Informacija

Mogu li sušiti probavljeni uzorak proteina tijekom vikenda u vakuumskom koncentratoru?

Mogu li sušiti probavljeni uzorak proteina tijekom vikenda u vakuumskom koncentratoru?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Probavio sam s tripsinom ekstrakt proteina tkiva radi masene spektrometrije i zaboravio prenijeti uzorak iz SpeedVac -a u zamrzivač na -80 ° C. Kako sam to učinio u petak, uzorke mogu prenijeti tek u ponedjeljak. Hoće li to ublažiti moj uzorak i naknadnu identifikaciju proteina?


Ako se vaš uzorak osušio u speed-vac-u, to ne bi trebalo uzrokovati mnogo oštećenja uzorka. No, ako bi Speed ​​Vac prestao i ostalo je malo tekućine, tada bi inkubacija na sobnoj temperaturi dovela do hidrolize i razgradnje uzorka (također ovisi o pH, neutralno bi bilo sporije). Također biste imali modifikacije aminokiselinskih bočnih lanaca poput oksidacije i deamidacije


Metaproteomika tla - Usporedna ocjena protokola ekstrakcije proteina

Metaproteomika i njezine potencijalne primjene obećavaju proučavanje mikrobne aktivnosti u uzorcima okoliša i dublje razumijevanje mikrobnih interakcija. Međutim, zbog složenosti uzoraka tla, iscrpna ekstrakcija proteina veliki je izazov. Usporedili smo protokole ekstrakcije proteina iz tla u smislu njihove učinkovitosti ekstrakcije proteina za dva različita tipa tla. Primijenjena su četiri različita postupka ekstrakcije proteina na temelju (a) ekstrakcije SDS -a bez fenola, (b) NaOH i naknadne ekstrakcije fenola, (c) ekstrakcije SDS -fenola i (d) ekstrakcije SDS -fenola s prethodnim koracima ispiranja. Kako bi se procijenila prikladnost ovih metoda za funkcionalnu analizu metaprotema tla, primijenjene su na lončarsko tlo bogato organskim tvarima i šumsko tlo. Proteini su analizirani dvodimenzionalnom tekućinskom kromatografijom/tandem masenom spektrometrijom (2D-LC-MS/MS) i uspoređen je broj jedinstvenih spektra, kao i broj dodijeljenih proteina za svaki od odgovarajućih protokola. U oba tipa tla ekstrakcija SDS -fenolom (c) rezultirala je "visokim" brojem proteina. Štoviše, proveden je eksperiment povećanja vrijednosti kako bi se procijenio oporavak proteina. U tu je svrhu sterilizirano šumsko tlo dopunjeno proteinima iz čistih kultura Pectobacterium carotovorum i Aspergillus nidulans. Oporavak bjelančevina u eksperimentu s dodavanjem je bio gotovo 50%. Naše istraživanje pokazuje da je kritična ocjena protokola ekstrakcije ključna za kvalitetu metaproteomskih podataka, osobito u vrlo složenim uzorcima poput prirodnog tla.

Naglasci

► Usporedba oporabe proteina iz prirodnih uzoraka tla s različitim protokolima. ► Izravna ekstrakcija proteina iz tla tehnikama odvajanja bez gela (2D-LC-MS/MS). ► Za pojedinačne pristupe ekstrakcije promatrani su jedinstveni setovi proteina. ► Samo mala preklapanja jedinstvenih spektara između četiri različita protokola ekstrakcije.


Kliknite Kit za snimanje kemije

Opis:
Kit za snimanje kemije pruža sve potrebne reagense za kovalentno hvatanje specifičnih podklasa proteina reakcijom cikloadicije azid-alkina katalizirane Cu (I) (CuAAC). Proteini od interesa moraju biti metabolički, enzimski ili kemijski označeni azido ili alkinom. Nakon toga, smola koja sadrži kovalentno vezane proteine ​​može se isprati velikom strogošću, praktički eliminirajući sve nespecifično vezane proteine. Nakon probave proteazama, dobiva se vrlo čist bazen peptida koji je idealan za analizu temeljenu na masenoj spektroskopiji (npr. LC MS/MS).

