelne stanice i prolaznu ekspresiju proteina izravnim ubrizgavanjem otopine DNA-liposoma u dušnik.

Yosimura i sur., Nukleinske kiseline Res. 20, 3233 (1992) pokazali su uspješnu in vivo lipofekciju gena za regulaciju trans-membranske provodljivosti cistične fibroze (CFTR) u epitel dišnih putova miševa koristeći kationski liposom "LIPOFECTIN". Hyde i sur., Nature 362, 250 (1993.), također su otkrili lipofekciju CFTR pomoću "LIPOFECTINA". Pokazali su uspješnu isporuku gena u epitel dišnih putova i u alveole duboko u plućima transgenih miševa.

Prijavljeno je nekoliko kationskih amfifila kao agensa transfekcije. Ballas i sur., Biochim. et Biophys. Acta 939, 8 (1988.), izvijestio je o uspješnoj lipofekciji RNA virusa mozaika duhana u protoplaste duhana i petunije putem liposoma sastavljenih od fosfatidilkolina (PC), kolesterola i hidroksilnog oblika kvarternog amonijevog deterdženta diizobutilkresoksietoksietildimetilbenzilammonija (DEBDA). Liposomi koji nemaju kvarterni amonijev deterdžent praktički nisu uspjeli transficirati RNA. Ono što je važno, Ballas i sur. također je primijetio da se RNK i DNK kompleksiraju s liposomima koji nose DEBDA OH -! bili su visoko rezistentni na dodane RNAze i DNAze.

Pinnaduwage i sur., Biochim. et Biophys. Acta 985, 33 (1989), otkrila je lipofekciju pSV2 CAT plazmidne DNA u mišićne L929 fibroblaste koristeći ultrazvučne liposome koji sadrže DOPE i kvarterni amonijev deterdžent (dodecil-, tetradecil- ili cetil-trimetilamonijev bromid). Pinnaduwage i sur. imajte na umu da je veliki nedostatak korištenja jednolančanih amfifila, poput deterdženata za isporuku lijeka, njihova toksičnost.

Taylor i sur., Nukleinske kiseline Res. 20, 4559-4565 (1992) uspješno transficirani-i RNK ribozimi i himerni RNA-DNA ribozimi s "LIPOFECTINOM".

Leventis i Sivius, Biochim. et Biophys. Acta 1023, 124 (1990), otkrilo je nekoliko kationskih amfifila na bazi hidrofobnog dijela kosterila ili dioleoilglicerila čiji su hidrofobni i kationski dijelovi povezani esterskim vezama, što bi trebalo olakšati razgradnju u stanicama životinja. Leventis i Sivius pokazali su uspješnu lipofekciju plazmida pSV2 CAT u stanice CV-1 i 3T3 korištenjem liposoma koji sadrže kationske amfifile 1,2-dioleoil-3- (4'-trimetilamonio) butanoil-sn-glicerol (DOTB), DOTAP i kolesteril ( 4'-trimetilamonio) butanoat (ChoTB).

Duzgunes i Felgner, Metode u enzimologiji 221, 303 (1993.), opisuju metode transfekcije nukleinskih kiselina. Uče da je pri pripremi kompleksa DNK i "LIPOFECTINA" za transfekciju poželjan neto pozitivan naboj, a odgovarajući omjer težine lipida i nukleinske kiseline je oko 4-10. Upozoravaju, međutim, da je potrebno poduzeti optimizaciju za svaku staničnu liniju koja se transformira.

Točan način interakcije nukleinskih kiselina i fosfolipida (i drugih amfifila) i struktura nastala prije i tijekom procesa transfekcije nije dobro shvaćena.Uobičajeno se kaže da su nukleinske kiseline zarobljene unutar lipidnog dvosloja, što je klasična definicija "liposoma". Također postoji uvjerenje da se nukleinska kiselina ne zarobljava, već tvori neku drugu vrstu agregata s fosfolipidima. Vidi, npr. Smith i sur., Biochim. Biophys. Acta 1154, 327 (1993), za nekoliko modela interakcije lipida/nukleinske kiseline. Maccarrone i sur., Biochem. Biophys. Res. Comm. 186, 1417 (1992), otkriveno je da je veličina i oblik agregata liposom-DNA funkcija odnosa omjera količine DNK i fosfolipida. Zaključili su da se DNK veže na vanjsku površinu liposoma, koji se zatim grupiraju u nepravilne sferne agregate. Također su primijetili da duljina plazmida nije utjecala na vezivanje za liposome. Gershon i sur., Biochem. 32, 7143-7151 (1993) ispitivali su fluorescenciju etidij bromida u prisutnosti DOTMA i DNA. Uočili su nagli pad njegove fluorescencije kada se DNK/etidij bromid titrira s DOTMA -om do točke gotovo električne neutralnosti. Elektronska mikroskopija kompleksa otkrila je naglu kondenzaciju DNA na mjestu neutralnosti. Iz ovih je pokusa očito da se, barem za DOTMA, ali vjerojatno i za većinu kationskih lipida, struktura kompleksa mijenja pri neutralnosti naboja, a istodobno se DNA vrlo kompaktno organizira u strukturu koja se očito dosta razlikuje od vezikularni liposom. Legendre i Szoka, Pharm. Res. 9, 1235 (1992), proučavali in vitro lipofekciju pomoću DOTMA: DOPE liposoma i zaključili da liposom vjerojatno koristi najmanje dva puta za uvođenje DNA u stanice: fuziju s plazma membranom i endocitozu.

Treba priznati da su gotovo svi do sada opisani spojevi u literaturi kao "kationski lipidi" zapravo kationski amfifili ili kationski deterdženti. Izraz "lipid" odnosi se na prirodni proizvod. Većina lipida sadrži masne kiseline kao svoju glavnu hidrofobnu komponentu, iako neki (poput kolesterola, sfingolipida i poliizoprenoida) imaju druge hidrofobne strukture.

