Informacija

Uloga H3K36me3 u produljenju RNA polimeraze II

Uloga H3K36me3 u produljenju RNA polimeraze II



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pronašao sam rad koji opisuje povezanost RNA polimeraze II sa histon metiltransferazom Set2 koja metilira H3K36.

Na kraju kažu:

Iako naši rezultati snažno impliciraju da metilacija K36 ima izravnu ulogu u produženju RNAPII, točna uloga trenutno nije jasna. Predlažemo tri mogućnosti: (i) K36 metilacija stvara kromatinsku strukturu koja je dopuštenija za prolaz kroz RNAPII. U ovom scenariju, gubitak metilacije Set2/K36 rezultirao bi kromatinskom strukturom koju je RNAPII teže prošao, što bi se moglo pojaviti kao povećanje zauzetosti RNAPII duž gena povećanjem pauze. (ii) K36 metilacija stvara kromatinsku strukturu koja je manje dopuštena za prolazak kroz RNAPII. U ovom slučaju, metilacija K36 djeluje kao negativan regulator produženja RNAPII, a gubitak ove "oznake" dopušta povećani prolaz RNAPII.

Malo sam zbunjen u vezi s (ii) točkom. Ako gubitak ove oznake dopušta povećani prolaz RNAPII, ne bismo vidjeli uzorak H3K36me3 u aktivnim genima. Zašto se onda kaže da H3K36me3 označava aktivne gene?


Imamo novije istraživanje, trimetilacija histona H3 u lizinu 36 povezana je s konstitutivnim i fakultativnim heterokromatinom i čini se da sugeriraju da u skladu s vašim dokumentom iz 2005. H3K36me3 djelomično doprinosi stvaranju čvrsto zapakiranog, nedostupnog kromatina. Vidjet ćete da postoji mnogo preslušavanja, ali također biste pomislili da bi transkripcija u heterokromatinu mogla biti loša.

Gledajući studije kvasca, čini se da je RNA Pol II sposobna transkribirati se putem heterokromatina sve dok su prisutni specifični kofaktori (potrebna je acetilacija H3 K56 za produljenje transkripta RNA polimeraze II kroz heterokromatin u kvascu)


Kotranskripcijska monobikvililacija histona H2B čvrsto je povezana sa brzinom produženja RNA polimeraze II

Različite modifikacije histona ukrašavaju nukleosome unutar transkribiranih gena. Među njima, monooubiquitylation histona H2B (H2Bub1) i metilacija histona H3 na lizinima 36 (H3K36me2/3) i 79 (H3K79me2/3) pozitivno koreliraju s ekspresijom gena. Mjerenjem progresije transkripcijskog stroja duž gena unutar živih stanica, sada izvještavamo da se monobikvililacija H2B javlja kotranskripcijski i točno odražava napredak RNA polimeraze II (Pol II). Nasuprot tome, H3K36me3 i H3K79me2 manje su dinamični i manje vjerno predstavljaju kretanje Pol II. ChIP-seq visoke razlučivosti otkriva da se razine H2Bub1 selektivno smanjuju u egzonima i postupno smanjuju o egzonu ovisne prema 3 'kraju gena. Egzonično iscrpljivanje H2Bub1 u genskim tijelima jako je povezano s pauziranjem Pol II u egzonima, što upućuje na promjene brzine produženja povezane sa strukturom intron-egzona. U prilog ovoj ideji, utvrđeno je da su razine H2Bub1 značajno povezane sa brzinama produženja transkripcije izmjerenim u različitim staničnim linijama. Općenito, naši podaci rasvjetljavaju organizaciju H2Bub1 unutar transkribiranih gena i izdvajaju H2Bub1 kao pouzdan marker za kontinuirano produženje transkripcije.

© 2014 Fuchs i sur. Nakladnik Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Figure

H2Bub1 je prvenstveno lokaliziran u…

H2Bub1 je prvenstveno lokaliziran u transkribiranim regijama, a reduciran je u egzonima. (…

Exonic H2Bub1 razine se spajaju ...

Egzonične razine H2Bub1 neovisno su o spoju. ( A ) HeLa stanice su transficirane ...

H2B je monobibikilitiran kotranskripcijski. (…

H2B je monobibikilitiran kotranskripcijski. ( A ) HeLa stanice su tretirane sa 100 ...

Dinamika H2Bub1 tijela gena u…

Dinamika H2Bub1 tijela gena kao odgovor na uzorke transkripcije zrcala EGF -a. ( A…

Korelacija na razini genoma između razina H2Bub1 ...

Korelacija na razini genoma između razina H2Bub1 i brzina produženja. ( A ) Transkripcija za cijeli genom ...

Egzoni s niskim razinama H2Bub1 ...

Egzoni s niskim razinama H2Bub1 karakterizirani su velikom zauzetošću Ser2P-Pol II. (…

Model koji prikazuje spoj između…

Model koji prikazuje spregu između distribucije H2Bub1 unutar genskih tijela i Pol II ...


Sažetak autora

U organima sisavaca, poput jetre, mnogi se metabolički i fiziološki procesi odvijaju prvenstveno u određeno vrijeme tijekom 24-satnog dnevnog ciklusa. Vrijeme ovih ritmičkih funkcija ovisi o složenom uzajamnom djelovanju između endogenog cirkadijskog sata i vremenskih znakova okoliša koji se prenose putem glavnog cirkadijskog sata u suprahijazmatskoj jezgri ili putem ritma hranjenja. Ti se ritmovi mogu implementirati na nekoliko regulatornih razina, a ovdje smo željeli bolje razumjeti transkripcijske i epigenetske promjene koje reguliraju dnevne ritmove. Proveli smo genomsku analizu lokacija RNA polimeraze II (Pol II) i epigenetskih histonskih modifikacija H3K4me3 i H3K36me3 u određeno doba dana, povezujući te podatke s razinama ekspresije mRNA. Naše analize pokazuju da su transkripcijski ritmovi Pol II dvofazni u jetri miša, s dominantnom vršnom aktivnošću ujutro i navečer. Štoviše, dinamičke promjene u histonskim oznakama zaostaju u transkripcijskim ritmovima u cijelom genomu, što ukazuje na to da se epigenetski krajolik može preoblikovati tijekom 24-satnog ciklusa. Konačno, kvantitativna analiza vremenskih profila akumulacije Pol II i mRNA ukazuje na to da posttranskripcijska regulacija značajno doprinosi amplitudi i fazi profila akumulacije mRNA. Iako su mnoge studije analizirale kako se stanje transkripcije i kromatina mijenja tijekom nepovratnih procesa diferencijacije stanica, naš rad naglašava kako se ta stanja mogu reverzibilno razviti u sustavu koji pokazuje periodičnost u vremenu.

Citat: Le Martelot G, Canella D, Symul L, Migliavacca E, Gilardi F, Liechti R, et al. (2012) Profili RNA polimeraze II širokog genoma i akumulacija RNK otkrivaju kinetiku transkripcije i pridruženih epigenetskih promjena tijekom dnevnih ciklusa. PLoS Biol 10 (11): e1001442. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001442

Akademski urednik: Achim Kramer, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Njemačka

Primljeno: 28. svibnja 2012 Prihvaćeno: 25. listopada 2012 Objavljeno: 27. studenog 2012

Autorsko pravo: © 2012 Le Martelot i sur. Ovo je članak s otvorenim pristupom distribuiran pod uvjetima Licence za dodjeljivanje autorskih prava Creative Commons, koji dopušta neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju na bilo kojem mediju, pod uvjetom da se navede izvorni autor i izvor.

Financiranje: Ovaj je rad financiran od strane CycliX -a, bespovratnih sredstava inicijative Swiss SystemsX.ch (www.systemsx.ch) koju je ocijenila Švicarska nacionalna zaklada za znanost, Sybit, IT jedinica SystemsX.ch, Sveučilište u Lausanni, Sveučilište u Ženevi, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) i Vital-IT. Donatori nisu imali nikakvu ulogu u izradi studije, prikupljanju i analizi podataka, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.

Konkurentni interesi: Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi.

Kratice: ChIP, imuno-precipitacijski CTD kromatina, PAS s C-terminalnom domenom, mjesta poliadenilacije Pol II, RNA polimeraza II RT, TSS reverzne transkriptaze, početna mjesta transkripta ZT, Zeitgeberovo vrijeme


C-terminalna domena (CTD) RNA Pol II: Platforma za koordinaciju transkripcije

Kao i svi eukarioti, malarijski paraziti posjeduju tri različite RNA polimeraze. RNA pol I prepisuje ribosomske RNA (s iznimkom 5S), dok pol III prepisuje 5S ribosomsku RNA (rRNA), prijenosne RNA (tRNA) i nekoliko malih RNA, uključujući neke male nukleolarne RNA (snRNA). RNA pol II posreduje u ekspresiji gena koji kodiraju proteine ​​transkribiranjem odgovarajućih glasničkih RNA (mRNA). U koordinaciji različitih koraka u proizvodnji mRNA ključna je sustavna post-translacijska modifikacija, posebno fosforilacija, CTD-a Rpb1, najveće podjedinice RNA pol II (slika 1A) [9]. To omogućuje postupno regrutiranje različitih čimbenika uključenih u regulaciju ciklusa transkripcije, kao i obradu RNA, izvoz RNA i remodeliranje kromatina. U većine eukariota, RNA pol II CTD ima fleksibilnu strukturu koja se sastoji od visoko očuvanog tandem niza Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser/Lys7 heptadnih ponavljanja. Kako se RNA pol II kreće kroz transkripciju gena, ponavljanja se podvrgavaju uzastopnim promjenama u statusu fosforilacije Ser2 i Ser5, pri čemu je samo fosforilacija Ser5 povezana s inicijacijom transkripcije, istodobnom fosforilacijom Ser2 i Ser5 kada je polimeraza uključena u produljenje i fosforilacija samo Ser2 pri završetku. Transkripcijski ciklus nije jedini proces koji ovisi o odgovarajućoj fosforilaciji serinskih ostataka. Nuklearni čimbenici, poput enzima za zatvaranje i modifikatora histona, kao i čimbenici spajanja, jednako ovise o statusu fosforilacije CTD -a za odgovarajuće regrutiranje u transkripcijski kompleks [10]. Na primjer, histon metiltransferaza SET1 veže se za CTD kada se fosforilira u serinu 5, označavajući tako kromatin u regijama genoma koje su nedavno transkribirane (slika 1A) [11].

(A) Transkripcija tipične mRNA. Odozgo: prikaz kućnog gena s tri egzona (sive kutije) i dva introna. Regrutiranje kompleksa RNA pol II koji proizvodi mRNA u promotor rezultira proizvodnjom transkripta koji je zatvoren, spojen, poliadeniliran i izvezen iz jezgre radi translacije. Dolje: prikaz lanca DNA omotanog oko histona (plavi ovali). Kompleks RNA pol II prikazan je zelenom bojom, a CTD prikazan kao produžetak. Kod eukariota CTD se sastoji od niza ponavljanja aminokiselinske sekvence YSPTSPS/K. Serini na drugom i petom mjestu svakog ponavljanja prikazani su kao plavi krugovi označeni s 2, odnosno 5. Prikazana su tri ponavljanja, iako se broj može razlikovati ovisno o vrsti (n). U P. falciparum, Zabilježeno je 12–17 ponavljanja. Fosforilacija serina prikazana je kao narančasti krugovi označeni s P i nalaze se prvenstveno na serinima na petom mjestu blizu početka transkripcije, na serinima u oba položaja na sredini jedinice za transkripciju, a na serinama u drugom mjesto gdje transkripcija završava. Alternativna fosforilirana stanja posreduju u regrutiranju različitih čimbenika potrebnih za proizvodnju i sazrijevanje mRNA, kao i modifikatore histona, uključujući SET1 (crveni oval), koji istodobno taloži epigenetsku oznaku H3K4me3 s proizvodnjom mRNA. Stoga se ova oznaka nalazi u transkripcijski aktivnim regijama genoma. (B) Model za transkripciju nekodirajuće RNA (ncRNA) na var lokusi. Vrh: promotor koji se nalazi unutar introna domene var geni dovodi do proizvodnje ncRNA koje su pokrivene, ali nisu poliadenilirane. Osim toga, oni se zadržavaju unutar jezgre i povezani su s kromatinom. Srednji: kompleks RNA pol II uključen je u transkripciju nekodirajuće RNK, međutim, modifikacije serina na pozicijama 2 i 5 CTD-a i faktori povezani s transkripcijom koji su regrutirani u kompleks nisu poznati (?). Pokazalo se da se PfSET2 (ljubičasto ovalni) veže izravno na CTD i odlaže epigenetsku oznaku H3K36me3 i na aktivnoj i na tihoj razini var geni. To je u skladu s njegovim regrutiranjem od strane RNA pol II kada transkribira ncRNA iz promotora koji se nalazi unutar var introni. Dolje: dominantno negativna verzija PfSET2 (tamnozeleni ovali) koja nije sposobna odložiti oznaku H3K36me3 može se natjecati s endogenim divljim tipom PfSET2 za vezivanje za CTD. Prekomjerna ekspresija dominantno negativnog proteina smanjuje učinkovitost regrutiranja PfSET2 var lokusi i dovodi do prelaska na var2csa.


Miševi modeli nuklearnih ovojnica i srodnih bolesti

Lorna R. Fiedler,. Michael D. Schneider, u Trenutne teme u biologiji razvoja, 2014

7.4.5 Ciklin-ovisna kinaza-9

Hipofosforilirana RNA polimeraza II (RNAPIIa) regrutirana je u promotore i pokreće produženo produženje transkripta nakon što je fosforilirana (IIo) u svojoj C-terminalnoj domeni (CTD). Cdk7 i Cdk9 fosforiliraju CTD kako bi posredovali prijelaz od inicijacije do produljenja, pri čemu je aktivnost Cdk9 posebno kritična. Pokazujući važnost za srčane bolesti, aktivnost Cdk9 je povećana u zatajelim ljudskim srcima, a RNAPII je hiperfosforiliran (Sano i sur., 2004.). Nadalje, rušenje nekodirajuće 7SK RNA, bitne komponente endogenog inhibitornog kompleksa Cdk9, bilo je dovoljno za spontanu hipertrofiju u kulturi.

Prekomjerno izražavanje CycT1 ciklin partner Cdk9, ustrajno na normalnoj embrionalnoj razini povećavao je srčanu aktivnost Cdk9 i CTD fosforilaciju. Dok je osnovni fenotip bila nepatološka hipertrofija, brzi DCM, apoptoza i fibroza rezultat su istovremene ekspresije srčano-specifičnog broja niskih kopija Gnaq, blagi prohipertrofični podražaj. Aktivnost Cdk9 dodatno je pojačana u bigenskih miševa, a zatajenje srca istodobno sa smrću kardiomiocita i povećanom aktivnošću kaspaze-3 bilo je očito u dobi od 4 tjedna. Osim toga, aktivacija Cdk9 potisnula je biogenezu i funkciju mitohondrija suzbijanjem Ppargc1a transkripcija, koja kulminira mitohondrijskim defektima, predispozicijom za staničnu smrt i zatajenje srca te smrtnost. Patofiziološke razine aktivnosti Cdk9 stoga čine miokard osjetljivim na staničnu smrt i zatajenje srca, što ukazuje da je Cdk9 potencijalna meta za suzbijanje smrti kardiomiocita i ublažavanje prijelaza iz hipertrofije u dilataciju (Sano i sur., 2004. Sano & amp Schneider, 2004.).