  • 7 ml pufera za lizu
    - čuvati na 4 ° C
  • 4,8 g Uree
    - čuvati na sobnoj temperaturi
  • 1,5 ml Aditiva 1
    - čuvati na 4 ° C
  • 0,5 ml bakar (II) sulfata (100 mM)
    - čuvati na sobnoj temperaturi
  • 400 mg Aditiva 2
    - čuvati na sobnoj temperaturi
  • 200 ml pufera za ispiranje agaroze
    - čuvati na 4 ° C
  • 10 praznih centrifugiranih stupaca
    - čuvati na sobnoj temperaturi

Materijali su potrebni, ali nisu predviđeni za hvatanje proteina označenih azidom

  • 5-20 mg ekstrakta stanica ili tkiva označenih azido ili alkinom
  • Alkin ili azidna smola agarozne smole
  • Neoznačene stanice ili tkivo negativne kontrole
  • Rotator uzorka
  • Stolna centrifuga
  • Inhibitor proteaze
  • Epruvete za mikrocentrifugu od 2 ml
  • aqua bidest.
  • Sonda sonikator

Materijali su potrebni, ali nisu predviđeni za probavu na smoli s proteazom

  • DTT
  • Jodoacetamid
  • 8 M Urea, 100 mM Tris, pH 8
  • Acetonitril
  • Massin-spec razreda tripsina
  • 0,1 % TFA
  • C-18 patrone za desalinizaciju
  • Probavni pufer (100 mM Tris, 2 mM CaCl2, 10 % acetonitrila)
  • Toplinski blok
  • Vakuumski koncentrator


Priprema temeljnih otopina

Pufer za lizu (200 mM Tris, 4 % CHAPS, 1 M NaCl,
8M uree, pH 8,0)

  • Dodajte čvrstu ureu (4,8 g) u isporučeni pufer za lizu (7 ml).
  • Otopinu miješajte na rotatoru na sobnoj temperaturi dok se urea potpuno ne otopi (1-2 sata). Čuvajte na -4 ° C (do 1 tjedan) ili na -20 ° C 1 godinu kako biste izbjegli razgradnju uree.
  • Bilješka: 30 minuta prije početka protokola obogaćivanja, dodajte 20 i više koktela inhibitora proteaza (npr. Sigma 8340) po ml pufera za lizu (dovoljno za 50-200 milijuna stanica ili 5-20 mg ekstrakta tkiva).
  • Dodajte 2 ml vodenog bidesta. u Dodatak 2 i vrtložite dok se potpuno ne otopi.
  • Nakon uporabe, preostalu osnovnu otopinu čuvajte na -20 ° C do 1 godine.

Protokol za obogaćivanje proteina (po obogaćenju)

Korak 1: Priprema smole alkina ili azid-agaroze

  • Miješajte 50 % kašu od smole dok se smola potpuno ne suspendira.
  • Prije nego što se smola slegne, premjestite 200 & mul dobro promiješane smole s pipetom od 1 ml u čistu epruvetu od mikrožbuka od 2 ml.
  • Dodajte 1,3 ml vodenog bidesta. do smole.
  • Smolu se peletira centrifugiranjem 2 minute na 1000 x g.
  • Pažljivo odbacite supernatant ostavljajući približno 200 & mul taložene smole na dnu epruvete. Pazite da ne aspirirate taloženu smolu.

Korak 2: Priprema lizata

  • Dodajte 1 ml pufera za lizu uključujući inhibitor proteaze (vidi Pripremanje temeljnih otopina) u svaku stanicu ili tkivni ekstrakt koji sadrži azid ili alkin (5-20 mg proteina) u epruveti za mikrofugu od 2 ml.
  • Inkubirajte smjesu za lizu na ledu 5-10 min.
  • Dok ste na ledu, ultrazvučno izmiješajte smjesu pomoću sonične sonike, primjenom dva impulsa od 3 sekunde. Pazite da se uzorak ne pregrije.
  • Ponovite ultrazvučno snimanje na ledu sve dok lizat više ne bude viskozan (npr. Viskoznost vode).
  • Centrifugirajte lizat na 10.000 x g 5 minuta.
  • Vratite lizat na led sve dok ne izvedete reakciju klika.