Smjese reagensa fosfatidiletanolamina (PE) s DOTMA ili dioktadecildimetilamonijevim bromidom (DDMB) komercijalno su dostupne (npr. Iz Promege). Reagensi za transfekciju na bazi DOTMA skupi su zbog sintetičke složenosti kationskog lipida, dok su jednostavni deterdženti jeftini, ali zahtijevaju razrjeđivanje kationskih vrsta s relativno skupim PE. Obje pokazuju značajnu citotoksičnost (osobito spojevi s jednim lancem). Uzroci citotoksičnosti nisu jasni, ali poteškoće ili nemogućnost metabolizma ovih materijala mogu samo pogoršati ovaj problem tijekom dugotrajne uporabe. Citotoksičnost nije hitan problem za postupke prolazne transfekcije, ali se mora riješiti prije upotrebe liposomske transfekcije u terapijskim primjenama. Posljedično, poželjni su jeftiniji, sigurniji i učinkovitiji lipidi korisni u tehnologiji lipofekcije.

Kao što je dalje opisano u nastavku, ovaj izum daje nove spojeve koji imaju te atribute. Ova nova klasa spojeva obuhvaća derivate fosfoglicerida s modificiranom fosfodiesterskom vezom, pri čemu se kisik koji se ne premošćuje alkilira, čime nastaje fosfatni test. Tako alkilirajući fosfatni dio, eliminira se negativan naboj na kisik.

Zabilježene su metilacije fosfodiesterskih veza za proizvodnju P (O) -metilnih derivata. Renkonen, Biochim. et Biophys. Acta 152, 114 (1968). Iako se tretmanom fosfatidilkolina (PC) diazometanom dobiva dimetil fosfatidna kiselina uz gubitak ostatka kolina, 0-metil fosfatidilholinij je izoliran s malim prinosom iz ove reakcije u prisutnosti trietilammonijevog hidroklorida kao donatora protona. Međutim, diazometan na pripremnoj ljestvici iznimno je opasan, a broj lako dostupnih diazoalkana ograničen je. Također primjećujemo da je metil fosfatidilholinij relativno nestabilan. Stoga je poželjnija učinkovitija metoda za proizvodnju derivata fosfatidilkolina.

Ovdje otkrivamo novu klasu kationskih fosfolipida koji su sposobni stvarati liposome. Fosfolipidi ovog izuma potječu od roditeljskih fosfogliceridnih spojeva koji imaju strukture: gdje su jedan ili oba od R1 i R2 tipično ugljikovodični lanci s 1 do oko 24 ugljika, izborno supstituirani s dansilom, NBD (nitrobenzofurazan), DPH (1,6-difenil-1,3,5-heksatrien), karbociklička skupina ili heterociklički dio, s i t su neovisno 0 ili 1, R3 je vodik ili metil, a n je 0, 1 , 2 ili 3. U poželjnoj izvedbi ovog izuma, roditeljski fosfogliceridni spoj se prirodno pojavljuje. U posebno poželjnom ostvarenju, spoj je fosfatidilkolin.

Novi fosfolipidi ovog izuma dobiveni alkiliranjem gore navedenih spojeva reaktanata imaju sljedeću strukturu: ## gdje sve gore opisane definicije za matični spoj drže, R4 je izborno supstituiran C1 do otprilike C24 lanac ugljikovodika.

Ovi su lipidi privlačni iz više razloga. Prvo smo otkrili da su liposomi i agregati koji sadrže ove kationske fosfolipide učinkoviti u transfekciji nukleinskih kiselina, čija je učinkovitost usporediva s učinkovitošću uobičajenog komercijalnog proizvoda "LIPOFECTIN". Drugo, većina fosfolipida ovog izuma lako se izrađuje od jeftinih i lako dostupnih početnih materijala u sintezi u jednom koraku. I na kraju, većina fosfolipida ovog izuma potječe od prirodnog roditeljskog spoja, čime se osigurava sredstvo za stanični metabolizam i minimizira citotoksičnost ovih spojeva pod kroničnom primjenom.

Također otkrivamo spojeve nastale iz sfingofosfolipida, fosfolipide koji imaju polarnu skupinu fosforilkolina, identičnu onoj fosfatidilkolina, ali s ceramidom umjesto dialkilglicerola u hidrofobnom dijelu molekule. Sfingofosfolipidi su alkilirani na isti način kao i gore razmotreni fosfogliceridi, pri čemu nastaju odgovarajući spojevi kolinija. Opća struktura sfingofosfolipida je: ## STR3 ## gdje je R5 je masna kiselina ili srodna karboksilna kiselina iste vrste kao R1, gore. Alkilacija je na istom položaju (na fosfatnom kisiku) kao i u fosfogliceridima.

Također predstavljamo novu metodu sinteze kationskih fosfolipida ovog izuma. Preferirana metoda obuhvaća alkiliranje roditeljskog fosfolipidnog spoja (koji ima gore definiranu strukturu) dovođenjem u kontakt s R4 -trifluormetansulfonatom (triflat) u prikladnom otapalu, gdje je R4 gore definiran. U poželjnoj izvedbi, otapalo je eter. Ova je metoda jeftina i laka, djelomično zbog široke dostupnosti i niske cijene mnogih roditeljskih fosfolipidnih spojeva (npr. Sfingofosfolipidi i fosfogliceridi), jednostavne sinteze alkil triflata i brze reakcije koja se događa na ili u blizini sobna temperatura. U poželjnoj izvedbi ovog izuma, osnovni fosfolipidni spoj je fosfatidilkolin, koji se može dobiti iz žumanjka, drugih prirodnih izvora ili sintetizirati.

Zajedno s općom dostupnošću matičnog fosfolipida, ova metoda sinteze pruža širok spektar derivata fosfonija koji imaju polarne skupine glava i bočne lance lipida koji se razlikuju po svojim steričkim i elektroničkim svojstvima, osobito hidrofobnosti i hidrofilnosti. Stoga postupci i spojevi ovog izuma u osnovi omogućuju podešavanje svojstava fosfolipida u gotovo svako željeno stanje.

Ovaj izum također pruža poboljšane metode transfekcije korištenjem fosfolipida ovog izuma. Koristeći standardne tehnike, nukleinske kiseline mogu se transficirati u stanice, in vitro ili in vivo, s visokom učinkovitošću. Ovaj izum nadalje osigurava poboljšane metode isporuke lijeka.