Sadržaj

Rane studije sugerirale su najmanje dva RNAP -a: jedan koji je sintetizirao rRNA u jezgri i drugi koji je sintetizirao drugu RNA u nukleoplazmi, dio jezgre, ali izvan jezgre. [5] 1969. godine, znanstveni eksperimentatori Robert Roeder i William Rutter definitivno su otkrili dodatni RNAP koji je odgovoran za transkripciju neke vrste RNA u nukleoplazmi. Nalaz je dobiven ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom putem DEAE obloženih kuglica Sephadex. Tehnika je odvojila enzime prema redoslijedu odgovarajućih elucija, Ι, ΙΙ, ΙΙΙ, povećanjem koncentracije amonijevog sulfata. Enzimi su imenovani prema redoslijedu elucija, RNAP I, RNAP II, RNAP IΙI. [3] Ovo otkriće pokazalo je da je u nukleoplazmi prisutan dodatni enzim, koji je omogućio razliku između RNAP II i RNAP III. [6]

RNA polimeraza II eukariotske jezgre najprije je pročišćena pomoću transkripcijskih testova. [8] Pročišćeni enzim tipično ima 10-12 podjedinica (12 u ljudi i kvasca) i nije u stanju prepoznati specifičan promotor. [9] Poznate su mnoge interakcije podjedinica-podjedinica. [10]

  • Podjedinica DNA-usmjerene RNA polimeraze II RPB1 - enzim koji kod ljudi kodira gen POLR2Agen, a u kvascu RPO21. RPB1 je najveća podjedinica RNA polimeraze II. Sadrži karboksi terminalnu domenu (CTD) koja se sastoji od do 52 ponavljanja heptapeptida (YSPTSPS) koja su bitna za aktivnost polimeraze. [11] CTD je prvi put otkriven u laboratoriju C.J. Inglesa na Sveučilištu u Torontu i JL Corden na Sveučilištu Johns Hopkins. U kombinaciji s nekoliko drugih podjedinica polimeraze, podjedinica RPB1 tvori domenu polimeraze koja veže DNA, utor u kojem se DNK predložak prepisuje u RNA. [12] Snažno je u interakciji s RPB8. [10]
  • RPB2 (POLR2B)-druga po veličini podjedinica koja u kombinaciji s najmanje dvije druge podjedinice polimeraze tvori strukturu unutar polimeraze koja održava kontakt na aktivnom mjestu enzima između DNK šablona i novo sintetizirane RNA. [13]
  • RPB3 (POLR2C)-treća po veličini podjedinica. Postoji kao heterodimer s drugom podjedinicom polimeraze, POLR2J tvoreći podskup jezgre. RPB3 snažno stupa u interakciju s RPB1-5, 7, 10–12. [10]
  • Podjedinica R4 polimeraze II (RPB4) -kodiran genom POLR2D [14] četvrta je po veličini podjedinica i može imati ulogu zaštite od stresa.
  • RPB5 - Kod ljudi je kodiran genom POLR2E. Dvije molekule ove podjedinice prisutne su u svakoj RNA polimerazi II. [15] RPB5 snažno djeluje s RPB1, RPB3 i RPB6. [10]
  • RPB6 (POLR2F) - tvori strukturu s najmanje dvije druge podjedinice koja stabilizira transkripcijsku polimerazu na predlošku DNA. [16]
  • RPB7 - kodiran POLR2G i može igrati ulogu u regulaciji funkcije polimeraze. [17] RPB7 snažno djeluje s RPB1 i RPB5. [10]
  • RPB8 (POLR2H) -stupa u interakciju s podjedinicama RPB1-3, 5 i 7. [10]
  • RPB9 - Utor u kojem se DNK šablon transkribira u RNA sastoji se od RPB9 (POLR2I) i RPB1.
  • RPB10 - produkt gena POLR2L. U interakciji je s RPB1-3 i 5, te snažno s RPB3. [10]
  • RPB11 -podjedinica RPB11 sama se sastoji od tri podjedinice kod ljudi: POLR2J (RPB11-a), POLR2J2 (RPB11-b) i POLR2J3 [18] (RPB11-c).
  • RPB12 - Također komunicira s RPB3 je RPB12 (POLR2K). [10]

RPB3 je uključen u sklop RNA polimeraze II. [19] Potkompleks RPB2 i RPB3 pojavljuje se ubrzo nakon sinteze podjedinica. [19] Ovaj kompleks naknadno stupa u interakciju s RPB1. [19] RPB3, RPB5 i RPB7 međusobno djeluju i tvore homodimere, a RPB3 i RPB5 zajedno mogu stupiti u kontakt sa svim ostalim podjedinicama RPB -a, osim RPB9. [10] Samo RPB1 snažno se veže za RPB5. [10] Podjedinica RPB1 također kontaktira RPB7, RPB10 i slabije, ali najučinkovitije s RPB8. [10] Nakon što RPB1 uđe u kompleks, mogu ući druge podjedinice, poput RPB5 i RPB7, gdje se RPB5 veže za RPB6 i RPB8, a RPB3 donosi RPB10, RPB 11 i RPB12. [10] RPB4 i RPB9 mogu ući nakon što je većina kompleksa sastavljena. RPB4 tvori kompleks s RPB7. [10]

Enzimi mogu katalizirati do nekoliko milijuna reakcija u sekundi. Brzine enzima ovise o uvjetima otopine i koncentraciji supstrata. Kao i drugi enzimi, POLR2 ima krivulju zasićenja i najveću brzinu (V.maks). Ono ima Km (potrebna je koncentracija supstrata za pola V.maks) i a kmačka (broj molekula supstrata kojima upravlja jedno aktivno mjesto u sekundi). Konstanta specifičnosti dana je sa kmačka/Km. Teoretski maksimum za konstantu specifičnosti je granica difuzije od oko 10 8 do 10 9 (M −1 s −1), gdje svaki sudar enzima sa supstratom rezultira katalizom. U kvascu, mutacija u domeni Trigger-Loop najveće podjedinice može promijeniti kinetiku enzima. [20]

Bakterijska RNA polimeraza, srodnica RNA polimeraze II, prebacuje se između inaktiviranih i aktiviranih stanja translociranjem naprijed -natrag duž DNK. [21] Koncentracije [NTP]ekv = 10 μM GTP, 10 μM UTP, 5 μM ATP i 2,5 μM CTP, proizvode srednju brzinu produženja, broj prometa,

1 bp (NTP) -1 za bakterijski RNAP, srodnik RNA polimeraze II. [21]

RNA polimeraza II prolazi kroz opsežnu ko-transkripcijsku pauzu tijekom produženja transkripcije. [22] [23] Ovo pauziranje posebno je izraženo kod nukleosoma, a djelomično nastaje kroz ulazak polimeraze u transkripcijski nesposobno unatrag stanje. [22] Trajanje ovih stanki kreće se od sekundi do minuta ili dulje, a izlazak iz dugotrajnih pauza može se potaknuti faktorima produljenja poput TFIIS-a. [24] S druge strane, stopa transkripcije utječe na to hoće li histoni prepisanih nukleosoma biti istjerani iz kromatina ili ponovno umetnuti iza transkripcijske polimeraze. [25]

Alfa-amanitin Edit

RNA polimerazu II inhibiraju α-amanitin [26] i drugi amatoksini. α-Amanitin je vrlo otrovna tvar koja se nalazi u mnogim gljivama. [5] Otrov gljiva ima različite učinke na svaku od RNA polimeraza: I, II, III. RNAP I potpuno ne reagira na tvar i funkcionirat će normalno dok RNAP III ima umjerenu osjetljivost. RNAP II je, međutim, potpuno inhibiran toksinom. Alfa-amanitin inhibira RNAP II snažnim interakcijama u enzimskim "lijevcima", "rascjepima" i ključnim "most α-heliks" regijama podjedinice RPB-1. [27]

RNA polimeraza II holoenzim je oblik eukariotske RNA polimeraze II koja se regrutira u promotore gena koji kodiraju proteine ​​u živim stanicama. [9] Sastoji se od RNA polimeraze II, podskupa općih transkripcijskih faktora i regulatornih proteina poznatih kao SRB proteini.

Dio sklopa holoenzima naziva se kompleks predinicijacije, jer se njegova montaža odvija na promotoru gena prije početka transkripcije. Medijatorski kompleks djeluje kao most između RNA polimeraze II i transkripcijskih faktora.

Ovo je pregled primjera mehanizma stanica kvasca pomoću kojeg struktura kromatina i posttranslacijska modifikacija histona pomažu u regulaciji i bilježenju transkripcije gena pomoću RNA polimeraze II.

Ovaj put daje primjere regulacije na ovim mjestima transkripcije:

  • Predinicijacija (promocija Bre1, modifikacija histona)
  • Inicijacija (promocija prema TFIIH, modifikacija Pol II I promocija prema COMPASS -u, modifikacija histona)
  • Produženje (promocija od strane Set2, izmjena histona)

To se odnosi na različite faze procesa kao regulatorni koraci. Nije dokazano da se koriste za regulaciju, ali vrlo vjerojatno jesu.

Promotori produženja RNA Pol II mogu se sažeti u 3 klase.

  1. Čimbenici ovisni o lijeku/sekvenci ovisni o zaustavljanju (različiti ometajući proteini)
  2. Čimbenici usmjereni na strukturu kromatina (histonski posttranskripcijski modifikatori, npr. Histonske metiltransferaze)
  3. Čimbenici za poboljšanje katalize RNA Pol II (Razni proteini koji ometaju i kofaktori Pol II vidjeti RNA polimeraza II).
  • Čimbenici usmjereni na strukturu kromatina:
    (HMT -ovi (Histone MetilTransferaze)):
    COMPASS§ † - (COMpleks od Proteini KAOdruži se s Set1) - Metilira lizin 4 histona H3: Odgovoran je za potiskivanje/utišavanje transkripcije. Normalan dio rasta stanica i regulacije transkripcije unutar RNAP II. [28]
  • Set2 - Metilira lizin 36 histona H3: Set2 je uključen u regulacijsko produljenje transkripcije izravnim kontaktom s CTD -om. [29]
    (zanimljiv irelevantan primjer: Dot1*‡ - Metilira lizin 79 histona H3.)
  • Bre1 - Ubikinati (dodaje ubikvitin) lizinu 123 histona H2B. Povezano s predinicijacijom i omogućujući vezanje RNA Pol II.

CTD RNA polimeraze Edit

C-kraj RPB1 je dodan da tvori C-terminalnu domenu (CTD). Karboksi-terminalna domena RNA polimeraze II tipično se sastoji od do 52 ponavljanja sekvence Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. [30] Domena se proteže od jezgre enzima RNAPII do izlaznog kanala, ovo je mjesto učinkovito zbog svojih indukcija "reakcija prerade RNA, izravnim ili neizravnim interakcijama sa komponentama strojeva za obradu RNA". [31] CTD domena ne postoji u RNA polimerazi I ili RNA polimerazi III. [3] CTD RNA polimeraze otkriven je prvo u laboratoriju CJIngles na Sveučilištu u Torontu, a također i u laboratoriju J Corden na Sveučilištu Johns Hopkins tijekom procesa sekvenciranja DNA koja kodira RPB1 podjedinicu RNA polimeraze iz kvasca i Miševi respektivno. Drugi proteini često vežu C-terminalnu domenu RNA polimeraze kako bi aktivirali aktivnost polimeraze. Proteinska je domena uključena u započinjanje transkripcije, zatvaranje RNA transkripta i vezivanje za spliceosom za spajanje RNA. [11]

Fosforilacija CTD domene Uredi

RNA polimeraza II postoji u dva oblika, nefosforilirana i fosforilirana, IIA i IIO. [5] [3] Prijelaz između dva oblika olakšava različite funkcije transkripcije. Fosforilaciju CTD -a katalizira jedan od šest općih transkripcijskih faktora, TFIIH. TFIIH ima dvije svrhe: jedna je odmotati DNA na mjestu početka transkripcije, a druga je fosforilirati. Oblik polimeraze IIA pridružuje se kompleksu predinicijacije, to se predlaže jer se IIA veže s većim afinitetom za TBP (TATA-box vezujući protein), podjedinicu općeg transkripcijskog faktora TFIID, nego oblik polimeraze IIO. Oblik polimeraze IIO olakšava produženje lanca RNA. [5] Metoda za pokretanje produženja vrši se fosforilacijom Serina na položaju 5 (Ser5), putem TFIIH. Novo fosforilirani Ser5 regrutira enzime kako bi zatvorio 5 'kraj novo sintetizirane RNK i "3' faktore prerade na poli (A) mjesta". [31] Nakon što je drugi Serin fosforiliran, Ser2, aktivira se produljenje. Kako bi se prekinulo produženje, mora doći do defosforilacije. Nakon što je domena potpuno defosforilirana, enzim RNAP II se "reciklira" i katalizira isti proces s drugim mjestom inicijacije. [31]

Oksidativno oštećenje DNA može blokirati transkripciju RNA polimeraze II i uzrokovati pucanje niti. Opisan je proces rekombinacije povezan s transkripcijom povezan s RNA koji može zaštititi od oštećenja DNA. [32] Tijekom G1/G0 faza staničnog ciklusa, stanice pokazuju skup homolognih rekombinacijskih faktora na dvolančanim prekidima unutar aktivno transkribiranih regija. Čini se da je transkripcija spojena na popravak dvolančanih lomova DNA homogenom rekombinacijom s uzorkom RNA. Ovaj proces popravka učinkovito i precizno spaja dvolančane prekide u genima koji se aktivno transkribiraju pomoću RNA polimeraze II.


Metilacija lizina 36 na histonu H3 (H3K36) katalizira Set2 metiltransferaza i povezana je s transkripcijskom regulacijom. Prethodne studije pokazale su da je trimetilacija H3K36 pomoću Set2 usmjerena povezivanjem s fosforiliranim ponavljanjima C-terminalne domene RNA polimeraze (RNAPII CTD). Ovdje pokazujemo da poremećaj ove interakcije upotrebom mutanata kvasca defektnih u CTD fosforilaciji na serinu 2 dovodi do destabilizacije razina proteina Set2 i metilacije H3K36. U skladu s tim, otkrivamo da Set2 ima kratak poluživot i da je sureguliran, s razinama fosforilacije RNAPII CTD, tijekom logaritamskog rasta kvasca. Da bismo ispitali funkcionalne posljedice razdvajanja regulacije Set2-RNAPII, izrazili smo krnji i stabilniji oblik Set2 koji je sposoban za dimetilaciju, ali ne i trimetilaciju in vivo. Rezultati visokopropusnih sintetičkih genetskih analiza pokazuju da ova varijanta Set2 ima različitu genetiku od bilo koje SET2 ili set2Δ i sintetski je bolestan ili smrtonosan s brojnim mutantima za produljenje transkripcije. Zajedno, ovi rezultati daju molekularni uvid u regulaciju razine proteina Set2 koji utječu na stanja metilacije H3K36.