3. korak: Priprema 2x otopine bakrenog katalizatora

  • Pripremite 1 ml 2x otopine bakrenog katalizatora po reakciji obogaćivanja kako slijedi:
    - 860 & mul Aqua bidest.
    - 100 & mul dodatak 1
    - 20 i mul otopina bakrenog (II) sulfata
    - 20 & mul dodatak 2
  • Voretex otopinu

Korak 4: Reakcija klikanja lizata/agaroze

  • Reakciju klika sastavite u epruvetu za mikrofugu od 2 ml na sljedeći način:
    - 200 i više oprane alkinske ili azidne agarozne smole (iz koraka 1)
    - 800 i više lizata stanica ili tkiva (iz koraka 2)
    - 1000 & mul 2x otopina bakrenog katalizatora (od koraka 3)
  • Rotirajte kraj-kraj na rotatoru uzorka 16-20 sati

5. korak: Redukcija i pojačavanje alkilacije proteina vezanih za smolu

  • Pufer za pranje Agarose zagrijte na sobnu temperaturu prije početka. Prije uporabe provjerite je li otopina homogena i bistra.
  • Agaroznu smolu centrifugirajte 1 minutu na 1000 x g. Pažljivo odbacite supernatant.
  • Dodajte 1,8 ml vodenog bidesta. u smolu, centrifugirati na 1000 x g i pažljivo odbaciti supernatant. Ovaj korak ispiranja vodom sprječava nakupljanje smole uzrokovano interakcijom zaostalog pufera za lizu s SDS -om u puferu za ispiranje od agaroze.
  • Smoli dodajte 1 ml pufera za ispiranje agaroze i 10 & mul 1 M DTT. Kratko vrtložite da biste resuspendirali smolu.
  • Zagrijte smolu na 70 ° C 15 min na toplinskom bloku, a zatim ohladite na sobnu temperaturu 15-30 min.
  • Smolu centrifugirajte 5 minuta na 1000 x g i pažljivo odbacite supernatant.
  • Pripremite 1 ml 40 mM otopine jodoacetamida po reakciji obogaćivanja otapanjem 7,4 mg jodoacetamida u 1 ml pufera za ispiranje agaroze.
  • Smoli dodamo 1 ml 40 mM otopine jodoacetamida, vrtložimo da smolu resuspendiramo i reakciju inkubiramo u mraku 30 minuta na sobnoj temperaturi.
  • Pufer za ispiranje agaroze koristi se za strogo uklanjanje nespecifično vezanih proteina. Ključno je ukloniti zaostali SDS iscrpnim ispiranjem s 8 M uree i 20 % acetonitrila prije analize spektrometrije mase.
  • Odvijte donji zatvarač stupa za centrifugiranje i skinite čep.
  • Za ponovnu suspenziju smole upotrijebite pipetu od 1 ml, a zatim je prenesite u kolonu za centrifugiranje.
  • Epruvetu sa smolom isperite s 0,5 ml H2O i također prenesite ovaj volumen u isti spin stupac.
  • Dodajte 2 ml pufera za ispiranje Agarose u kolonu za centrifugiranje i centrifugirajte na 1000 x g 1 minutu. Ponovite ovaj korak 5 puta.
  • Dodajte 2 ml 8 M Uree/100 mM Tris, pH 8 u centrifugalnu kolonu i centrifugirajte na 1000 x g tijekom 1 minute. Ponovite ovaj korak 5-10 puta.
  • Dodajte 2 ml 20 % acetonitrila u centrifugalnu kolonu i centrifugirajte na 1000 x g 1 minutu. Ponovite ovaj korak 5-10 puta.