Ovaj izum također pruža poboljšane metode liječenja pacijenata koji imaju bolesti ili tegobe podložne liječenju nukleinskim kiselinama, oligonukleotidima ili lijekovima. Takve bolesti uključuju one koje proizlaze iz infekcije patogenom, u kojem slučaju liječenje može obuhvaćati primjenu antisens oligonukleotida usmjerenog na endogenu nukleinsku kiselinu unutar patogena koja je bitna za razvojnu, metaboličku ili reproduktivnu funkciju patogena ili isporukom droga. Druge bolesti uključuju one koje proizlaze iz nedostatka DNK. Takav nedostatak može biti nedostatak esencijalne DNK ili mutacija (kao što je brisanje, promjena ili dodavanje jednog ili više nukleotida) što rezultira nedovoljnom ili prekomjernom ekspresijom gena ili ekspresijom abnormalnog proteina. U takvom slučaju, liječenje može uključivati ​​lipofekciju normalne nukleinske kiseline.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Sl. Slika 1 prikazuje sintetičku metodu za alkiliranje fosfoglicerida za proizvodnju O-supstituiranih derivata.

Sl. 2 je autoradiogram koji prikazuje rezultate testa na kloramfenikol acetiltransferazu ekstrakata L stanica i Rcho-1 stanica transficiranih s RSV-CAT DNA.

Sl. 3 prikazuje rezultate CAT testa relativne učinkovitosti transfekcije NBD-EtPC +.

DETALJAN OPIS IZUMA

Ovaj izum pruža nove kationske fosfolipide, liposome koji sadrže te fosfolipide, agregate nukleinske kiseline liposoma, metode za transfekciju nukleinskih kiselina in vitro i in vivo koji obuhvaćaju kontaktiranje stanice ili stanica s agregatima liposom-nukleinska kiselina, te metode za liječenje bolesti koje proizlaze iz infekcije ili nedostatak DNA koji se može liječiti in vivo isporukom nukleinskih kiselina.

U prvom aspektu ovog izuma, opisani su novi kationski fosfolipidi. Ovi kationski fosfolipidi mogu tvoriti liposome i transficirati nukleinske kiseline u stanice. Atraktivna značajka ove klase spojeva je ta što se mogu sintetizirati iz jeftinih, lako dostupnih matičnih fosfogliceridnih spojeva. Ovi fosfogliceridni spojevi imaju sljedeću strukturu: gdje su R1 i R2 neovisno H ili C1 do otprilike C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanci po izboru supstituirani s dansilnim, NBD, DPH, karbocilkličnim aromatskim ili heterocikličkim dijelom,

R3 je vodik ili metil,

pod uvjetom da R1 i R2 nisu oba H i da kada je R1 H, s je 0, i da kada je R2 H, t je 0.

U poželjnoj izvedbi ovog izuma, roditeljski fosfogliceridni spoj nastaje prirodno ili se lako dobiva iz spoja koji se prirodno pojavljuje. U posebno poželjnoj izvedbi, osnovni fosfogliceridni spoj je fosfatidilkolin. Fosfatidilkolin je izuzetno jeftin i lako se može dobiti iz žumanjka.

Novi fosfolipidi ovog izuma dobiveni iz gore navedenih reaktantnih spojeva imaju sljedeću strukturu:#gdje se sve gore opisane definicije za matični spoj drže, R4 je C1 do otprilike C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanci po izboru supstituirani s dansilnim, NBD, DPH, karbocilkličnim aromatskim ili heterocikličkim dijelom, ili R4 je C1 do otprilike C6 ester ravnog ili razgranatog lanca, aldehid, keton, eter, haloalkil, azidoalkil ili tetraalkilamonij.

Kako se ovdje koristi, izraz "alkenil" odnosi se na dio koji ima od 1 do 6 dvostrukih veza. "Alkinil" se odnosi na dio koji ima 1 ili 2 trostruke veze. "Razgranati lanac" ima od 1 do 4 razgranate metile i do 2 ciklopropilne skupine. "Karbociklički aromatski" ima do 4 prstena, koji mogu biti spojeni ili spiro, i 5 ili 6 atoma ugljika po prstenu. "Heterociklički dio" znači 1 do 3 prstena s 5 ili 6 atoma u prstenu ili prstenovima i do 2 kisika ili dušika po prstenu.

U poželjnoj izvedbi, spoj je derivat fosfotriestra spoja koji se prirodno javlja. U posebno preferiranoj izvedbi, spoj je derivat fosfatidilkolina iz fosfotriesta. U drugom poželjnom ostvarenju, spoj je etilfosfotriesterski derivat fosfatidilkolina. U još jednoj poželjnoj izvedbi, R1 ili R2 je NBD supstituirani C6 -C12 alkil. Kao što je dolje detaljnije opisano, pripremili smo niz ovih spojeva.

Druga skupina novih kationskih fosfolipida potječe iz klase sfingofosfolipidnih spojeva koji imaju opću strukturu: gdje je R5 masna kiselina ili srodna karboksilna kiselina iste strukture kao R1, gore. Sfingofosfolipidi su alkilirani na isti način kao i fosfogliceridni spojevi. Alkilna skupina dodaje na isti položaj na fosfatnom kisiku kao i na fosfogliceridima dajući: ## STR7 ##

Kao što će dolje biti detaljnije opisano, pronađeno je da su ti kationski fosfolipidi ovog izuma učinkovita sredstva za transfekciju nukleinskih kiselina i lijekova.