Ovaj je rad u cijelosti ili djelomično podržan od strane Nacionalnog instituta za zdravstvo Grant R01GM68088 (za B. D. S.). Ovaj je rad također podržan od strane Nacionalne istraživačke službe za postdoktorsku stipendiju F32 GM80896 (S. M. F.).

Sadašnja adresa: Uprava za fizičke znanosti, Ured za istraživanje američke vojske, Park Triangle Park, NC 27709.


Reference

Kwak, H. & amp Lis, J. T. Kontrola produljenja transkripcije. Annu. Velečasni Genet. 47, 483–508 (2013).

Adelman, K. i amp Lis, J. Promotorsko-proksimalno pauziranje RNA polimeraze II: nove uloge u metazoanima. Nature Rev. Genet. 13, 720–731 (2012).

Kwak, H., Fuda, N. J., Core, L. J. & amp Lis, J. T. Precizne karte RNA polimeraze otkrivaju kako promotori usmjeravaju inicijaciju i pauziranje. Znanost 339, 950–953 (2013). U ovoj studiji pauziranje je mapirano na razini genoma s razlučivošću baznih parova, pokazujući ovisnost snažnog pauziranja proksimalnog promotora o elementima jezgre promotora.

Li, J. & amp Gilmour, D. Različiti mehanizmi pauziranja transkripcije orkestrirani GAGA faktorom i M1BP, novim transkripcijskim faktorom. EMBO J. 32, 1829–1841 (2013).

Weber, C. M., Ramachandran, S. & amp Henikoff, S. Nukleosomi su kontekstu specifične, H2A.Z-modulirane barijere za RNA polimerazu. Mol. Stanica 53, 819–830 (2014).

Peterlin, B. & amp Price, D. Kontrola faze produljenja transkripcije s P-TEFb. Mol. Stanica 23, 297–305 (2006).

Zhou, Q., Li, T. & amp Price, D. H. Kontrola produženja RNA polimeraze II. Annu. Rev. Biochem. 81, 119–143 (2012).

Lis, J., Mason, P., Peng, J., Price, D. & amp Werner, J. Regrutiranje i funkcioniranje kinaze P-TEFb na mjestima toplinskog šoka. Genes Dev. 14, 792–803 (2000).

Jonkers, I., Kwak, H. & amp Lis, J. T. Genomska dinamika produženja Pol II i njezino međusobno djelovanje s proksimalnim pauziranjem promotora, kromatinom i egzonima. eŽivot 3, e02407 (2014). Ova studija mjeri stopu produženja na cijelom genomu i pokazuje da je vrijeme poluraspada pauziranih kompleksa Pol II na 3.181 gena jednoliko dugo s prosjekom od 7 minuta.

Danko, C. i sur. Signalni putevi različito utječu na inicijaciju, pauziranje i produženje RNA polimeraze II u stanicama. Mol. Stanica 50, 212–222 (2013).

Alexander, R., Innocente, S., Barrass, J. & amp Beggs, J. Spajanje ovisne RNA polimeraze pauzirajući u kvascu. Mol. Stanica 40, 582–593 (2010).

Veloso, A. i sur. Brzina produženja RNA polimerazom II povezana je sa specifičnim svojstvima gena i epigenetskim modifikacijama. Genom Res. 24, 896–905 (2014).

Fuchs, G. i sur. 4sUDRB-seq: mjerenje brzine transkripcijskog produljenja genoma i učestalosti inicijacije unutar stanica. Genom Biol. 15, R69 (2014).

Saponaro, M. i sur. RECQL5 kontrolira produljenje transkripta i potiskuje nestabilnost genoma povezanu sa stresom transkripcije. Stanica 157, 1037–1049 (2014). Ovaj rukopis dokumentuje da RECQL5 usporava produženje transkripta i suzbija preuređivanje genoma na uobičajenim krhkim mjestima.

Dujardin, G. i sur. Koliko sporo produženje RNA polimeraze II pogoduje alternativnom preskakanju egzona. Mol. Stanica 54, 683–690 (2014).

Schor, I., Fiszbein, A., Petrillo, E. & amp Kornblihtt, A. Intragene epigenetske promjene moduliraju alternativno spajanje NCAM -a u neuronskoj diferencijaciji. EMBO J. 32, 2264–2274 (2013).

Mata, M. de la i sur. Spora RNA polimeraza II utječe na alternativno spajanje in vivo. Mol. Stanica 12, 525–532 (2003).

Moehle, E. A., Braberg, H., Krogan, N. J. & amp Guthrie, C. Avanture u vremenu i prostoru: učinkovitost spajanja i brzina produženja RNA polimeraze II. RNA Biol. 11, 313–319 (2014).

Plant, K., Dye, M., Lafaille, C. & amp Proudfoot, N. Snažna poliadenilacija i slaba pauza kombiniraju se kako bi uzrokovali učinkovito prekidanje transkripcije u genu humanog gama-globina. Mol. Stanica. Biol. 25, 3276–3285 (2005).

Gromak, N., West, S. & amp Proudfoot, N. Mjesta pauze promiču transkripcijsko prekidanje sisavaca, RNA polimeraze II. Mol. Stanica. Biol. 26, 3986–3996 (2006).

Skourti-Stathaki, K., Kamieniarz-Gdula, K. & amp Proudfoot, N. J. R-petlje induciraju represivne kromatinske oznake nad terminatorima gena sisavaca. Priroda 516, 436–439 (2014).

Hazelbaker, D., Marquardt, S., Wlotzka, W. & amp Buratowski, S. Kinetička konkurencija između RNA polimeraze II i terminacije transkripcije ovisne o Sen1. Mol. Stanica 49, 55–66 (2013).

Sainsbury, S., Bernecky, S. & amp Cramer, P. Strukturne osnove inicijacije transkripcije RNA polimerazom II. Mol. Stanica. Biol. 16, 129–143 (2015).

Porrua, O. & amp Libri, D. Terminacija transkripcije i kontrola transkriptoma: zašto, gdje i kako prestati. Mol. Stanica. Biol. 16, 190–202 (2015).

Venkatesh, S. S. & amp Workman, J. L. Izmjena histona, struktura kromatina i regulacija transkripcije. Mol. Stanica. Biol. 16, 178–189 (2015).

Ehrensberger, A. H., Kelly, G. P. & amp Svejstrup, J. Q. Mehanička interpretacija promotorsko-proksimalnih vrhova i karte gustoće RNAPII. Stanica 154, 713–715 (2013).

Venters, B. & amp Pugh, B. Genomska organizacija kompleksa za inicijaciju ljudske transkripcije. Priroda 502, 53–58 (2013).

Core, L. J. i sur. Određivanje statusa RNA polimeraze kod promotora. Stanična rep. 2, 1025–1035 (2012).

Rahl, P. i sur. c-Myc regulira oslobađanje transkripcijske pauze. Stanica 141, 432–445 (2010).

Henriques, T. i sur. Stabilno pauziranje pomoću RNA polimeraze II pruža priliku za ciljanje i integriranje regulatornih signala. Mol. Stanica 52, 517–528 (2013). Ova studija izvješćuje da su kompleksi za produljenje s promotorom vrlo stabilni, s poluživotom od nekoliko minuta D. melanogaster.

Core, L. J., Waterfall, J. J. & amp Lis, J. T. Nascentna RNK sekvencija otkriva široko rasprostranjenu pauziranje i divergentnu inicijaciju kod humanih promotora. Znanost 322, 1845–1848 (2008).

Min, I. M. i sur. Reguliranje pauziranja RNA polimeraze i produljenja transkripcije u embrionalnim matičnim stanicama. Genes Dev. 25, 742–754 (2011).

Nechaev, S. i sur. Globalna analiza kratkih RNA otkriva rašireno promotorsko-proksimalno usporavanje i zaustavljanje Pol II u Drosophila. Znanost 327, 335–338 (2010).

Gilchrist, D. i sur. Pauziranje RNA polimeraze II remeti organizaciju nukleosoma specifičnu za DNA kako bi se omogućila precizna regulacija gena. Stanica 143, 540–551 (2010).

Lee, H., Kraus, K., Wolfner, M. & amp Lis, J. Zahtjevi DNK sekvence za stvaranje pauzirane polimeraze na početku hsp70. Genes Dev. 6, 284–295 (1992).

Shopland, L., Hirayoshi, K., Fernandes, M. & amp Lis, J. Pristup HSF -a elementima toplinskog šoka in vivo ovisi o arhitekturi promotora definiranoj GAGA faktorom, TFIID i RNA polimerazom II veznim mjestima. Genes Dev. 9, 2756–2769 (1995).

Kouzine, F. i sur. Globalna regulacija taljenja promotora u naivnim limfocitima. Stanica 153, 988–999 (2013). Ova analiza cijelog genoma limfocita u mirovanju identificira taljenje promotora kao treći veliki korak koji ograničava brzinu u transkripciji (nakon stvaranja PIC-a i pauziranja).

Soutoglou, E. i amp Talianidis, I. Koordinacija montaže PIC-a i remodeliranja kromatina tijekom aktivacije gena izazvane diferencijacijom. Znanost 295, 1901–1904 (2002).

Brannan, K. i sur. čimbenici oduzimanja mRNA i funkcija egzonukleaze Xrn2 u raširenom preranom prekidu transkripcije RNA polimeraze II. Mol. Stanica 46, 311–324 (2012).

Wagschal, A. i sur. Mikroprocesori, Setx, Xrn2 i Rrp6 surađuju kako bi izazvali prerano prekidanje transkripcije pomoću RNAPII. Stanica 150, 1147–1157 (2012).

Cheng, B. i sur. Funkcionalna povezanost Gdown1 s RNA polimerazom II na ljudskim genima. Mol. Stanica 45, 38–50 (2012).

Jishage, M. i sur. Transkripcijska regulacija pomoću Pol II (G.) Uključujući posrednika i konkurentne interakcije Gdown1 i TFIIF s pol II. Mol. Stanica 45, 51–63 (2012).

Davis, M., Guo, J., Price, D. & amp Luse, D. Funkcionalne interakcije proteina Gdown1 i TFIIF u interakciji s RNA polimerazom II. J. Biol. Chem. 289, 11143–11152 (2014).

Chen, F., Gao, X. & amp Shilatifard, A. Stabilno pauzirani geni otkriveni inhibicijom inicijacije transkripcije triptolidom inhibitora TFIIH. Genes Dev. 29, 39–47 (2015).

Buckley, M. S., Kwak, H., Zipfel, W. R. & amp Lis, J. T. Kinetika promotora Pol II na Hsp70 otkriva stabilno pauziranje i ključne uvide u njegovu regulaciju. Genes Dev. 28, 14–19 (2014).

Saunders, A., Core, L., Sutcliffe, C., Lis, J. & amp Ashe, H. Opsežna pauza polimeraze tijekom Drosophila osno uzorkovanje omogućuje visoku razinu i savitljivu transkripciju. Genes Dev. 27, 1146–1158 (2013).

Rougvie, A. E. & amp Lis, J. T. Molekula RNA polimeraze II na 5 ′ kraju neinduciranog gena hsp70 D. melanogaster je transkripcijski angažiran. Stanica 54, 795–804 (1988).

Guenther, M., Levine, S., Boyer, L., Jaenisch, R. & amp Young, R. A. Orijentir kromatina i inicijacija transkripcije kod većine promotora u ljudskim stanicama. Stanica 130, 77–88 (2007).

Zeitlinger, J. i sur. RNA polimeraza koja zaustavlja gene za kontrolu razvoja u Drosophila melanogaster embrija. Genet prirode. 39, 1512–1516 (2007).

Lagha, M. i sur. Pauzirani pol II koordinira morfogenezu tkiva u Drosophila embrija. Stanica 153, 976–987 (2013).

Kapanidis, A. N. i sur. Početna transkripcija pomoću RNA polimeraze odvija se kroz mehanizam za skidanje DNA. Znanost 314, 1144–1147 (2006).

Pal, M., Ponticelli, A. & amp Luse, D. Uloga transkripcijskog mjehurića & amp TFIIB u klirensu promotora pomoću RNA polimeraze II. Mol. Stanica 19, 101–110 (2005).

Strobel, E. & amp Roberts, J. Regulacija promotorsko-proksimalnog produljenja transkripcije: poboljšano DNA scrunching tjera λQ antiterminator-ovisan bijeg iz pauze ovisne o σ70. Nukleinske kiseline Res. 42, 5097–5108 (2014).

Hendrix, D. A., Hong, J.-W. W., Zeitlinger, J., Rokhsar, D. S. & amp Levine, M. S. Promotorski elementi povezani sa zastojem RNA pol II u Drosophila embrija. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 105, 7762–7767 (2008).

Core, L. i sur. Analiza novonastale RNA identificira jedinstvenu arhitekturu regija inicijacije kod promotora i pojačivača sisavaca. Genet prirode. 46, 1311–1320 (2014).

Li, J. i sur. Kinetičko natjecanje između brzine produljenja i vezanja NELF-a kontrolira promotorsko-proksimalno pauziranje. Mol. Stanica 50, 711–722 (2013).

Hargreaves, D., Horng, T. & amp Medzhitov, R. Kontrola ekspresije inducibilnog gena transkripcijskim produljenjem ovisnim o signalu. Stanica 138, 129–145 (2009).

Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C. & amp Glass, C. K. Izbor i funkcija pojačivača specifičnih za stanični tip. Mol. Stanica. Biol. 16, 144–154 (2015).

Allen, B. L. & amp Taatjes, D. J. Kompleks medijatora: središnji integrator transkripcije. Mol. Stanica. Biol. 16, 155–166 (2015).

Takahashi, H. i sur. Podjedinica ljudskog posrednika MED26 funkcionira kao pristanište za faktore produljenja transkripcije. Stanica 146, 92–104 (2011).

Ghavi-Helm, Y. i sur. Petlje pojačivača izgledaju stabilne tijekom razvoja i povezane su s pauziranom polimerazom. Priroda 512, 96–100 (2014).

Lee, C. i sur. NELF i GAGA faktor povezani su s promotorsko-proksimalnom pauziranjem u mnogim genima u Drosophili. Mol. Stanica. Biol. 28, 3290–3300 (2008).

Farkas, G., Leibovitch, B. & amp Elgin, S. Organizacija kromatina i kontrola transkripcije ekspresije gena u Drosophila. Gen 253, 117–136 (2000).

Chopra, V. S. i sur. Transkripcijska aktivacija pomoću GAGA faktora dolazi izravnom interakcijom s dmTAF3. Dev. Biol. 317, 660–670 (2008).