Probava probave proteina vezanih za smolu

  • Zatvorite dno kolone za centrifugiranje i u smolu dodajte 500 & mul Digestion Buffer.
  • Pipetom od 1 ml resuspendirajte smolu u koloni za centrifugiranje i prenesite je u čistu epruvetu.
  • Isprati kolonu centrifugiranja s 0,5 ml dodatnog probavnog pufera i dodati ovo ispiranje već prenesenoj smoli.
  • Smolu se peletira centrifugiranjem 5 minuta na 1000 x g. Odbacite supernatant, ali ostavite približno 200 & mul probavnog pufera u epruveti iznad smole. Pazite da ne aspirirate smolu.
  • Dodajte 10 & mul 0,1 i šalice/& mul tripsina u kašu od smole i lagano promiješajte. Inkubirajte na 37 ° C 6 sati do noći.

Priprema sažetka za analizu spektrometrije mase

  • Smolu se granulira centrifugiranjem 5 minuta na 1000 x g i pažljivo prebaci digestirani supernatant u čistu epruvetu.
  • Dodajte 500 i više vodenih bidesta. do smole. Kratko vrtložite smolu i peletirajte je smolom centrifugiranjem 5 minuta na 1000 x g.
  • Prenesite supernatant u već preneseni supervatant sažetog.
  • Dodajte dodatni aqua bidest. do sažetka do konačnog volumena od 1 ml (Napomena: Time se koncentracija acetonitrila razrjeđuje na 2 %).
  • Zakiselite razrijeđeni sažetak dodavanjem 2 & mul TFA.
  • Desaltirajte sažetak na ulošku C-18 pomoću vakuuma ili gravitacijskog toka. Pustite da svaka otopina potpuno istekne kroz uložak prije dodavanja sljedeće otopine.
  • Dodajte 1 ml 50 % acetonitrila/0,1 % TFA u uložak i odbacite otpadnu vodu.
  • Dodajte 1 ml 0,1 % TFA u uložak i odbacite otpadnu vodu. Ponovite još jednom.
  • U uložak dodajte zakiseljenu, razrijeđenu probavu i odbacite otpadnu vodu.
  • Dodajte 1 ml 0,1 % TFA u uložak i odbacite otpadnu vodu. Ponovite još jednom.
  • Čistu epruvetu od 1,5 ml stavite ispod izlaza uloška C-18.
  • Eluirajte peptide u čistu epruvetu od 1,5 ml dodavanjem 700 & mul 50 % -tnog acetonitrila/0,1 % TFA u uložak C-18.
  • Osušite eluat koji sadrži digestiju razsoljenog peptida u vakuumskom koncentratoru. Čuvati na -20 ° C do MS analize.

Problem: Mali prinos obogaćenih proteina

  • Mogući razlog: Neučinkovito hvatanje proteina ili niska količina proteina označenih azido ili alkinom
    - Povećajte koncentraciju lizata (upotrijebite više stanica) ili unaprijed obogatite proteine ​​(npr. Topljivi lizat, membranski lizat, obogaćivanje lektinom itd.).
    - Potvrdite oporavak peptida mjerenjem A280 nakon probave
  • Mogući razlog: Neučinkovita probava proteina vezanih za smolu
    - Koristite tripsin visoke kvalitete

Problem: Visoka pozadina s neoznačenim kontrolnim ćelijama

  • Mogući razlog: Nedovoljno pranje smole
    - Povećajte ispiranje stupova
    - Koristite samo reagense visoke čistoće
    - Pripremite svježe filtrirane pufere
    - Osigurajte pravilnu pripremu otopine bakrenog katalizatora

Problem: Suzbijanje signala tijekom MS analize

  • Mogući razlog: kontaminacija SDS -om u sažetku
    - Nakon ispiranja pufera za ispiranje Agarose smolu temeljito operite drugim puferom, poput 8 M uree i 20 % acetonitrila, kako biste uklonili sve tragove SDS deterdženta (korak 6)

Citati proizvoda:
Pritisnite crnu strelicu s desne strane da biste proširili popis citata. Kliknite naslov publikacije za cijeli tekst.