U drugom aspektu ovog izuma, otkrivena je nova metoda sinteze gore spomenutih fosfolipida. Sintetska metoda ovog izuma uključuje miješanje R4 supstituiranog trifluormetansulfonata (triflata) s matičnim fosfogliceridom ili sfingofosfolipidom u prikladnom otapalu, gdje R4 je C1 do otprilike C24 ravni ili razgranati alkilni, alkenilni ili alkinilni lanci po izboru supstituirani s dansilnim, NBD, DPH, karbocililnim aromatskim ili heterocikličkim dijelom, ili R4 je C1 do otprilike C6 ester ravnog ili razgranatog lanca, aldehid, keton, eter, haloalkil, azidoalkil ili tetraalkilamonij. Pod prikladnim otapalom podrazumijeva se bilo koje otapalo sposobno otapati obje vrste reaktanata, a koje samo ne prolazi kemijsku reakciju s polaznim materijalima, međuproduktima ili proizvodima. Odgovarajuća otapala bit će prepoznata ili će ih stručnjaci u području moći rutinski odrediti. U poželjnoj izvedbi, otapalo je dietil eter. Reakcija se brzo odvija na sobnoj temperaturi dajući gotovo trenutno gornje fosfolipide. Proizvodi se tada mogu pročistiti na bilo koji prikladan način. Poželjna metoda pročišćavanja je jednostavna šaržna kromatografija na SiO2.

U neutralnim uvjetima, reakcija se odvija prijenosom supstituenta triflata u kisik koji ne premošćuje fosfat kako bi nastao fosfotriester. U prisutnosti sterički otežane baze (na primjer, kolidina) i kada je R3 vodik, bit će supstituirani i fosfatni kisik i etanolaminov dušik. Vidi Sl. 1.

Poželjna metoda ovog izuma uključuje reakciju eterične otopine matičnog spoja fosfoglicerida s alkil-trifluorometansulfonatom. Rezultat je gotovo trenutna, čista konverzija u supstituirani derivat fosfotrijestra matičnog spoja fosfoglicerida u obliku soli triflata. Pročišćavanje se zatim vrši jednostavnom serijskom kromatografijom na SiO2, koji daje čisti alkilfosfolipidni trister s 85% izoliranim prinosom na ljestvici od 1 grama. U poželjnoj izvedbi, alkilna skupina je etilni dio.

Supstituirani triflati lako se dobivaju prema sljedećoj reakciji ## STR8 ## Anhidrid triflica dostupan je, na primjer, od Alricha®.

Koristeći metode ovog izuma, proveli smo sljedeće sinteze: ## STR9 ##

______________________________________
Cmpd Cmpd proizvod # reaktant # (R 4)
______________________________________

1 R 1 = R 2 = C17 H33
2 CH3
3 CH2 CH3
10 (CH2)6 Br
11 (CH2)6 N3
4 R1 = R2 = C11 H23
7 CH2 CH3
5 R.1 = C17 H33
8 CH2 CH3
R2 = CH3
9 CH2 CH3
______________________________________

gdje je t = s = 1, n = 3 i R3 = CH3. Spojevi 10 i 11 pripravljeni su na -78 ° C. Funkcionalne skupine u spojevima 10 i 11 mogu se modificirati kako bi se omogućila konjugacija kationskog lipida s drugim molekulama.

Dostupnost i prirodnih i sintetskih fosfolipida, zajedno s širokom dostupnošću alkil triflata, pruža jedinstven put do sinteze raznolikog niza kationskih lipida. To bi trebalo pružiti mogućnost podešavanja molekularnih i bioloških svojstava transfekcijskog reagensa te pružiti sredstvo za ispitivanje molekularne osnove transfekcije na bazi lipida. Konačno, osnova kationskog lipida u prirodnom fosfolipidnom kosturu osigurava slabljenje dugotrajne citotoksičnosti putem metaboličke transformacije spoja u prirodni proizvod.

Iako je poželjna metoda za dobivanje spojeva ovog izuma opisana novom metodom triflata, stručnjaci će prepoznati da se mogu koristiti i druge metode sinteze priznate u tehnici. Na primjer, druga sredstva za alkiliranje koja se mogu koristiti uključuju alkil jodide, alkil tozilate, dialkilsulfate i trialkil oksonij gdje je anion BF4 - .

Zbog svojih jedinstvenih steričkih i elektroničkih svojstava, modificirani kationski fosfolipidi sintetizirani prethodnim metodama stvaraju novu klasu liposoma koji su vrlo učinkoviti u lipofekciji nukleinskih kiselina. Kako se ovdje koristi, izraz "liposom" znači obuhvatiti sve sastave fosfolipida (i/ili drugih amfifila) koji se agregiraju u vodenoj otopini, uključujući micele, kao i kubične i heksagonalne faze.

Liposomi ovog izuma sadrže jedan ili više fosfolipida ovog izuma. Liposomi prema izumu izborno imaju jednog ili više drugih amfifila. Točan sastav liposoma ovisit će o posebnim okolnostima u kojima će se koristiti. Običnim stručnjacima bit će rutinska stvar odrediti odgovarajući sastav. Liposomi ovog izuma sadrže najmanje jedan fosfolipid ovog izuma. U poželjnoj izvedbi, liposomi ovog izuma sastoje se u osnovi od jedne vrste fosfolipida prema izumu. U drugoj poželjnoj izvedbi, liposomi sadrže smjese spojeva prema ovom izumu. U još jednoj poželjnoj izvedbi, liposomi ovog izuma sadrže jedan ili više fosfolipida ovog izuma u smjesi s jednim ili više prirodnih ili sintetskih lipida, npr. Kolesterolom. U još jednoj poželjnoj izvedbi, liposomi se sastoje u biti od etil fosfotriesterskog derivata fosfatidilkolina. Rutinska je stvar, pomoću tehnika dobro poznatih u struci, odrediti odgovarajući i optimalan omjer komponenti u kojima se koriste smjese fosfolipida.

Liposomi su izgrađeni dobro poznatim tehnikama. Na primjer, Liposome Technology, Vols. 1-3 (G. Gregoriadis, ur., CRC Press, 1993.) Lipidi se tipično otapaju u kloroformu i raspršuju u tankom filmu po površini epruvete ili tikvice rotacijskim isparavanjem. Ako se žele liposomi koji se sastoje od smjese lipida, pojedinačne komponente se pomiješaju u izvornoj otopini kloroforma. Nakon uklanjanja organskog otapala, dodaje se faza koja se sastoji od vode po izboru koja sadrži pufer i/ili elektrolit i posuda se miješa da suspendira lipid.Suspenzija se zatim podvrgava ultrazvuku, bilo u ultrazvučnoj kupelji ili sondiranjem sondom, sve dok se čestice ne smanje u veličini i suspenzija ne dobije željenu jasnoću. Za transfekciju, vodena faza je tipično destilirana voda, a suspenzija je ultrazvučno obrađena do gotovo bistre boje, što zahtijeva nekoliko minuta ovisno o uvjetima, vrsti i kvaliteti sonikatora. Obično su koncentracije lipida 1 mg/ml vodene faze, ali lako mogu biti faktor deset veći ili manji.