Blau, J. i sur. Tri funkcionalne klase domene transkripcijske aktivacije. Mol. Stanica. Biol. 16, 2044–2055 (1996).

Krumm, A., Hickey, L. B. & amp Groudine, M.Promotorsko-proksimalno pauziranje RNA polimeraze II definira opći korak koji ograničava brzinu nakon početka transkripcije. Genes Dev. 9, 559–572 (1995).

Bunch, H. i sur. TRIM28 regulira proksimalno pauziranje i oslobađanje promotora RNA polimeraze II. Struktura prirode. Mol. Biol. 21, 876–883 (2014).

Jiang, L. i sur. Polo-slična kinaza 1 inhibira aktivnost pozitivnog faktora produljenja transkripcije RNA Pol II b (P-TEFb). PloS ONE 8, e72289 (2013).

Smith, E., Lin, C. & amp Shilatifard, A. Kompleks super produženja (SEC) i MLL u razvoju i bolesti. Genes Dev. 25, 661–672 (2011).

Itzen, F., Greifenberg, A., Bosken, C. & amp Geyer, M. Brd4 aktivira P-TEFb za fosforilaciju CTD RNA polimeraze II. Nukleinske kiseline Res. 42, 7577–7590 (2014).

Jang, M. i sur. Bromodomainski protein Brd4 pozitivna je regulatorna komponenta P-TEFb i stimulira transkripciju ovisnu o RNA polimerazi II. Mol. Stanica 19, 523–534 (2005).

Zou, Z. i sur. Brd4 održava konstitutivno aktivan NF-κB u stanicama raka vezanjem na acetilirani RelA. Onkogen 33, 2395–2404 (2014).

Huang, B., Yang, X.-D. D., Zhou, M.-M. M., Ozato, K. & amp Chen, L.-F. F. Brd4 koaktivira transkripcijsku aktivaciju NF-κB putem specifičnog vezanja na acetilirani RelA. Mol. Stanica. Biol. 29, 1375–1387 (2009).

Luo, Z. i sur. Obitelj kompleksa super elongacije faktora produljenja RNA polimeraze II: specifičnost genskog cilja i transkripcijski izlaz. Mol. Stanica. Biol. 32, 2608–2617 (2012).

Lin, C. i sur. Dinamički transkripcijski događaji u embrionalnim matičnim stanicama posredovani kompleksom super produženja (SEC). Genes Dev. 25, 1486–1498 (2011).

Smith, E. i sur. Mali kompleks za produljenje regulira transkripciju male nuklearne RNK. Mol. Stanica 44, 954–965 (2011).

Lin, C. i sur. AFF4, komponenta kompleksa za produljenje ELL/P-TEFb i zajednička podjedinica MLL himera, može povezati produženje transkripcije s leukemijom. Mol. Stanica 37, 429–437 (2010).

Luo, Z., Lin, C. & amp Shilatifard, A. Obitelj super elongacijskog kompleksa (SEC) u kontroli transkripcije. Mol. Stanica. Biol. 13, 543–547 (2012).

Gardini, A. i sur. Integrator regulira pokretanje transkripcije i pauziranje oslobađanja nakon aktivacije. Mol. Stanica 56, 128–139 (2014).

Kim, J., Guermah, M. & amp Roeder, R. G. Ljudski kompleks PAF1 djeluje u produženju transkripcije kromatina neovisno i u suradnji sa SII/TFIIS. Stanica 140, 491–503 (2010).

Wier, A., Mayekar, M., Héroux, A., Arndt, K. & amp VanDemark, A. Strukturne osnove za Spt5-posredovano regrutiranje kompleksa Paf1 u kromatin. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 110, 17290–17295 (2013).

On, N. i sur. Kompleks faktora povezanih s ljudskom polimerazom (PAFc) povezuje kompleks super produženja (SEC) s RNA polimerazom II na kromatinu. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 108, E636–645 (2011).

Flajollet, S. i sur. Komponente kompleksa za produljenje BRD4 i MLLT3/AF9 transkripcijski su koaktivatori nuklearnih retinoidnih receptora. PloS ONE 8, e64880 (2013).

Diamant, G. & amp Dikstein, R. Kontrola transkripcije pomoću NF-κB: produljenje u fokusu. Biochim. Biophys. Acta 1829, 937–945 (2013).

Nowak, D. i sur. Fosforilacija RelA Ser276 potrebna je za aktivaciju podskupa gena ovisnih o NF-κB regrutiranjem kompleksa kinaze 9/ciklin T1 ovisnih o ciklin. Mol. Stanica. Biol. 28, 3623–3638 (2008).

Barboric, M., Nissen, R. M., Kanazawa, S., Jabrane-Ferrat, N. & amp Peterlin, B. M. NF-κB veže P-TEFb kako bi potaknuo transkripcijsko produljenje RNA polimerazom II. Mol. Stanica 8, 327–337 (2001).

Mertz, J. i sur. Ciljanje ovisnosti o MYC -u u raku inhibiranjem BET bromodomena. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 108, 16669–16674 (2011).

Lovén, J. i sur. Selektivna inhibicija tumorskih onkogena uništavanjem super pojačivača. Stanica 153, 320–334 (2013). Ova studija pokazuje da su iznimno visoke razine koaktivatora Mediator i BRD4 povezane sa super-pojačivačima koji potiču ekspresiju ključnih onkogena.

Delmore, J. i sur. BET inhibicija bromodomena kao terapijska strategija za ciljanje c-Myc. Stanica 146, 904–917 (2011).

Oeckinghaus, A., Hayden, M. & amp Ghosh, S. Crosstalk u signalnim putovima NF-κB. Nature Immunol. 12, 695–708 (2011).

Fang, L. i sur. ATM regulira gene koji su ovisni o NF-κB neposredno i rano putem fosforilacije RelA Ser 276 spojene na regrutiranje promotora CDK9. Nukleinske kiseline Res. 42, 8416–8432 (2014).

McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A. & amp D'Orso, I. Transkripcijski faktori posreduju u enzimskom rastavljanju 7SK snRNP vezanog za promotor kako bi lokalno regrutirali P-TEFb za produženje transkripcije. Stanična rep. 5, 1256–1268 (2013).

Gilchrist, D. i sur. Reguliranje regulatora: sveprisutni učinci pauziranja Pol II na genske mreže koje reagiraju na podražaj. Genes Dev. 26, 933–944 (2012).

Ji, X. i sur. SR proteini surađuju s 7SK i s promotorom povezanom nastajućom RNA kako bi oslobodili pauziranu polimerazu. Stanica 153, 855–868 (2013). Ova studija implicira protein koji se veže za RNA i za koji se tradicionalno smatralo da funkcionira kao splajs u reguliranom oslobađanju pauziranog Pol II do produktivnog produljenja.

Barborić, M. i sur. 7SK snRNP/P-TEFb produžava transkripciju parova s ​​alternativnim spajanjem i bitan je za razvoj kralježnjaka. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 106, 7798–7803 (2009).

Hnisz, D. i sur. Super pojačivači u kontroli staničnog identiteta i bolesti. Stanica 155, 934–947 (2013).

Whyte, W. i sur. Glavni transkripcijski faktori i medijator uspostavljaju super-pojačivače u genima za identifikaciju ključnih stanica. Stanica 153, 307–319 (2013).

Brown, J. D. i sur. NF-κB usmjerava dinamičko stvaranje super pojačivača u upali i aterogenezi. Mol. Stanica 56, 219–231 (2014).

Lai, F. i sur. Aktiviranje RNA povezano je s Medijatorom radi poboljšanja arhitekture i transkripcije kromatina. Priroda 494, 497–501 (2013).

Yamaguchi, Y., Inukai, N., Narita, T., Wada, T. & amp. Handa, H. Dokazi da negativni faktor produljenja potiskuje produženje transkripcije vezanjem na faktor koji izaziva osjetljivost DRB/RNA polimerazu, II kompleks i RNK. Mol. Stanica. Biol. 22, 2918–2927 (2002).

Schaukowitch, K. i sur. Enhancer RNA olakšava oslobađanje NELF -a iz neposrednih ranih gena. Mol. Stanica 56, 29–42 (2014).

Schaaf, C. A. i sur. Kontrola aktivnosti gena RNA polimeraze II pomoću kohezina. PLoS Genet. 9, e1003382 (2013).

Thummel, C. S., Burtis, K. C. & amp Hogness, D. S. Prostorni i vremenski obrasci transkripcije E74 tijekom Drosophila razvoj. Stanica 61, 101–111 (1990).

Heidemann, M., Hintermair, C., Voß, K. & amp Eick, D. Dinamički obrasci fosforilacije RNA polimeraze II CTD tijekom transkripcije. Biochim. Biophys. Acta 1829, 55–62 (2013).

Glover-Cutter, K., Kim, S., Espinosa, J. & amp Bentley, D. RNA polimeraza II zastaje i povezuje se s faktorima pre-mRNA obrade na oba kraja gena. Struktura prirode. Mol. Biol. 15, 71–78 (2007).

Martin, R., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T. i amp. Carmo-Fonseca, M. Vizualizacija živih stanica pre-mRNA spajanja s osjetljivošću na jednu molekulu. Stanična rep. 4, 1144–1155 (2013).

Zentner, G. & amp Henikoff, S. Regulacija dinamike nukleosoma modifikacijama histona. Struktura prirode. Mol. Biol. 20, 259–266 (2013).

Bintu, L. i sur. Nukleosomski elementi koji kontroliraju topografiju barijere za transkripciju. Stanica 151, 738–749 (2012). U ovoj studiji, optička pinceta korištena je za mjerenje kretanja pojedinačnih transkripcijskih kompleksa Pol II kroz nukleosome u stvarnom vremenu i na taj način opisuje energetske barijere u nukleosomima koje bi mogle pridonijeti pauziranju.

Ardehali, M. B. i sur. Spt6 povećava brzinu produženja RNA polimeraze II in vivo. EMBO J. 28, 1067–1077 (2009).

Wu, L., Li, L., Zhou, B., Qin, Z. & amp Dou, Y. Sveprisutna H2B promicanje procesiranosti RNA pol II putem PAF1 i pTEFb. Mol. Stanica 54, 920–931 (2014).

Jung, I. i sur. H2B monoubiquitylation je aktivna transkripcijska oznaka obogaćena 5′ i korelira sa strukturom egzona-introna u ljudskim stanicama. Genom Res. 22, 1026–1035 (2012).

Shilatifard, A., Conaway, R. C. & amp Conaway, J. W. Kompleks za produljenje RNA polimeraze II. Annu. Rev. Biochem. 72, 693–715 (2003).

Amit, M. i sur. Diferencijalni sadržaj GC-a između egzona i introna uspostavlja različite strategije prepoznavanja mjesta spajanja. Stanična rep. 1, 543–556 (2012).

Tilgner, H. i sur. Pozicioniranje nukleosoma kao odrednica prepoznavanja egzona. Struktura prirode. Mol. Biol. 16, 996–1001 (2009).

Schwartz, S., Meshorer, E. & amp Ast, G. Organizacija kromatina označava egzonsko-intronsku strukturu. Struktura prirode. Mol. Biol. 16, 990–995 (2009).

Close, P. i sur. DBIRD kompleks integrira alternativno spajanje mRNA s produljenjem transkripta RNA polimeraze II. Priroda 484, 386–389 (2012).

Huff, J., Plocik, A., Guthrie, C. & amp Yamamoto, K. Recipročna intronska i egzonična područja modifikacije histona u ljudi. Struktura prirode. Mol. Biol. 17, 1495–1499 (2010).

Saint-André, V., Batsché, E., Rachez, C. & amp Muchardt, C. Trimetilacija histona H3 lizina 9 i HP1γ pogoduju uključivanju alternativnih egzona. Struktura prirode. Mol. Biol. 18, 337–344 (2011).

Schor, I. E., Rascovan, N., Pelisch, F., Alló, M. i amp. Kornblihtt, A. R. Depolarizacija neuronskih stanica inducira intragene modifikacije kromatina koje utječu na alternativno spajanje NCAM -a. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 106, 4325–4330 (2009).

Ip, J. i sur. Globalni utjecaj inhibicije produženja RNA polimeraze II na alternativnu regulaciju spajanja. Genom Res. 21, 390–401 (2011).

Hein, P. P. i sur. Pauziranje RNA polimeraze i nastajanje strukture RNA nastaju povezivanjem kretanja domene stezaljke. Struktura prirode. Mol. Biol. 21, 794–802 (2014).

Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. & amp Gromak, N. Ljudski senataksin razgrađuje RNK/DNA hibridi nastali na mjestima pauze za transkripciju radi promicanja terminacije ovisne o Xrn2. Mol. Stanica 42, 794–805 (2011).

Ozer, A., Pagano, J. M. & amp Lis, J. T. Nove tehnologije omogućuju kvantne promjene u razmjeru, brzini i uspjehu SELEX metoda i karakterizaciji aptamera. Mol. Ther. Nukleinske kiseline 3, e183 (2014).

Lee, T. I. & amp Young, R. A. Transkripcijska regulacija i njezina pogrešna regulacija u bolesti. Stanica 152, 1237–1251 (2013).

Zuber, J. i sur. RNAi zaslon identificira Brd4 kao terapijski cilj u akutnoj mijeloičnoj leukemiji. Priroda 478, 524–528 (2011).

Dawson, M. i sur. Inhibicija BET regrutiranja u kromatin kao učinkovit tretman za MLL-fuzijsku leukemiju. Priroda 478, 529–533 (2011).

Singh, J. i amp Padgett, R. Stope od in situ transkripcija i spajanje velikih ljudskih gena. Struktura prirode. Mol. Biol. 16, 1128–1133 (2009).

Churchman, L. & amp Weissman, J. Nascent transkripcijsko sekvenciranje vizualizira transkripciju pri razlučivanju nukleotida. Priroda 469, 368–373 (2011).

Yao, J., Munson, K., Webb, W. & amp Lis, J. Dinamika povezanosti faktora toplinskog šoka s nativnim genskim lokusima u živim stanicama. Priroda 442, 1050–1053 (2006).

Boireau, S. i sur. Transkripcijski ciklus HIV-1 u stanicama u stvarnom vremenu i živim. J. Stanični biol. 179, 291–304 (2007).

Brody, Y. i sur. The in vivo kinetika produljenja RNA polimeraze II tijekom ko-transkripcijskog spajanja. PLoS Biol. 9, e1000573 (2011).

Darzacq, X. i sur. In vivo dinamika transkripcije RNA polimeraze II. Struktura prirode. Mol. Biol. 14, 796–806 (2007).

Tennyson, C. N., Klamut, H. J. & amp Worton, R. G. Ljudskom genu distrofina potrebno je 16 sati za transkripciju i kotranskripcijski je spojen. Genet prirode. 9, 184–190 (1995).

Mason, P. & amp Struhl, K. Razlika i odnos amp između brzine elongacije i procesnosti pojačanja RNA polimeraze II in vivo. Mol. Stanica 17, 831–840 (2005).