U trećem aspektu izuma, osigurana je nova metoda lipofekcije koja uključuje stanice koje dolaze u dodir za transformaciju s otopinom agregata liposom-nukleinska kiselina. Agregati liposomske nukleinske kiseline mogu se pripraviti dodavanjem odgovarajuće količine nukleinske kiseline u otopinu liposoma. Za transfekciju, težinski omjer kationskog lipida prema DNA je od nešto više od 1: 1 do možda 10: 1. Količina DNA može znatno varirati, ali je normalno nekoliko do nekoliko desetaka mikrograma po standardnoj staničnoj posudi s kulturama. Uvjeti se mogu uvelike razlikovati, a rutinska je stvar i standardna praksa optimizirati uvjete za svaku vrstu ćelije, kako preporučuju dobavljači komercijalnih materijala. Optimizacija uključuje mijenjanje omjera lipida i DNA, kao i ukupne količine agregata.

Kao što je napomenuto, trenutno postoji izvjesna neizvjesnost u pogledu točnog načina interakcije nukleinskih kiselina i fosfolipida (i drugih amfifila). Osim toga, ni struktura nastala prije i tijekom procesa transfekcije također nije definitivno poznata. Ovaj izum, međutim, nije ograničen posebnim strukturnim tipom kompleksa koji tvore liposomi ovog izuma i nukleinske kiseline koje treba transficirati. Kako se ovdje koristi, stoga, izraz "agregat liposom-nukleinska kiselina" znači svako povezivanje liposoma i nukleinskih kiselina koje je sposobno za lipofekciju.

Agregat lipid-nukleinska kiselina dodaje se stanicama u medij za kulturu i ostavlja se nekoliko desetaka minuta do nekoliko sati, možda preko noći. Obično se tijekom ove faze transfekcije serum izostavlja iz medijuma za kulturu. Nakon toga, medij se zamjenjuje normalnim medijem koji sadrži serum, a stanice se inkubiraju satima do dana ili eventualno uzgajaju na neodređeno vrijeme.

I P (O) metilirani fosfatidilkolin (MePC +, 2) i etilirani fosfatidilkolin (EtPC +, 3) učinkoviti su posrednici transfekcije DNA u eukariotske stanice, pokazujući učinkovitost u RSV-CAT transfekcijama (npr. Gorman i sur., Mol. Stanica Biol. 2, 1044 (1982) de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7, 725 (1987)) u L stanice i Rcho-1 stanice ekvivalentne ili bolje od one primijećene s "LIPOFECTINOM" (Primjer 3 i SLIKA 2). Za razliku od postojećih reagensa za transfekciju napravljenih od kationskih deterdženata, MePC + (2) i EtPC + (3) su učinkoviti reagensi za transfekciju u odsutnosti fosfatidietanolamina (PE). Razlozi za ovu razliku trenutno nisu jasni, no nedavna su istraživanja pokazala da se potreba za PE-ko-lipidima za "LIPOFECTIN" razlikuje ovisno o tipu stanice i dobi kulture. Jarnagin i sur., Nucl. Acids Res. 20, 4205 (1992.). Zanimljivo je da je fluorescentni nitrobenzofurazan (NBD) označio transfekciju posredovanu lipidom 9 bolju od EtPC + (3), jer su stanice transficirane mješavinom EtPC + (3) i 9 pokazale povećanje CAT aktivnosti s povećanjem udjela 9 u smjesi. To sugerira da priroda supstituenta masnih kiselina u roditeljskom spoju fosfoglicerida igra važnu ulogu u određivanju učinkovitosti transfekcije DNA. Sposobnost pripravljanja raznolikog niza kationskih derivata fosfatidilkolina korištenjem metoda ovog izuma omogućit će sustavnije ispitivanje strukturnih čimbenika uključenih u transfekciju DNA kationskim liposomima i osigurati širok raspon kationskih liposoma korisnih za lipofekciju.

Nebrojeno mnogo nukleinskih kiselina može se povezati s liposomima ovog izuma i transficirati. To uključuje hibride DNA, RNA, DNA/RNA (od kojih svaki može biti jednolančan ili dvolančan), uključujući oligonukleotide kao što su antisense oligonukleotidi, himerni polimeri DNA-RNA i ribozimi, kao i modificirane verzije ovih nukleinskih kiselina u kojima je modifikacija može biti u bazi, šećernom dijelu, fosfatnoj vezi ili u bilo kojoj njihovoj kombinaciji.

Iz prethodno navedenog, stručnjacima će biti jasno da su liposomi ovog izuma korisni i za primjenu in vitro i in vivo. Liposomi ovog izuma naći će primjenu u gotovo svim in vitro primjenama koje zahtijevaju transfekciju nukleinskih kiselina u stanice-jedan takav primjer je u procesu rekombinantne proizvodnje proteina.

Nukleinske kiseline mogu sadržavati esencijalni gen ili njegov fragment od kojih ciljna stanica ili stanice imaju nedostatak na neki način, kao što je nedostatak gena ili gdje je gen mutiran što rezultira nedovoljnom ili prekomjernom ekspresijom. Pridružene nukleinske kiseline mogu također sadržavati antisense oligonukleotide. Takvi antisens oligonukleotidi mogu biti konstruirani tako da inhibiraju ekspresiju ciljanog gena. Gore navedeni primjeri su samo primjeri nukleinskih kiselina koje se mogu upotrijebiti u ovom izumu i nemaju namjeru i ne smiju se tumačiti da na bilo koji način ograničavaju izum. Stručnjaci će cijeniti da će i druge nukleinske kiseline biti prikladne za upotrebu u ovom izumu.

Liposomi ovog izuma također su korisni za isporuku lijeka. Kako se ovdje koristi, izraz "agregat liposom-lijek" znači svaku povezanost liposoma i lijekova sposobnih isporučiti lijek stanicama. Izraz "lijek", kako se ovdje koristi, odnosi se na bilo koji spoj ne-nukleinske kiseline koji je ili se može koristiti kao terapeutski, bilo proteinski ili ne-proteinski u prirodi. Učinkovitost isporuke lijekova uvelike se poboljšava ako je lijek hidrofoban. Unos kationskih lijekova može se povećati ako uključuje protuion, poput masne kiseline ili ako su liposomi sačinjeni u vodenoj otopini visoke ionske jakosti. Određeni proces liposoma i inkapsulacije ovisit će o lijeku. Međutim, rutinsko je pitanje odrediti odgovarajuće uvjete za isporuku lijeka pomoću liposoma.

Dostava lijekova uz pomoć fosfolipida može se postići na sljedeći način. Za lijekove koji su topljivi u organskim otapalima, kao što je kloroform, lijek i kationski lipid se miješaju u otapalima u kojima su oba topljiva, a otapalo se zatim uklanja pod vakuumom. Ostatak lipid-lijek se zatim dispergira u odgovarajućem vodenom otapalu, koje je u poželjnoj izvedbi sterilna fiziološka otopina. Suspenzija se tada može po izboru podvrgnuti do nekoliko ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Zatim se ultrazvučno obrađuje, ili samo za smanjenje grubosti disperzije ili za smanjenje veličine čestica na promjer 20-30 nm, ovisno o tome je li velika ili mala veličina čestica najučinkovitija u željenoj primjeni. Za neke primjene, može biti najučinkovitije generirati ekstrudirane liposome istiskivanjem suspenzije kroz filter s porama promjera 100 nm ili manje. Za neke primjene može biti prikladno uključivanje kolesterola ili prirodnih fosfolipida u smjesu koja se koristi za stvaranje agregata lipid-lijek. Agregat liposom-lijek tada se može isporučiti na bilo koji prikladan način.

Za lijekove koji su topljivi u vodenoj otopini i netopivi u organskim otapalima, smjesa lipida koja će se koristiti za disperziju lipida ili liposome premazana je s unutarnje površine tikvice ili epruvete isparavanjem otapala iz otopine smjese. Općenito, da bi ova metoda bila uspješna, lipidna smjesa mora biti sposobna formirati vezikule s jednostrukim ili višestrukim lipidnim dvoslojnim stijenkama i inkapsulirati vodenu jezgru. Vodena faza koja sadrži otopljeni lijek, po mogućnosti fiziološku otopinu soli, dodaje se lipidu, miješa da se dobije suspenzija, a zatim se po izboru zamrzne i odmrzne do nekoliko puta. Ako se želi generirati male liposome, suspenzija se podvrgava ultrazvučnim valovima neko vrijeme potrebno za smanjenje liposoma na željenu prosječnu veličinu. Ako se žele veliki liposomi, suspenzija se samo miješa ručno ili na vrtložnoj miješalici dok se ne dobije jednolična disperzija, tj. Dok vizualno uočljive velike čestice ne izostanu. Ako se pripravak sastoji od toga da se lijek nalazi samo u liposomima, tada se lijek u vodenoj fazi eliminira dijalizom ili prolaskom kroz kromatografsku kolonu za gel-filtraciju (npr. Agarozu) uravnoteženu s vodenom fazom koja sadrži sve normalne komponente osim droga. Opet, upotrijebljena smjesa lipida može sadržavati kolesterol ili prirodne fosfolipide pored kationskih spojeva ovog izuma. Agregat liposom-lijek tada se može isporučiti na bilo koji prikladan način.

Četvrti aspekt izuma obuhvaća nove metode liječenja bolesti koje proizlaze iz infekcije patogenom ili iz nedostatka endogene DNK. Ove metode obuhvaćaju primjenu agregata liposoma-nukleinske kiseline i/ili otopine agregata liposoma-lijeka sisavcima koji pate od patogene infekcije ili nedostatka DNA. Ako je bolest posljedica infekcije patogenom, nukleinska kiselina može biti, na primjer, antisens oligonukleotid usmjeren protiv DNK slijeda u patogenu koji je bitan za razvoj, metabolizam ili reprodukciju patogena. Ako je bolest nedostatak DNK (tj. Gdje nedostaje određena endogena DNA ili je mutirana), što rezultira nedovoljnom ili prekomjernom ekspresijom, nukleinska kiselina može biti normalna sekvenca DNA.

Prijavljeno je nekoliko metoda in vivo lipofekcije. U slučaju cijelih životinja, agregat lipidne nukleinske kiseline može se ubrizgati u krvotok, izravno u tkivo, u peritoneum, ukapati u dušnik ili pretvoriti u aerosol, koji životinja udiše. Zhu i sur., Science 261, 209-211 (1993) opisuju jednu intravenoznu injekciju 100 mikrograma mješavine DNA i DOTMA: dioleoilfosfatidiletanaolamina koja je učinkovito transficirala gotovo sva tkiva. Nabel i sur., Gore, koristili su kateter za implantaciju agregata liposoma-DNA u stijenku krvne žile, što je rezultiralo uspješnom transformacijom nekoliko tipova stanica, uključujući endotelne i vaskularne stanice glatkih mišića.

Stribling i sur., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 89, 11277-11281 (1992), pokazao je da je aerosolnom isporukom ekspresijskog plazmida kloramfenikol acetiltransferaze (CAT) kompleksanog s kationskim liposomima proizvedena ekspresija CAT gena na visokoj razini kod miševa in vivo najmanje 21 dan. Opisali su sljedeći postupak: Šest miligrama plazmidne DNA i 12 μmol DOTMA/DOPE liposoma razrijeđeno je s vodom do 8 ml i pomiješano u jednakim količinama stavljeno u dva žila za raspršivanje Acorn I (Marquest, Englewood, Colo.). u komoru za izlaganje malih životinja Intox (Albuquerque) i brzina protoka zraka od 4 L/min korištena je za stvaranje aerosola (potrebno je oko 90 minuta za aerosolizaciju ovog volumena) životinje su uklonjene iz komore na 1-2 sata i postupak se ponovio. Ovaj protokol je reprezentativan za način isporuke aerosola.