Ameur, A. i sur. Sekvenciranje ukupne RNA otkriva transkripciju u nastajanju i široko rasprostranjeno ko-transkripcijsko spajanje u ljudskom mozgu. Struktura prirode. Mol. Biol. 18, 1435–1440 (2011).


Uvod

Nakon što se RNA polimeraza II (Pol II) i opći transkripcijski faktori okupe da tvore kompleks prije inicijacije (PIC) na promotoru, on sintetizira kratku mRNA od 30 � baza, a zatim pauzira (promotorsko-proksimalna pauza ili PPP) [ 1 𠄶] (Slika 1A). PPP je induciran s dva mehanizma. Prvo, PIC izravno inhibiraju dva proteinska kompleksa: 5,6-diklor-1-β-D-ribofuranosilbenzimidazol (DRB) faktor koji izaziva osjetljivost (DSIF, koji sadrži Supt4a i Supt5) i negativni faktor produljenja (NELF, sastavljen podjedinica AE). Drugo, promotor produženja transkripcije, pozitivni faktor produženja transkripcije b (P-TEFb, koji se sastoji od Cdk9 i bilo CycT1, CycT2 ili CycK), sekvestriran je u inhibitornom kompleksu 7SK malog nuklearnog ribonukleoproteina (7SK snRNP). U 7SK snRNP, nekodirajuća RNA 7SK služi kao skela za okupljanje četiri proteinske podjedinice (Hexim1, Hexim2, Larp7 i Mepce) oko P-TEFb [7]. Razni proteini i RNA oslobađaju P-TEFb iz 7SK snRNP, aktivirajući Cdk9 kinazu. Kao rezultat toga, Cdk9 oslobađa NELF i pretvara DSIF u faktor koji potiče produljenje, oba putem fosforilacije (slika 1B). Cdk9 također fosforilira serin 2 (S2P) na karboksi-terminalnoj heptapeptidnoj ponavljajućoj domeni (CTD) u najvećoj podjedinici Pol II, olakšavajući regrutiranje strojeva za obradu RNA i čimbenike remodeliranja kromatina. Nasuprot tome, pauzirani Pol II karakterizira fosforilacija serina na 5. poziciji (S5P) na CTD -u. PPP je visoko rasprostranjen, između 10% i 50% cijelih gena istodobno prolazi kroz PPP u mnogim staničnim tipovima, a samo oko polovica njih nastavlja produženje transkripcije [1,8 �]. Kao što se i očekivalo od ove rasprostranjenosti, Pol II se oslobađa iz PPP -a kroz mnoge mehanizme u različitim kontekstima. Ovaj pregledni članak prvo će opisati eksperimentalne pristupe koji se obično koriste za proučavanje PPP-a, a zatim će se pristupiti mehanizmima na kojima se temelji oslobađanje P-TEFb iz 7SK snRNP-a i regrutiranje P-TEFb-a u njegove ciljne gene, dva koraka koji ograničavaju brzinu oslobađanja Pol II iz JPP -a. Konačno, tijekom ćemo raspravljati o regulaciji JPP -a Drosophila razvoja i pluripotentne diferencijacije matičnih stanica, budući da su to najrašireniji modeli.

Ključni igrači odgovorni za promotorsko-proksimalno pauziranje RNA polimeraze II. Prikazani su pauzirani status (A) i otpušteni status (B) RNA polimeraze II.

Genomski pristupi za ispitivanje JPP-a

Po definiciji, proučavanje PPP-a zahtijeva otkrivanje uzorka distribucije Pol II unutar određenog gena, što se obično provodi imunoprecipitacijom kromatina (ChIP), nakon čega slijedi analiza mikromrežama (ChIP-čip) ili sekvenciranje sljedeće generacije (ChIP-seq. ) ( Stol 1 ). Ovi pristupi imaju snagu detektirati ne samo Pol II i njegove fosforilirane oblike, već i nekoliko kovalentnih histonskih modifikacija karakterističnih za pauzirane gene, sve unutar istog niza eksperimenata. Studije ChIP-čipova pokazale su da su promotori pauziranih gena tipično obogaćeni histonskim obilježjima karakterističnim za inicirane gene, poput trimetiliranog lizina 4 histona H3 (H3K4me3) i acetiliranih H3K9 i H3K14, uz Pol II S5P [8]. Nadalje, pauzirani geni obično nemaju markere transkripcijskog produženja na kodirajućim regijama, uključujući H3K36me3, H3K79me2 i Pol II S2P.

Stol 1

Genomski pristupi koji se obično koriste za otkrivanje PPP-a.

FaktorPrincipiReference
ChIP-čip i ChIP-seqKoriste se antitijela protiv Pol II, Pol II S2P i Pol II S5P, kao i različiti modificirani histoni.[8,14,51,52]
GRO-seqNovonastale RNA koje su inkorporirale 5-bromouridin 5 ′-trifosfat izoliraju se s anti-deoksi bromouridinskim antitijelom i sekvenciraju.[9,10,14]
PRO-seqNovonastale RNK koje su uključivale biotinilirani NTP izolirane su kuglicama streptavidina radi sekvenciranja[11]
Analiza RNA s kratkim ograničenjemKratke mRNA (𼄀 baze) s kapom od 5 ′ izoliraju se s anti-cap antitijelom i sekvenciraju.[12]

Pol II: RNA polimeraza II Pol II S2P: RNA polimeraza II s fosforiliranim serinom na 2. položaju u karboksi-terminalnoj heptapeptidnoj ponavljajućoj domeni GRO-seq: Globalno pokretanje sekvenciranjem PRO-seq: Precizno pokretanje

Definitivni dokazi za pauziranu transkripciju zahtijevaju otkrivanje duljine transkripta. Globalno sekvenciranje pri pokretanju (GRO-seq) je nuklearni test nuklearnog testa u cijelom genomu, u kojem su novonastali transkripti označeni 5-bromouridin 5 ′-trifosfatom (BrUTP) [9]. Označene RNA se zatim pročišćavaju upotrebom zrnaca protiv deoksi-BrU i šalju na sekvenciranje sljedeće generacije. Ovaj pristup je osobito koristan u određivanju kako je oslobađanje specifičnih podražaja pauziralo Pol II, dopuštajući produženje u određenoj vremenskoj točki. Precision Run-On Sequencing (PRO-seq) sekvenciranje je modifikacija GRO-seqa, u kojem reakcije uključuju biotinilirane NTP. Ugradnja prvog biotiniliranog NTP inhibira daljnje produljenje, dopuštajući otkrivanje novonastalih transkripata pri razlučivosti s jednom bazom, za razliku od razlučivosti od 30 do 50 baza s GRO-seq [11].

Zatvaranje mRNA sa 7-metilguanozinom odvija se na kraju 5 ′ tijekom početne faze transkripcije [12]. Poklopac štiti mRNA od razgradnje egzonukleaze, dopuštajući dovršetak transkripcije. Stoga se kratke mRNA (𼄀 baze) s kapom od 5 ′ mogu izolirati i sekvencirati za identifikaciju pauziranih mRNA pomoću tehnike poznate kao analiza RNA s kratkim kapicama [13].

Među tim pristupima na cijelom genomu, pristupi temeljeni na ChIP-u lakše su dostupni laboratorijima opće stanične biologije od pristupa temeljenih na mRNA, koji zahtijevaju opsežnu optimizaciju. Nedavno izvješće pokazalo je da su GRO-seq podaci općenito u skladu s podacima ChIP-seq dobivenim korištenjem protutijela protiv Pol II [14]. Trenutno istraživanje PPP-a obično koristi kombinaciju GRO-seq i ChIP-seq iz Pol II.

Oslobađanje P-TEFb iz 7SK snRNP

Otprilike polovica P-TEFb u jezgri sekvestrirana je u 7SK snRNP [15]. Oslobađanje P-TEFb iz 7SK snRNP predstavlja jedan od prvih koraka prema oslobađanju Pol II iz PPP. Različiti čimbenici, uključujući vezne proteine, fosfataze, proteaze i RNA, uključeni su u ovaj korak (Tablica 2) i ne isključuju se međusobno. U nastavku je istaknuto nekoliko reprezentativnih primjera.

Tablica 2

Čimbenici povezani s oslobađanjem P-TEFb iz 7SK snRNP.

ČimbeniciMehanizmiReferenca
PP2B i PP1 αSekvencijalno defosforilirati 7SK snRNP i Cdk9[16]
PPM1GRegrutirali su NF-㮫 i Tat, te defosforilira Cdk9[17]
TatPromjena potvrde 7SK RNA[18]
HIC mRNANatječe 7SK RNA iz 7SK snRNP konkurencijom[20]
SRSF1 i 2Veže sekvencu pojačivača egzoničnog spajanja u novonastaloj mRNA[21]
Kalpain 2Cijepa Mepce[22]
JMJD6Dekapira 7SK RNA i destabilizira 7SK snRNP[25]
AFF1Promiče Tatino vađenje P-TEFb iz 7SK snRNP[55]
PIP7SOdržava integritet 7SK snRNP -a[56]

PP2B: Protein fosfataza 2B PP1 α: Protein fosfataza 1 α 7SK snRNP: 7SK mali nuklearni ribonukleoprotein PPM1G: Protein fosfataza, Mg 2+ /Mn 2+ ovisan, 1G NF-㮫-Nuclear & Nuclear3-Factor: Nuclear Protein Phosphatase : Tirozin aminotransferaza HIC: Humana I-mfa domena koja sadrži protein SRSF: Faktor spajanja bogat serinom/argininom JMJD6: Jumonji protein koji sadrži C-domenu 6 AFF1: AF4/FMR2 Član obitelji 1 P-TEFb: Faktor produženja pozitivne transkripcije b PIP7S: P-TEFb-interakcijski protein za stabilnost 7SK

Izlaganje stanica ultraljubičastom svjetlu ili heksametilen bisacetamidu (HMBA) narušava 7SK snRNP i oslobađa P-TEFb [16]. Oba sredstva aktiviraju kalcijev ion-kalmodulin-protein fosfatazu 2B (PP2B), koja opušta strukturu 7SK snRNP, iako se detalji tek trebaju proučiti. Opuštanje omogućuje da druga fosfataza, proteinska fosfataza 1 α (PP1 α), dobije pristup izloženom Cdk9, koji defosforilira treonin na 186. poziciji (Thr186) u T-petlji Cdk9. To pak dovodi do oslobađanja P-TEFb iz 7SK snRNP. Defosforilacija Thr186 inducirana je i u fiziološkom kontekstu. Na primjer, nuklearni faktor-㮫 (NF-㮫) i virus humane imunodeficijencije (HIV) -1 protein Tat regrutiraju PPM1G (proteinska fosfataza, Mg 2+ /Mn 2+ ovisan, 1G) u promotore, koji također defosforilira Thr186 [17].Međutim, proces posredovan fosfatazom možda nije jedini mehanizam koji Tat koristi za oslobađanje P-TEFb iz 7SK snRNP. To je zbog njegove sposobnosti da veže i oslobađa P-TEFb iz 7SK snRNP bez upotrebe drugih čimbenika in vitro [18]. Dapače, in vitro proces je popraćen konformacijskom promjenom 7SK RNA i oslobađanjem Hexim1 iz 7SK RNP.

Ljudska I-mfa domena koja sadrži protein (HIC) u interakciji je s CycT1 radi inhibiranja P-TEFb-ovisne transkripcije [19]. Nasuprot tome, HIC mRNA ima suprotan učinak na transkripciju. 3 ′ neprevedena regija (UTR) HIC mRNA nužna je i dovoljna za aktiviranje ekspresije gena na HIV-1 promotoru istiskivanjem 7SK RNA iz P-TEFb, dopuštajući joj disocijaciju od 7SK snRNP [20]. To se objašnjava nadmetanjem između sličnih struktura ukosnica na 3 ′ krajnjim regijama HIC mRNA i 7SK RNA. Suprotne funkcije HIC proteina i HIC mRNA osvjetljavaju složenost oslobađanja P-TEFb iz 7SK snRNP i mnoge aspekte regulacije pauze u transkripciji.

Oslobađanje P-TEFb također je izravno povezano sa spajanjem novonastale mRNA. Faktor spajanja 1 i 2 bogat s arinom/argininom (SRSF1 i SRSF2), glavne komponente strojeva za spajanje, vežu 7SK snRNP na aktivne promotore gena [21]. Kada sekvenca pojačivača egzoničnog spajanja u novonastaloj mRNA, kao što je GAAGGA, veže SRSF, oni se oslobađaju iz 7SK snRNP zajedno s P-TEFb, dopuštajući pauziranje oslobađanja. Zbog široke distribucije SRSF -ova u genomu, ovaj će se mehanizam vjerojatno koristiti u mnogim kontekstima pauziranja.

Svi prethodno opisani mehanizmi otpuštanja su reverzibilni, ali postoji i nepovratan mehanizam. Tijekom diferencijacije megakariocita, priljev kalcija aktivira proteazu kalpain 2, uzrokujući cijepanje podjedinice Mepce 7SK snRNP, potičući oslobađanje P-TEFb i povećavajući gene za pregradnju citoskeleta [22]. GATA1 je poznat kao uzvodni transkripcijski faktor koji regulira ekspresiju kalpaina 2. Skraćeni mutant GATA1 u megakariocitnoj leukemiji ne uspijeva pojačati regulaciju kalpaina 2, otkrivajući vezu između oslobađanja Pol II, stanične diferencijacije i leukemogeneze.

Zapošljavanje P-TEFb-a

P-TEFb oslobođen iz 7SK RNP-a mora se regrutirati u promotore ciljnih gena. Ovaj proces zapošljavanja također je raznolik (Tablica 3), često se koristi više mehanizama unutar jednog zapošljavanja, kao što su primjer Brd4 i Posrednik sažeti u nastavku. Regrutiranje P-TEFb pomoću c-Myc i MyoD također će se raspravljati kao primjeri izravno relevantni za staničnu diferencijaciju. Imajte na umu da oslobađanje P-TEFb iz 7SK snRNP i regrutiranje oslobođenog P-TEFb u promotore nisu nužno uzastopni koraci. Ti se procesi u nekim slučajevima ne razlikuju kronološki jer jedan protein, poput Brd4, može biti uključen u oba koraka.

Tablica 3

Čimbenici odgovorni za regrutiranje P-TEFb-a u promotore.

FaktorFunkcijeReference
Brd4Ne veže P-TEFb[15,23]
Vezuje posrednika[24]
Veže JMJD6 za oslobađanje P-TEFb[25]
Veže Oct4 i regulira gene pluripotencije u ESC -ima[57]
Posrednik (MED26)Regrutira P-TEFb kao dio SEC-a[28]
Posrednik (MED23)Veže P-TEFb u ESC-ima[30]
HIF1APotiče interakciju Medijator-SEC[29]
c-MycIzravno veže Cdk9 i CycT1[31,32]
Veže trećinu aktivnih gena u ESC -ima[33]
MyoDVeže P-TEFb za aktiviranje gena za diferencijaciju mišića[37]
IkarosVeže Cdk9 za produljenje gena γ globina u eritroidnim stanicama[46]
GATA1Veže P-TEFb tijekom diferencijacije megakariocita[47]
TIF1 γRegrutira P-TEFb u eritroidne gene tijekom eritropoeze[48]
Klf4Regrutira P-TEFb tijekom formiranja iPSC-a[52]
NF-㮫Regrutira P-TEFb u promotor IL-8 nakon stimulacije TNF-om i#x003b1[58]
Cdk8Veže Posrednika i potiče produženje[59]
STAT3Veže Cdk9 nakon indukcije IL-6 u stanicama hepatoblastoma[60]
Receptor estrogena αPrevladava pauziranje na intronu 1 gena MYB nakon vezanja estrogena[61]
Androgeni receptorVeže P-TEFb nakon stimulacije androgenom u stanicama raka prostate[62]
PPAR γIzravno veže Cdk9 tijekom adipogeneze[63]
Receptor arilnih ugljikovodikaRegrutira P-TEFb u gen citokroma P450 nakon vezanja na aril ugljikovodik[64]

Brd4: Bromodomain koji sadrži 4 P-TEFb: Faktor produljenja transkripcije b JMJD6: Protein koji sadrži C-domenu Jumonji 6 ESC: Embrionalne matične stanice SEC: Kompleks super-produženja HIF1A: Faktor induciran hipoksijom 1A CycT1: Ciklin T1 Binding1 Protein 1 TIF1 γ: Transkripcijski posrednički faktor 1 γ Klf4: Kruppelov faktor 4 NF-㮫: Nuklearni faktor-㮫 STAT3: Pretvarač signala i aktivator 3 IL-6: Interleukin 6 PPAR γ: Proliferator aktivirani receptor γ

Brd4 je član proteina obitelji bromodomainske i ekstraterminalne domene (BET) [15,23]. Brd4 je sveprisutno izražen i veže slobodni P-TEFb koji se oslobađa iz 7SK snRNP. Budući da Brd4 veže acetilirani histon H3 i H4 putem bromodomaina, u početku je predloženo regrutiranje P-TEFb u acetilirane promotore. Međutim, kasnije je otkriveno da bromodomene nisu potrebne da Brd4 regrutira P-TEFb u promotore [24]. Umjesto toga, Brd4 se regrutira u promotore posrednikom ili drugim kromatinskim komponentama. Dodatno, Brd4 stupa u interakciju s proteinom 6 koji sadrži jumonji C-domenu (JMJD6) na pojačivačima i regulira oslobađanje Pol II iz PPP-a putem interakcija na daljinu između pojačivača i promotora [25]. U tom kontekstu, aktivnost dvostruke demetilaze JMJD6 igra ključnu ulogu u produljenju transkripcije. Prvo, aktivnost demetilaze proteina JMJD6 usmjerena je prema simetričnoj dimetilaciji H4R3 (H4R3me2s), markera za supresiju gena, i doprinosi aktivaciji gena. Drugo, aktivnost RME demetilaze JMJD6 uklanja metilnu skupinu na 5 ′ kapi u 7SK RNA (dekapiranje), što destabilizira 7SK snRNP, što rezultira oslobađanjem P-TEFb. U ljudskim embrionalnim bubrežnim stanicama HEK293T, više od 1.200 gena suregulirano je Brd4 i JMJD6, što ukazuje na prevalenciju ovog mehanizma.

P-TEFb također posreduje u promotore putem više mehanizama. Medijator je proteinski kompleks sastavljen od 26 temeljnih podjedinica koji služe kao fizički i funkcionalni most između Pol II i transkripcijskih faktora vezanih za DNA tijekom inicijacije i produženja transkripcije [26,27]. Podjedinica MED26 regrutira P-TEFb kao dio kompleksa super-produženja (SEC) promotorima c-Myc i hsp70 [28]. Zapošljavanje SEC-a osobito je važno jer sadrži druge podjedinice koje potiču produljenje nakon oslobađanja, kao što su jedanaest i devetnaest članova obitelji bogatih lizinom u leukemiji (ELL) i faktori povezani s ELL-om (EAF) 1 i 2. Dodatno, interakciju između medijatora i SEC-a inducira faktor 1A (HIF1A) induciran hipoksijom u hipoksičnim stanicama raka dojke [29]. Medijator također koristi drugu podjedinicu MED23 za regrutiranje P-TEFb u promotor gena koji reagira na serum Egr1 u embrionalnim matičnim stanicama miša (ESC) putem izravne interakcije s Cdk9 [30].

Onkoprotein c-Myc izravno veže Cdk9 i CycT1 na različitim domenama i regrutira ih na ciljane gene [31,32]. U mišjim ESC-ima, c-Myc veže trećinu aktivno transkribiranih gena [33]. Liječenje ESC-a kemijskim inhibitorom c-Myc ili nokdandiranjem c-Myc shRNA smanjuje Pol II u kodirajućim regijama ciljnih gena bez utjecaja na razinu Pol II u promotorima. Ovo pruža dokaze da je c-Myc odgovoran za reguliranje oslobađanja Pol II iz pauze. Budući da je c-Myc jedan od četiri gena koji se koriste za uspostavu induciranih pluripotentnih matičnih stanica (iPSC) [34], njegovo oslobađanje Pol II iz pauziranih gena može biti jedna od njegovih funkcija tijekom stvaranja iPSC-a.

MyoD je glavni regulator mišićne diferencijacije [35]. On stupa u interakciju s P-TEFb u proliferirajućoj i ranoj fazi diferencijacije mioblasta [36]. Interakcija u ranoj fazi diferencijacije dovodi P-TEFb do ciljnih gena MyoD-a specifičnih za diferencijaciju, poput miogenina i mišićne kreatin kinaze [37]. Funkcije interakcije u fazi proliferacije ostaju nejasne, međutim, sposobnost Cdk9 da fosforilira MyoD može regulirati njegovu aktivnost neovisno o pauziranju otpuštanja [36].

Razvojne uloge JPP -a u Drosophila

PPP je otkriven 1986. u genu toplinskog šoka hsp70 u Drosophila stanična linija [38]. Međutim, prošlo je više od 20 godina prije nego što je učestalost PPP-a u cijelom genomu – 10 �% svih Drosophila geni – otkriveni su 2007. primjenom ChIP-chip tehnike [39,40]. Dok je veliki broj pauziranih gena povezan s toplinskim šokom i drugim podražajnim odgovorima, gotovo trećina pauziranih gena igra ulogu u razvoju, poput diferencijacije stanica i komunikacije stanica-stanica [39]. Ovi su rezultati doveli do tumačenja da PPP djeluje kao kontrolna točka za kontrolu točno određene aktivacije gena tijekom razvoja. Taj je pojam u skladu s početnim otkrićem JPP -a na hsp70, koji se brzo aktivira pod utjecajem topline.

Pauzirani razvojni geni uključuju one koji sudjeluju u stvaranju embrionalne osi i gastrulaciji u Drosophila. Put morfogenetskog proteina kosti (BMP) regulira dorzalno-ventralno uzorkovanje i 25 gena uključenih u ovaj put je pauzirano [41]. Pauzirani su i geni za segmentaciju (geni, geni za pravila parova i geni za polaritet segmentacije) koji određuju prednju i stražnju os. Među mnogim pauziranim razvojnim genima, pravodobno oslobađanje Pol II osobito je važno za Puž gen (sna), koji je ključni regulator za epitelno-mezenhimalni prijelaz i stvaranje mezoderma [42,43]. sna je izražen u oko 1.000 pretpostavljenih mezodermnih stanica, a sinkronizirana aktivacija gena bitna je za koordiniranu invaginaciju stanica. Kad je čvrsto zastao sna promotor je zamijenjen umjereno pauziranim sog promotora gena, rezultiralo je mješovitom embrionalnom populacijom s normalnom i djelomičnom invaginacijom. Zamjena nezaustavljenim ths promotor je potpuno ukinuo invaginaciju u većini embrija, a normalna invaginacija rijetko se mogla otkriti.

Studije s Drosophila također je pružio neočekivan uvid u novi mehanizam JPP -a. Rušenje NELF -a trebalo je prvenstveno pojačati ekspresiju gena oslobađanjem Pol II, međutim, povećalo je 71 gen i snizilo 170 gena od ukupno 18 500 gena [44]. Sniženi regulatori gena pokazali su ne samo smanjenje Pol II, što se očekivalo zbog nedostatka NELF -a, već i povećanu popunjenost nukleosoma, što je potencijalni mehanizam za promatranu sniženu regulaciju [44,45]. Ovo otkriće sugerira da se Pol II i nukleosomi međusobno natječu za zauzimanje u regijama promotora u sniženim genima. Budući da je rušenje NELF -a također povećalo mnoge gene, moraju postojati dodatni regulatorni mehanizmi koji diktiraju konačni ishod ekspresije gena. Osim toga, nedavno izvješće pokazalo je da pauziranje nije jednostavno stanje uključivanja/isključivanja 90% transkripcijski aktivnih gena (7.036 od 7.734) djelomično je pauzirano u Drosophila embrija [41]. Ovi nalazi ukazuju na prisutnost više slojeva mehanizama finog podešavanja koji čekaju daljnje proučavanje.

Uloge PPP -a u pluripotentnim matičnim stanicama

Pluripotentne matične stanice i hematopoetske stanice bile su glavne vrste stanica koje su se koristile za proučavanje razvojne uloge PPP -a u stanicama sisavaca. Fokus ovog odjeljka bit će prvenstveno na pluripotentnim matičnim stanicama zbog dubljih mehaničkih i genomskih studija u usporedbi s hematopoetskim stanicama [22,46 �]. Zapravo, prva distribucija PPP-a u cijelom genomu u stanicama sisavaca opisana je u ljudskim ESC-ima [8]. Pojava PPP-a u ESC-ima analizirana je pomoću GRO-seq i ChIP-seq Pol II u ESC miša, kao i ChIP-čipa Pol II u ljudskim ESC (Tablica 4).

Tablica 4

Usporedba PPP analiza u različitim tipovima stanica.

Vrste stanicaMetode otkrivanjaPostotak pauziranjaKategorije pauziranih genaOdnos pluripotencijeReferenca
Miševi ESC -i kultivirani serumomGRO-seq39%Pluripotencija, odgovor na oštećenje DNA, translacija, stanični ciklus i katabolizamPol II nije značajno pauziran u regulatorima razvoja. Geni pluripotencije djelomično su pauzirani.[10]
MEF -oviGRO-seq34%Odgovor na oštećenje DNA, translacija, stanični ciklus i katabolizamNije diskutirano[10]
Miševi ESC -a kultivirani s 2iGRO-seq i ChIP-seq iz Pol IINe raspravlja seStanični ciklus, transdukcija signala i stanična proliferacijaPol II nije značajno pauziran u regulatorima razvoja.[14]
Miševi ESC -a kultivirani s 2iChIP-seq Pol IINe raspravlja seNije diskutiranoOpćenito povećanje PPP -a nakon rasta stanica uzgojenih s 2i nego sa serumom.[51]
Miš iPSCChIP-seq Pol IINe raspravlja seListopada4 u kasnijoj fazi reprogramiranjaKlf4 regrutira Cdk9 u promotore pluripotencije.[52]
Ljudski ESC -i kultivirani serumomChIP-čip od Pol II-S5P52%Ne raspravlja seNe raspravlja se[8]
Ljudski hepatocitiChIP-čip Pol II36%Ne raspravlja seNe raspravlja se[8]
Ljudske B staniceChIP-čip Pol II42%Ne raspravlja seNe raspravlja se[8]

Za razliku od početnih nalaza u Drosophila izravne veze između PPP -a i regulacije razvoja, čini se da nema konačne veze u stanicama sisavaca. Broj gena RefSeq pauziranih u ESC -ima i MEF -ima miša, 39% odnosno 34%, prilično je sličan [10]. U oba tipa stanica, pauzirani geni su prvenstveno iz staničnog ciklusa, katabolizma i odgovora na oštećenje DNA što je pokazano ontološkom analizom gena GRO-seq podataka. Pol II nije otkriven u genima pluripotencije u MEF -ima, u skladu s nedostatkom ekspresije. Neočekivano, geni pluripotentnosti ESC -a pokazuju značajno obogaćivanje Pol II unutar promotora u usporedbi s kodirajućim regijama, što ukazuje na to da se barem djelomični PPP događa na tim lokusima. Značenje parcijalnog JPP -a zahtijeva daljnja istraživanja kako bi se razjasnila njegova uloga u održavanju pluripotencije. Prevalenca PPP-a u ljudskim stanicama također je slična između pluripotentnih stanica i diferenciranih stanica što je uočeno s ChIP-čipom Pol II-S2P u hepatocitima (36% gena koji kodiraju proteine), B stanicama (42%) i ESC-ima (52 %) [8]. Kategorije pauziranih gena tek se trebaju opsežno okarakterizirati u ljudskim pluripotentnim matičnim stanicama.

Miševi ESC-i tradicionalno su uzgajani u prisutnosti seruma, međutim stanje bez seruma nazvano 2i sustav, koji koristi dva inhibitora kinaze, nedavno se široko rasprostranjeno koristi kao kemijski definiraniji sustav kulture [49]. Nakon uzgoja sa serumom, ESC-i pokazuju propuštenu ekspresiju mnogih gena specifičnih za lozu i heterogenu ekspresiju gena za pluripotenciju [50]. Neočekivano, stanice uzgojene pod uvjetom 2i pokazuju nižu ekspresiju gena specifičnih za lozu, kao i homogeniju ekspresiju gena za pluripotenciju od stanica uzgojenih u medijima na bazi seruma [49,51]. To nije posljedica nedostatka PPP -a u ESC -ima uzgojenim u prisutnosti seruma. U usporednoj GRO-seq analizi PPP-a u stanicama uzgojenim serumom i 2i, nije bilo značajne razlike u genskim obiteljima koje su pauzirane između dva stanja [14]. Geni koji su pokazali najveće razine PPP -a u oba uvjeta kulture bili su oni uključeni u transdukciju signala i regulaciju staničnog ciklusa, a ne diferencijaciju ili pluripotenciju. To sugerira da PPP ne igra značajnu ulogu u regulaciji razvojnih gena u ESC -ima.