Sljedeći primjeri prikazani su samo u ilustrativne svrhe i nemaju namjeru i ne smiju se tumačiti da na bilo koji način ograničavaju izum.

Sinteza O-metila i O-etil fosfatidilkolina

Fosfatidilkolin je dobiven kao CHCl3 otopine (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Ala.). Metil trifluormetansulfonat i etil trifluorometan sulfonat dobiveni su od tvrtke Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO) i destilirani prije upotrebe. Etil -eter je prije uporabe destiliran iz litij -aluminij hidrida.

Triflatni ester (1,0 mmol) dodan je kap po kap u otopinu fosfatidilkolina (1,0 mmol) u 20 ml etilnog etera miješanog u atmosferi dušika. Tankoslojna kromatografska analiza (SiO2, 65: 25: 4 CHCl3 :CH3 OH: H2 O detekcija s raspršivanjem fosfomolibdata) pokazala je potpunu konverziju fosfatidilkolina (Rf = 0,25) do alkil PC + (Rf = 0,60) u roku od 30 minuta. Reakcijska smjesa je izlivena na sloj SiO2 (Promjera 4 cm, visine 2 cm), a eter je usisavan vakuumom. SiO2 jastučić je ispran 3 puta s 10 ml obroka CHCl3 :CH3 OH (10: 1). Frakcije koje sadrže proizvod se skupe i ispare u vakuumu.

Metilfosfotrijester dobiven je s iskorištenjem 85%. Etil fosfotriester dobiven je s 80% izoliranim iskorištenjem nakon 4 sata reakcije.

Analizom metil fosfotriestera fosfatidilkolina na 600 MHz 'H-NMR otkrio je par dubleta (3H, J = 12 Hz) pri δ3,85, karakterističan za očekivanu diastereomernu smjesu fosfatnih metilnih estera.

Metabolizam i stabilnost liposoma

Metabolizam ovih kationskih lipida ispitivan je pomoću fluorescentnog derivata 9. Kulture L-stanica miša tretirane su fluorescentnim derivatom 9, sa i bez DNA, na isti način na koji je standardni postupak transfekcije proveden u primjeru 3, dolje. Nakon 24 sata inkubacije, stanice su sastrugane s ploče i centrifugirane kako bi se izolirale kao mokra kuglica. Lipid je ekstrahiran iz stanica u mililitarskim dijelovima kloroform: metanol (2: 1). Donja faza ekstrakta kloroforma uklonjena je i koncentrirana. Tankoslojna kromatografija (TLC) koncentriranog ekstrakta na pločama silika gela s kloroformom: metanolom: vodom (65: 25: 4) otkrila je glavno mjesto u položaju izvornog fluorescentnog lipida i drugo, manje intenzivno mjesto s Rf to je bilo približno ono što se očekivalo za 12-NBD-aminodekansku kiselinu. Na temelju relativnog fluorescentnog intenziteta dviju pjega, približno jedna trećina izvornog spoja hidrolizirana je u približno vremenu potrebnom za tipičnu transfekciju uzgojenih stanica.

U nedostatku stanica, vodeni EtPC + (3) je prilično stabilan pomoću tankoslojne kromatografije, ne primjećuje se mjerljiva razgradnja nakon nekoliko dana na sobnoj temperaturi. Uzorci se moraju držati u kloroformu na -20 ° C dulje od 2 godine bez ikakvih znakova razgradnje.)

Kako bi se dodatno ispitao metabolizam ovih lipida, 9 je tretirano pročišćenim fosfolipazama dobivenim iz različitih izvora prema standardnim postupcima. W. W. Christie, Analiza lipida (2. izdanje, Pergamon Press, Oxford, 1982.). Obično se 50-100 mikrograma 9 u 50-250 μl etilnog etera mućka s 50-250 μl enzima u puferu koji sadrži, ako je prikladno za funkciju enzima, kalcijev klorid. Nekoliko uzoraka mikrolitara uzimalo se u intervalima za TLC analizu na pločama silikagela s kloroformom: metanolom: vodom ili kloroformom: metanolom: koncentriranim amonijakom, oba 65: 25: 4. Nisu uočene reakcije koje se mogu detektirati s fosfolipazom C iz Clostridium perfringens. Fosfolipaza D iz kupusa, prokulica, kikirikija i Streptomyces chromofuscus pokazala je vrlo sporo razgradnju 9 u odnosu na PC. Svi enzimi osim onih koji su ekstrahirani iz prokulica (mi) bili su komercijalni pripravci dobiveni od Sigme (St. Louis, MO).

Produkt djelovanja fosfolipaze D na 9 još nije čvrsto identificiran, iako je jasno da nije niti 1 niti fosfatidna kiselina. Moguće je da je proizvod fosfatidiletanol na temelju njegovih kromatografskih svojstava. Skupina kolina se stoga ne gubi tako lako iz 9 kao iz fosfatidilkolina pod utjecajem korištenog enzima.

Tretiranjem fosfolipazom A2 (Naja naja) nastala je 12- (NBD-amino) dodekanska kiselina, iako nekoliko puta sporije nego što je primijećeno za PC kontrolnu reakciju. Stanični metabolizam EtPC + (3) može se stoga odvijati hidrolizom posredovanom fosfolipazom A, pri čemu će gubitak kolinskog dijela nastupiti mnogo sporije djelovanjem fosfolipaze D, iako očito takav zaključak treba uzeti u obzir oprezno jer unutarstanične lipaze mogu ispoljavati različite aktivnosti od onih korištenih u našim in vitro testovima.

Lipofekcija kultiviranih stanica L i Rcho-1

Mišije L stanice uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle s 10% telećeg seruma, 100 U/ml penicilina, 100 μg/ml streptomicina i glutamina. Stanice Rcho-1 uzgajane su u mediju RPMI 1640 koji sadrži 10% toplinski inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 50 μM 2-merkaptoetanola, 1 mM natrijevog piruvata, 100 U/ml penicilina i 100 μg/ml streptomicina. Obje stanične linije uzgajane su na 37 ° C u 5% CO2 atmosfera.