U funkcionalnijem smislu, manipulacija PPP -om tijekom reprogramiranja MEF -a na iPSC -ove može pružiti novi pristup poboljšanju kvalitete i učinkovitosti reprogramiranja stanica. Tijekom reprogramiranja postoje dva vala aktivacije gena, prvi su geni povezani s proliferacijom, metabolizmom i citoskeletom, dok su drugi prvenstveno geni pluripotencije i njihovi regulatori [52]. Tijekom reprogramiranja postoji značajna PPP u 55% gena drugog vala, ponajviše Oct4 [52]. Uloga PPP-a u reprogramiranju dodatno je proučavana rušenjem nekoliko ključnih gena uključenih u sekvestraciju i oslobađanje P-TEFb. Uklanjanje PPP -a snižavanjem regulacije Hexim1 ili povećanom regulacijom Brd4 ubrzava stvaranje iPSC -a, kao i povećanje broja iPSC kolonija [52]. Alternativno, povećana regulacija Hexim1 ili snižena regulacija Brd4 dovodi do zastoja u reprogramiranju prije drugog vala. Osim čimbenika izravno uključenih u strojeve PPP -a, faktor pluripotencije Klf4 regrutira Cdk9 u gene pluripotencije tijekom reprogramiranja, kao i u ESC -ovima [52]. Rušenje Klf4 dovodi do značajnog smanjenja opterećenja Cdk9 genima za pluripotenciju i njihove ekspresije. Nadalje, većina gena uključenih u kasnu fazu reprogramiranja meta su Klf4, što ukazuje na veliku ulogu oslobađanja PPP -a u stvaranju iPSC -a. Osim stvaranja iPSC -a, strogom kontrolom ekspresije čimbenika povezanih s održavanjem i otpuštanjem PPP -a, možda će biti moguće preciznije reprogramirati stanice u široki raspon loza, poput konverzije fibroblasta u živčane stanice [53 �].


Glavni tekst

Održavajte integritet genoma nakon oštećenja DNA

Stanice se stalno suočavaju s agensima koji oštećuju DNA i endogenog i egzogenog podrijetla [28]. Ove glomazne DNK lezije potrebno je popraviti prirodno prilagođenim strojevima za popravak DNA [29]. Ako nisu popravljene ili pogrešno popravljene, lezije DNA mogu uzrokovati nakupljanje DNK pogrešaka i veliku prijetnju stabilnosti genoma, što je znak raka, starenja, neurodegeneracije i imunosnih nedostataka [30]. Dvolančani prekidi DNA (DSB) obično nastaju napadom elektrofilnih molekula poput reaktivnih vrsta kisika, što dovodi do lezija u oba lanca DNA dvostruke spirale [31]. DSB se uglavnom percipira kinazom mutiranom (ATM) ataksija telangiektazijom koja je kritična za neposredni odgovor na oštećenje DNA (DDR) [32]. ATM fosforilira i regulira aktivnost nekoliko supstrata u popravku DNA, uključujući p53-vezujući protein 1 (53BP1). Za održavanje stabilnosti genoma, stanice biraju između dva različita načina popravljanja DSB-a: homologna rekombinacija (HR) i nehomologno spajanje krajeva (NHEJ) [33]. Na putu HR, helikaze i nukleaze se regrutiraju da resektiraju 5 'DNK krajeve kako bi generirali dva 3' jednolančana DNK prevjesa. Resekcija kraja 5 ′ završava se uklanjanjem kratkog oligonukleotida kroz aktivnosti proteina u interakciji s C-terminalnim proteinom (CtIP) i kompleksa Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN), nakon čega slijedi Exo1 ili DNA2-BLM [34]. Fosforilirani replikacijski protein A (RPA) veže se za 3 ′ jednolančane DNK prevjese i uklanja sekundarne strukture DNA što zauzvrat dovodi do stvaranja nukleofilamenta RAD51. Nit RAD51 će tada promicati invaziju lanaca homologne DNA i kasnije točan popravak DSB -a [34, 35]. Stanice također mogu popraviti DSB -ove putem NHEJ -a.Tijekom klasičnog NHEJ -a, slomljeni krajevi DNA brzo su vezani i blokirani Ku70 – Ku80 heterodimerom (Ku) koji štiti DNA od resekcije 5 ′ kraja i drži slomljene DNA u neposrednoj blizini [36]. DSB se zatim obrađuju i spajaju kompleksom Ligase 4 (Lig4), XRCC4, XLF [36]. DSB se također mogu popraviti alternativnim putevima NHEJ-a, poput mikrohomološki posredovanog spajanja (MMEJ), bez zapošljavanja Ku ili Lig4. MMEJ se pokreće resekcijom kraja poput HR-a, ali slijedi spajanje kraja kratkim izravnim ponavljanjem mikrohomologije [37]. Za razliku od HR-a, koji regrutira homologne sekvence izvan procesa replikacije DNK kako bi promicao popravak DNA bez grešaka, NHEJ usmjerava ligacije krajeva DSB-a na način koji je sklon greškama tijekom staničnog ciklusa. Oba puta popravljanja ovise o osjetnicima oštećenja DNA, pretvaračima i efektorima za otkrivanje i popravljanje lomova. Budući da se sva ta zbivanja događaju na kromatinu, raznolikost histonskih modifikacija na kromatinu može utjecati na izbor između HR i NHEJ.

H3K36me3 u popravku bez grešaka (HR)

Prvi znakovi sudjelovanja H3K36me3 u popravljanju DNK su genetski pregledi malih razmjera. U Saccharomyces cerevisiae, prekomjerna ekspresija RPH1 koji demetilira H3K36me3 prvenstveno dovodi do defekta rasta kao odgovor na UV zračenje [38]. Osim toga, enzim za katalizaciju H3K36me3, Set2, uključen je u aktivaciju kontrolne točke replikacije inducirane hidroksiureeom (HU) [39]. Osim ovih znakova H3K36me3 u popravku DNA, novi dokazi pokazuju da proteini koji sadrže Pro-Trp-Trp-Pro (PWWP) -domenu prepoznaju metilaciju H3 lizina i djeluju kao sidra između metilacije histona i nizvodnih efektora, uključujući 53BP1 [40, 41]. Rani molekularni mehanizmi o tome kako H3K36me3 sudjeluje u DSB -ovima prijavljeni su 2012. Psip1 kodira dvije proteinske izoforme alternativnim spajanjem, p52 i p75 [42]. Izoforma p75, također poznata kao faktor rasta dobiven iz epitela leće (LEDGF), protein je povezan s kromatinom uključen u rak, autoimune bolesti, patogenezu HIV-a i preživljavanje stanica. LEDGF/p75 olakšava HR u stanicama S- i G2 faze i iscrpljivanje p75 senzibilizira stanice na ionizirajuće zračenje, kamptotecin i mitomicin C [43]. LEDGF/p75 veže CtIP na način ovisan o oštećenju DNK, stoga prisiljava pristup DSB-ima radi promicanja popravka DNA. Štoviše, N-terminalna PWWP domena p75 posebno prepoznaje H3K36me3. Ovo vezanje je kritično za konstitutivnu povezanost p75 s kromatinom. P75-mutirani PWWP (W21A) p75 koji ne veže histone ili kromatin ugrožava asocijaciju p75 i CtIP induciranu kamptotecinom. Sposobnost p75 da štiti stanice od citotoksičnosti izazvane kamptotecinom također je smanjena mutacijom W21A. Nalaz p75 povezan s H3K36me3 u popravku DNK naglašava izravnu ulogu H3K36me3 u regulaciji HR. U izvješću Pradeepa i sur. [44], pokazalo se da izoforma p52, kojoj nedostaje C-terminal dugačke izoforme p75, prepoznaje H3K36me3 po N-terminalnoj PWWP domeni i povezuje se s aktivnim transkribiranim genima. Kada se stanični lizati imunoprecipitiraju pomoću p52, masena spektrometrija otkriva da je poznato da oko 95% proteina koji vežu p52 funkcionira u pre-mRNA obradi, dok je Srsf1 jedan od glavnih pogodaka [44]. Osiromašenje p52 genskom zamkom u embrionalnim matičnim stanicama miša dovodi do smanjene razine Srsf1 povezane s H3K36me3. Mikrorezom i RT-PCR analizom utvrđeno je da gubitak p52 uzrokuje alternativno spajanje RNA. Još važnije, distribucija Srsf1 pogrešno je predstavljena oko alternativno spojenih egzona s gubitkom p52. Zajedno, unatoč sličnoj N-terminalnoj domeni PWWP poput p75, p52 igra ključnu ulogu u moduliranju spajanja mRNA [44]. U ovoj studiji Pradeepa i sur., funkcija p52 u putu popravljanja oštećenja DNA nije ispitana jer su korišteni sustavi iscrpljivanja zamka gena ili izbacivanje iz Psip1 koji iscrpljuje i p52 i p75. Potrebno je dodatno analizirati hoće li iscrpljivanje p52 utjecati na HR put ili će komplementacija p52 u sustavu nokautiranja Psip1 spasiti HR put.

Za istraživanje DSB-a u stanicama, istraživači su razvili umjetni sustav za uvođenje DSB-a u genom: stabilne stanične linije koje izražavaju restrikcijski enzim (AsiSI) spojene s domom koja veže ligand modificiranog receptora estrogena (ER), koja je usmjerena na jezgru pod kontrolom 4-hidroksitamoksifena (4OHT). Nuklearna lokalizacija AsiSI -a mogla bi brzo generirati oko 150 DSB -a u cijelom genomu [45]. Kad se ovim sustavom DSB unose u stanice, RAD51, koji potiče invaziju homolognih niti tijekom HR, regrutira se u kromatin pomoću H3K36me3 u aktivno transkribiranim genima [46]. Osiromašenje bilo koje komponente osi H3K36me3: p75 narušava vezanje RAD51. Štoviše, ovo regrutiranje RAD51 također ovisi o H3K36me3 u laserskim oštećenjima DNA i I-SceI-induciranim DSB-ima. Zanimljivo je da H3K36me3 nije induciran ni na jednom mjestu DSB-a pod AsiSI aktivacijom, što ukazuje na to da H3K36me3 već postoji na aktivno transkribiranim genima kako bi se ti genomski lokusi pripremili za popravak DSB-a [46,47,48]. Osim RAD51, os H3K36me3: p75 također olakšava vezanje RPA na mjesta oštećenja DNA radi promicanja HR [49]. Smanjivanjem razine H3K36me3 prekomjernom ekspresijom H3K36 demetilaze KDM4A smanjuju se događaji popravljanja HR -a [49]. Osim toga, H3K36me3 ukršta druge histonske oznake, poput H4K16ac, olakšavajući interakcije odgovarajuće histon acetil transferaze s kompleksom za popravak DNA [50]. Osim p75, MRG15, protein koji veže histon, prepoznaje i H3K36me3. MRG15 igra kao adapter za učitavanje PALB2, što je kritično za invaziju niti tijekom HR -a [51]. Kao i p75, regrutiranje PALB2, koje se događa prije DSB -a, osigurava trenutni odgovor na stres DNK [51]. Osim ovih nizvodnih efektora, H3K36me3 je također važan za aktivaciju ranih senzora u DSB -ovima. Iako mehanizam pojedinosti nije jasan, aktivacija ATM -a, koji je izravan senzor u ranoj signalizaciji oštećenja DNA, oslabljena je iscrpljenjem SETD2 [48]. Zanimljivo je zapažanje da PRDM9, histonska metiltransferaza specifična za mejozu, odgovorna za H3K4me3 i H3K36me3, posreduje u stvaranju DSB-a svojom aktivnošću metiltransferaze u testisima [52]. Mjesta H3K4me3 specificirana prema PRDM9 analiziraju se za nadmetanje stvaranja DSB-a. Mjesta H3K36me3 posredovana PRDM9 također mogu sudjelovati u formiranju DSB-a što ukazuje na dinamiku H3K36me3 nakon formiranja DSB-a.

U fisijskom kvascu, metilacija H3K36 ovisna o Set2 i acetilacija H3K36 ovisna o Gcn5 antagonistički kontroliraju odabir HR i NHEJ puta [53]. Metilacija H3K36 smanjuje dostupnost kromatina i potiče NHEJ, dok acetilacija H3K36 povećava dostupnost kromatina i inducira HR. Osiromašenje bilo Set2 ili Gcn5 primi popravak DNA na drugi put. U fisijskom kvascu razina H3K36me3 raste do vrhunca u G1 fazi kada prevladava NHEJ, dok se H3K36me2 i H3K36ac povećavaju nakon otpuštanja G1 kada prevladava HR. Štoviše, popravak ekscizijom baze (BER) oštećenja alkiliranja uzrokovanih metil metansulfonatom regulira H3K36me3 u kvascu koji se razmnožava. Visoke razine već postojećeg H3K36me3 povezane su s nižim BER-om na distalnim mjestima translacije i paradoksalno bržim popravkom na translacijskim položajima u blizini dijade nukleosoma [54]. Set2 je jedini enzim odgovoran za H3K36me1/me2/me3 u kvascu, što otežava razlikovanje funkcionalnih razlika između H3K36me2 i H3K36me3 u popravku oštećenja DNA. U skladu s različitim funkcijama H3K36me2 i H3K36m3, SETMAR posredovana H3K36me2 nastaje nakon ionizirajućeg zračenja i regrutira NBS1 i Ku za promicanje NHEJ-a u odgovoru DSB-a u ljudskim stanicama [55].

H3K36me3 u popravku "brzo i prljavo" (NHEJ)

Zanimljivo je da SETD2 promiče regrutiranje 53BP1 i RAD51 u DSB -ove tijekom popravka DNA [48]. Kromatsko vezanje 53BP1 na DSB -u potiče NHEJ inhibirajući 5 ′ kraj resekcije prekida DNK, dok regrutiranje RAD51 pločica put popravljanja do HR. Ova kontradiktorna novačenja 53BP1 i RAD51 povećavaju mogućnost da H3K36me3 funkcionira u regulaciji NHEJ -a. Osim PWWP domena, poznato je da Tudor domene prepoznaju metilirane histonske proteine ​​[56]. U ljudskim stanicama, PHD protein prsta 1 (PHF1) koji sadrži Tudor domenu povezan je s proteinima za popravak oštećenja DNA. PHF1 se regrutira na DSB stranice ovisno o Ku koji je senzor za NHEJ. Nadalje, iscrpljivanje PHF1 senzibilizira stanice na oštećenje DNA izazvano rendgenskim zrakama i povećava učestalost HR [39]. Mehanizmi funkcioniranja PHF1 u DDR -u prikazani su u strukturnim studijama [57]. Tudor domena PHF1 prvenstveno se veže za H3K36me3 peptide među H3K4, H3K9, H3K36 metiliranim i nemodificiranim peptidima. Kristalografska struktura rendgenskih zraka od 1,9 Å pokazuje da bočni lanac peptida H3K36me3 stupa u interakciju s ostacima W41, Y47, F65 i F71 PHF1. Prepoznavanje između H3K36me3 i PHF1 inhibira H3K27me3 in vitro i in vivo. U smislu da je H3K27me3 oznaka za utišane genomske lokuse, ovi nalazi sugeriraju da zadržavanje PHF1 na mjestima oštećenja DNA održava otvoreni kromatin. Daljnje studije pokazuju da Tudor domena stupa u interakciju s česticama jezgre nukleosoma (NCP) koja sadrži analog metil-lizina na položaju 36 histona H3 (H3KC36me3-NCP). Ova interakcija ne ovisi samo o tri-metilaciji H3K36 već i o mjestu DNA unutar NCP-a [58]. Kroz ovu paralelnu interakciju, PHF1 olakšava in vitro povezivanje transkripcijskog faktora LexA s DNA omotanom oko nukleosoma, što je nedostupno u potpuno omotanom nukleosomu. Ovi nalazi ukazuju na ulogu PHF1 u čitanju H3K36me3 u potpori otvorenog kromatina za učinkovito popravljanje DNA. Štoviše, PHRF1, povezan s RNAPII nakon oštećenja DNA [59], modulira NHEJ kroz interakcije s H3K36me2 i H3K36me3 [60].