A CH3 Cl3 otopina lipida se osuši u vakuumu i suspendira u sterilnoj vodi2 O pri 10 mg/ml (lipid označen s NBD suspendiran je pri 1 mg/ml zbog ograničene topljivosti) vrtloženjem. Ova suspenzija je ultrazvučno obrađivana 30 sekundi pomoću mikrosonde Branson -ovog sondatora od 400 W pri najmanjoj snazi. Ova suspenzija je razrijeđena do 1 mg/ml i dalje obrađena ekstruzijom kroz 1000 Å ultrafilter za proizvodnju homogenijih liposoma.

Vodena suspenzija liposoma (80 μg lipida) pomiješana je s 10 μg RSV-CAT DNA i držana na sobnoj temperaturi 20 minuta. Stanice su isprane s fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom, a medij je zamijenjen ili DME ili RPMI. Nakon što se u smjesi liposoma-DNA stvorio mutni bijeli talog, otopina je dodana kap po kap u stanice. Ploče su zatim lagano zakrenute i inkubirane 10-24 sata na 37 ° C pod 5% CO2. Medij je zamijenjen kompletnim medijem, a stanice su sakupljene 48 sati nakon dodavanja DNA. Transfekcije koje uključuju "LIPOFECTIN" (upotrebom 30 μg) izvedene su prema objavljenim postupcima Gibco-BRL. Ekstrakti stanica su pripremljeni i ispitani na aktivnosti kloramfenikol acetiltransferaze i luciferaze. Autoradiogram je prikazan na Sl. 2. Sljedeća tablica identificira reagense za transfekciju za svaku traku koja se pojavljuje na Sl. 2 autoradiogram:

______________________________________
Stanični reagensi za traku
______________________________________

Miš L 1 1000 Å vezikula EtPC + (3)
2 1000 Å vezikule EtPC + (3) + RSV-CAT DNA
3 ultrazvučna EtPC + (3) + RSV-CAT DNA
4 "LIPOFECTIN" + RSV-CAT DNA
Rcho-1 5 1000 Å vezikula EtPC + (3) + RSV-CAT DNA
6 ultrazvukom EtPC + (3) + RSV-CAT DNA
7 "LIPOFECTIN" + RSV-CAT DNA
______________________________________

Kao što se može vidjeti iz autoradiograma, EtPC + (3) je jednako učinkovit kao sredstvo za transfekciju kao i "LIPOFECTIN".

Slijedeći isti protokol, proučavali smo relativnu učinkovitost transfekcije NBD označenih lipida (9) i EtPC + (3). Korišteno je 10 μg RSV-CAT i 80 μg lipida. Rezultati su prikazani na Sl. 3. Sljedeća tablica identificira sadržaj traka:

______________________________________
Lane Lipid
______________________________________

1 bez lipida
2 NBD-PC
3 EtPC +
4 1: 1 EtPC + /NBD-EtPC +
5 NBD-EtPC +
______________________________________

Rezultati prikazani na Sl. 3 pokazuju da je transfekcija posredovana NBD-označenim lipidom (11) nešto bolja od EtPC + (3). To sugerira da priroda supstituenata masnih kiselina igra važnu ulogu u određivanju učinkovitosti transfekcije DNA.

Lipofekcija bubrega uzgojenog hrčka i Niemann-Pick (tip A)

EtPC + (3) je korišten za transfekciju proteinskog gena RAB-7. Konstruiran je vektor koji sadrži gen za RAB-7 i promotor T7 polimeraze.Transficiran je u stanice bubrega beba hrčka i Niemann-Pick (tip A) stanice. Stanice su istovremeno inficirane rekombinantnim virusom vakcinije koji sadrži T7 polimerazu. Omjer EtPC + (3) i DNA bio je 5: 1 težinski. Ekspresija gena RAB-7 određena je mjerenjem stanica obojenih antitijelima na protein RAB-7. U korištenim uvjetima (koji nisu optimizirani za EtPC +), učinkovitost transfekcije (mjereno postotkom stanica koje izražavaju gen RAB-7) bila je 30-40% za BHK stanice i oko 20% za fibroblaste. Ovi su rezultati bili vrlo slični onima dobivenim komercijalnim proizvodom "LIPOFECTIN".

Lipofekcija uzgojenih stanica ljudske eritroleukemije (K562)

Lipofekcija kultiviranih stanica ljudske eritroleukemije (K562) pomoću EtPC + (3) uspoređena je s "LIPOFECTIN -om". Ili 10 ili 50 μg EtPC + (3) ili 30 μg "LIPOFECTINA" pomiješano je s 5 μg pRSV-CAT ili po 5 μg pGAL4-HSF1 i pGAL4-CAT. Zatim je u stanice dodan agregat lipid-DNA. Nakon 48 sati, stanice su ispitane na CAT aktivnost korištenjem konvencionalnog kromatografskog radioaktivnog testa. Vizualnim pregledom autoradiograma rezultati za EtPC + (3) i za "LIPOFECTIN" transdukcije bili su vrlo slični.

Lipofekcija cijelih životinja

Za lipofektiranje cijelih životinja može se koristiti opći postupak Zhu i sur., Gore. Na 20 g težine životinje, 100 μg DNA kao odgovarajućeg vektora, s kompleksom od približno 600 μg kationskog lipida, ubrizgava se intravenozno. Očekuje se da će za optimalne rezultate trebati varirati količinu DNK i omjer kationskog lipida u DNK te procijeniti izražavanje željene osobine za svaku količinu i omjer. Lipid se dispergira na isti način kao i za in vitro transfekciju.

Za lokalizaciju doze i preferirano liječenje određenih tkiva ili organa mogu se primijeniti različiti postupci, kao što su injekcije izravno u organ ili tkivo, isporuka kanulom ili injekcija u kanale, žile ili prolaze koji vode do organa ili tkiva od interesa, ili izravno površinskom primjenom, ručno ili putem aerosolne pare, na primjer, u pluća.