H3K36me3 regulira i HR i NHEJ puteve, gdje su LEDGF/p75 i MRG15 glavni čitači za HR, a PHF1 je glavni čitač za NHEJ u stanicama sisavaca. Budući da su svi ti čitači izraženi u stanicama, izbor načina popravljanja može ovisiti o tome koji su čitatelji obilno prisutni na kromatinu označenom H3K36me3. Stanični sustavi koji se koriste za staničnu analizu fenotipa su stanice HEK293T u proučavanju PHF1 [57], dok se stanice U2OS, Hela i MEF koriste za otkrivanje povezanosti LEDGF/p75 i MRG15 s H3K36me3 na HR putu [43, 51]. Bit će zanimljivo provjeriti jesu li razine proteina čitatelja različite ili su drugi adapteri sudjelovali u zapošljavanju čitatelja. Moguće je i da drugi histonski znakovi mogu sudjelovati u odluci o izboru puta popravka DSB -a [61]. Na primjer, H3K36me2, H4K20me1/me2, H3K79me2 i H4K16ac uključeni su u popravak DSB -a radi promicanja NHEJ -a [55, 62,63,64,65]. Štoviše, ove oznake histona uglavnom su povezane s transkripcijom aktivnog gena poput H3K36me3. Sveobuhvatna analiza H3K36me3 i drugih koegzistirajućih histonskih oznaka na mjestima DSB-a može pomoći u seciranju kombiniranih oznaka histona u odabiru puta popravljanja DSB-a.

H3K36me3 u popravku malih lezija (popravak neusklađenosti DNA)

Osim DSB -ova, greške u bazi/bazi i mali ubacivanje/brisanje koji se stvaraju tijekom replikacije DNA popravljaju se popravkom neusklađenosti DNA (MMR). Senzori za MMR u ljudskim stanicama su hMSH2-hMSH6 (hMutSα) i hMSH2-hMSH3 (hMutSβ) [66]. Defekti u MMR -u uzrokuju mikrosatelitsku nestabilnost (MSI) kao obilježje staničnog fenotipa [67]. Rekonstituirani nukleosomi s DNK koji sadrži neusklađenost loš su supstrat za in vitro MMR sustav, što ukazuje da su u MMR-u potrebne modifikacije histona i proteini čitača [68]. HMutSα se regrutira na kromatin kroz PWWP domenu hMSH6 koja izravno stupa u interakciju s H3K36me3. Zanimljivo je da brojnost žarišta hMutSα korelira s razinama H3K36me3 tijekom staničnog ciklusa, gdje njihove razine dosežu najveće u ranoj S fazi, do umjerene u srednjoj S fazi, a najniže u kasnim S i G2/M fazama . Kao i kod popravljanja HR -a, H3K36me3 se unaprijed učitava u genomske lokuse kako bi regrutirao MMR strojeve hMutSα prije nego što se tijekom replikacije DNA unesu greške [69, 70]. Ono što je još važnije, nuklearni ekstrakti kompetentni za MMR nisu mogli popraviti neusklađenost koja se nalazi između dva nukleosoma s H3K36me3, što dodatno podupire ideju da H3K36me3 unaprijed postavlja genomske lokuse s hMutSα, nakon što se otkriju drugi MMR signali i replikacija DNA, kako bi se pokrenuo popravak DNA . Studije u cijelom genomu pokazuju da je MM3 posredovana s H3K36me3 MMR prvenstveno obogaćen eksonima i aktivno transkribiranim regijama radi zaštite transkribiranih gena [71]. Fenotipski, stanice s nedostatkom H3K36me3 pokazuju povećanu učestalost spontanih mutacija i MSI. Prekomjerna ekspresija KDM4A-C koji katalizira demetilaciju H3K9me2/3 i H3K36me2/3, ali ne i KDM4D koji demetilira samo H3K9me2/3 prekida stvaranje hMutSα žarišta tijekom S faze. Štoviše, stanice s prekomjernom ekspresijom KDM4A-C pokazuju smanjeni MMR [72]. Ova opažanja pokazuju da H3K36me3 također funkcionira u MMR -u za održavanje stabilnosti genoma.

H3K36me3 povezan DDR u tumorigenezi

H3K36me3 može negativno ometati DSB -e ograničavajući dostupnost kromatina kroz pozicioniranje nukleosoma ili, izravnije, pogodovanjem popravljanju DSB -a [73, 74]. Poremećaj popravljanja DSB -a povezanih s H3K36me3 inhibira preustroj imunoglobulina V (D) J u B -stanicama [75] i potiče tumorigenezu agresivnih karcinoma, poput karcinoma bubrežnih stanica bez stanica (ccRCC) [76], akutne mijeloične leukemije (AML) [77 ], i difuzni unutarnji pontinski gliom (DIPG) [78].

SETD2 mutacije su identificirane u stanicama ccRCC kao homozigotne skraćene mutacije i gubitak broja kopija [79,80,81]. Osim smanjenog popravljanja oštećenja DNA pomoću HR, SETD2 mutirani tumori ccRCC pokazuju da se promijenjena organizacija kromatina dogodila prvenstveno na aktivno transkribiranim genima, što je dovelo do zadržavanja introna i aberantnog spajanja [47]. Smanjenje H3K36me3 dovodi do alternativne uporabe egzona u spajanju RNA u tumorima ccRCC [82]. Štoviše, geni koji pokazuju aberantno spajanje, uključujući TP53, ATR, PTEN i CCNB1, su supresori tumora čija će inaktivacija potaknuti tumorigenezu [80]. SETD2-mutirane ccRCC stanice ne uspijevaju aktivirati p53 fosforilacijom i povećanom razinom proteina koja je ključna kao glavni čuvar genoma nakon oštećenja DNA, pokazujući poremećenu aktivaciju kontrolnog toka staničnog ciklusa i smanjeno preživljavanje stanica [76]. Ovi nalazi rasvjetljavaju zapažanje da je, unatoč niskoj učestalosti mutacije TP53, kontrolna točka staničnog ciklusa p53 obično defektna u tumorima ccRCC. Osim toga, iscrpljivanje SETD2 u stanicama ccRCC otkriva aberantno zbijanje nukleosoma i povezanost kromatina ključnog proteina replikacije MCM7 i delta DNA polimeraze [83, 84].

AML stanice obično nose SETD2 mutacije koje ukidaju DDR komponente pre učitavanja. Oštećeni DDR inhibira staničnu apoptozu izazvanu sredstvima koja oštećuju DNA i povećava spontane mutacije na mjestima smanjenog H3K36me3 [77, 85]. Liječenje inhibitorima KDM4A (H3K9 i H3K36 demetilaze) obnavlja razinu H3K36me3 i senzibilizira AML stanice na agense koji oštećuju DNA. Osim uloge u popravljanju oštećenja DNA, SETD2 je također potreban za održavanje visoke razine H3K79me2 u AML stanicama. Farmakološka inhibicija DOT1L, metiltransferaze H3K79, sinergira s SETD2 mutacijama kako bi izazvala oštećenje DNA, zaustavljanje rasta i apoptozu, što ukazuje na unakrsni razgovor o H3K36me3 i H3K79me2 u AML stanicama [86, 87].

Tumori s manjkom MMR-a selektivno stječu varijante s jednim nukleotidom (SNV) u regijama s aktivnim histonskim oznakama, osobito H3K36me3, što ukazuje na ulogu MMR-a ovisnog o H3K36me3 u tumorigenezi [88]. U posljednje vrijeme, širenjem genomskog sekvenciranja velikih razmjera, somatske mutacije proteina histona nalaze se u raznim tumorima. Ove histonske mutacije igraju ulogu poput onkogena u promicanju tumorigeneze, pa se tako visoke učestalosti histonskih mutacija nazivaju i onkohistoni [89]. Onkohistonska mutacija H3 detektirana je visokom frekvencijom u agresivnim slučajevima DIPG -a, što dovodi do glicina 34 do argininske ili valin mutacije (H3G34R/V) [90, 91]. Biokemijske studije pokazale su da ove mutacije H3G34, koje zamjenjuju ostatke nestraničnog lanca s velikim ostacima bočnog lanca, smanjuju odgovarajući H3K36me3 na histonskim proteinima H3G34R/V, posebno inhibicijom H3K36 metiltransferaze SETD2 [78]. Još važnije, ova inhibicija H3K36me3 događa se na mjestima ugradnje mutacija H3G34 [92]. U ljudskim stanicama postoji 15 kopija gena koji kodiraju varijante kanonskog histona H3.1/H3.2 i histona H3.3, dok je H3K36 sačuvan u svim proteinima histona H3. Kako ova pojedinačna heterozigotna mutacija u 15 gena dovodi do tumorigeneze? U fisijskom kvascu koji eksprimira samo mutirani H3G34R, popravak oštećenja DNK smanjen je, a dinamika popravljanja DNA na kompromitiranoj replikacijskoj vilici je odgođena [93]. Međutim, poznato je da H3K36me3 kontrolira NHEJ u fisijskom kvascu [53]. Mutacija H3G34R može dovesti do uočenih nedostataka HR -a na neizravan način. Iako ovaj model ne oponaša in-situ status mutacije H3G34R u slučajevima DIPG-a jer su ove stanice kvasca modificirane tako da eksprimiraju samo mutant H3, on baca svjetlo na funkcije smanjenja popravka oštećenja DNA i povećane nestabilnosti genoma u tumorigenezi DIPG-a . U ljudskim stanicama, mutacije H3G34R/V blokiraju interakcije H3K36me3 i hMutSα, sprječavajući učitavanje MMR kompleksa u kromatin [78]. Stanice koje nose mutacije H3G34R/V pokazuju tjedni fenotip mutatora, poput povećanog MSI-a i veće stope mutacije uzrokovane lijekom. Stoga mutacije H3G34 potiču nestabilnost genoma i eventualno tumorigenezu ometajući MMR aktivnost. Osim ovih poznatih rezultata, jedna je vrlo zanimljiva hipoteza da bi li sama mutacija G34R generirala novo mjesto za metilaciju na repu histona [94].

H3G34R/W/L mutacije također se nalaze u tumoru kostiju divovskih stanica, što ukazuje na nedostatak popravka oštećenja DNA u tim tumorima [95]. Uz mutacije H3G34, mutacije H3K36M, pronađene u preko 90% slučajeva hondroblastoma i u velikoj podskupini sarkoma glave i vrata, funkcioniraju kao dominantni negativni regulatori za smanjenje H3K36me2 i H3K36me3 na histonu H3 divljeg tipa [95,96,97, 98]. Onkohistoni H3K36M reduciraju H3K36me2 i H3K36me3 u cijelom genomu inhibicijom najmanje dvije histonske H3K36 metiltransferaze, NSD2 i SETD2 [96,97,98,99]. Unošenje heterozigotne mutacije H3.3K36M u kondrocite smanjuje metilaciju H3K36 i naknadnu ekspresiju gena povezanih s rakom. Štoviše, promjene ekspresije gena i metilacije H3K36 jako su povezane [96]. U mezenhimskim matičnim stanicama miša, heterozigotna mutacija H3.3K36M uzrokuje globalno smanjenje metilacije H3K36, kao i nedostatke stanične diferencijacije [97]. Poznato je da je metilacija H3K36 antagonistična prema H3K27me3. Doista, H3K27me3 raste u međugenim regijama gdje se H3K36me2 smanjuje u stanicama mutacije H3.3K36M [97, 98]. Još uvijek nije poznato kako ova mutacija H3K36M kontrolira popravak oštećenja DNA [94, 99].Treba uložiti dodatne napore kako bi se otkrili detaljni molekularni mehanizmi kako onkohistoni potiču tumorigenezu putem puteva popravljanja oštećenja DNA.

Liječenje tumora sa smanjenim H3K36me3

Jedan dobro poznati inhibitor ccRCC -a s nedostatkom H3K36me3 je inhibitor WEE1 AZD1775, koji djeluje sintetski s iscrpljivanjem H3K36me3 kako bi se smanjio rast tumorskih stanica. AZD1775 i H3K36me3 oboje ciljaju RPM2 koja je podjedinica ribonukleotid reduktaze odgovorna za unos dNTP. Smanjeni H3K36me3 potiskuje ekspresiju gena RPM2, dok inhibicija WEE1 razgrađuje protein RPM2 aktivacijom CDK. Dakle, iscrpljivanje H3K36me3 i inhibicija WEE1 regresiraju rast stanica raka izgladnjivanjem dNTP [100]. Što je još važnije, ova sintetička smrtnost vjerojatno ne ovisi o nedostatku HR [100]. Međutim, inhibitor WEE1 nije prikladan za liječenje AML stanica. U AML modelu s SETD2 mutacijama, razine proteina RPM2 su nepromijenjene, što ukazuje na učinke gubitka SETD2 na ekspresiju gena ovisne o staničnom kontekstu. Budući da se SETD2 veže i regulira različite podskupine gena u različitim stanicama, iscrpljivanje SETD2 uzrokuje izravne i neizravne promjene ekspresije gena koje također mogu utjecati na određene stanične procese, uključujući popravak oštećenja DNA [77, 85]. U skladu s ovom hipnozom, gubitak Msh2 i pogodak s jednim zračenjem kod miševa izazivaju izmjene H3K36me3 na izvorno označenim genima H3K4me3, koji su obogaćeni popravkom DNA, obradom RNA i biogenezom ribosoma [101]. U drugim tumorima još uvijek nema meta koje se mogu liječiti, poput DIPG -a koji nose mutaciju H3G34R/V i hondroblastoma s mutacijom H3K36M (slika 1). Budući da stanice s nedostatkom H3K36me3 imaju smanjene sposobnosti HR i MMR, ili možda NHEJ, bilo bi zanimljivo provjeriti hoće li blokiranje drugih puteva popravljanja DNA djelovati poput sintetičke smrtonosne interakcije za senzibiliziranje ovih stanica raka na agense koji oštećuju DNA. Drugi zasloni, poput velikih inhibitorskih ekrana i genetskih ekrana, mogu dovesti do daljnjeg razumijevanja načina na koji se te agresivne SETD2 mutirane stanice mogu ciljati.

Smanjenje H3K36me3 dovodi do tumorigeneze. Stanice s SETD2 mutacijom pokazuju smanjeni nedostatak H3K36me3 i DSR. Mutacija H3G34R/V i mutacija H3K36M mogu inhibirati enzimsku aktivnost SETD2 radi smanjenja H3K36me3 u stanicama


Gledaj video: From DNA to protein - 3D (Kolovoz 2022).