Sažetak autora

Didermi tipično proizvode proteine ​​povezane s peptidoglikanom (PAPs) kako bi poboljšali strukturni integritet i kontinuitet unutar stanične ovojnice. Identificirali smo PAP u B. burgdorferi sa strukturom i homologijom sekvenci u blizini sveprisutnog bakterijskog proteina Dps (D NA vezni p rotein iz s tarviranih bakterija). The B. burgdorferi Dps paralog ne može vezati DNA. Umjesto toga, jača zaštitna svojstva sloja PG -a, dok igra važnu ulogu u imunološkoj modulaciji domaćina. Zajedno, naši nalazi ističu plastičnost bakterijskih proteina u tome što mogu promijeniti način na koji izvode zadatak unatoč zadržavanju iste osnovne biološke funkcije.

Citat: Davis MM, Brock AM, DeHart TG, Boribong BP, Lee K, McClune ME, et al. (2021) Protein NapA povezan s peptidoglikanom igra važnu ulogu u integritetu ovojnice i u patogenezi spirohete lajmske bolesti. PLoS Pathog 17 (5): e1009546. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009546

Urednik: D. Scott Samuels, Sveučilište u Montani, Sjedinjene Države

Primljeno: 3. veljače 2021 Prihvaćeno: 8. travnja 2021 Objavljeno: 13. svibnja 2021

Autorsko pravo: © 2021 Davis i sur. Ovo je članak s otvorenim pristupom distribuiran pod uvjetima Licence za dodjeljivanje autorskih prava Creative Commons, koji dopušta neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju na bilo kojem mediju, pod uvjetom da se navede izvorni autor i izvor.

Dostupnost podataka: Svi relevantni podaci nalaze se unutar rukopisa i popratnih informacija.

Financiranje: Sredstva su djelomično osigurala Zaklada Steven & amp. Alexandra Cohen, Nacionalni instituti za alergije i zarazne bolesti (R21AI159800-01), Virginia Tech, Institut za znanosti o životu Fralin i USDA (VA-160113), a svi su dodijeljeni BLJ-u. MMD i AB podržavaju George Washington Carver Fellowship. Donatori nisu imali nikakvu ulogu u izradi studije, prikupljanju i analizi podataka, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.

Konkurentni interesi: Svi autori izjavljuju da nema konkurentskih interesa.


3. Proteinske interakcije u kontekstu proteomskih promjena

Dinamička regulacija staničnog proteoma temelj je svih bioloških procesa, uključujući urođene imunološke odgovore. Promjene u količini proteina, podstaničnim lokalizacijama i posttranslacijskim modifikacijama (PTMs) potiču stvaranje ili poremećaj interakcija proteina i srž su imunoloških signalnih događaja. Stoga se studije interakcija proteina moraju istražiti i razumjeti u širem kontekstu promjena proteoma (slika 2). Na primjer, aktivacija DNA senzora domaćina za prepoznavanje virusne DNA i sposobnost virusa da inhibiraju ove imunološke mehanizme oslanjaju se na fino podešene promjene u proteomu tijekom napredovanja ciklusa replikacije virusa. Nekoliko je studija počelo graditi širi pogled na vremenske promjene proteoma tijekom progresije virusnih infekcija (Beys-da-Silva i sur., 2018. Drayman i sur., 2017. Forrest, Hislop, Rickinson, & Zuo, 2018. Kulej i dr. al., 2017. Weekes i sur., 2014.). Relevantne za imunološku signalizaciju, proteomske promjene također su istražene nakon infekcije sojevima HSV-1 koji imaju različite sposobnosti induciranja imunoloških odgovora, uključujući povišene citokine ili apoptozu (Lum i sur., 2018.).

Osim promjena u broju proteina, tijekom infekcije može se promijeniti i lokalizacija proteina. Na primjer, tijekom aktivne imunološke signalizacije, IRF3 se dimerizira nakon aktivacije fosforilacijom i translocira u jezgru, slično NF- κ B (Baldwin, 1996. Hiscott i sur., 1999.). Stoga se interakcije proteina mogu vremenski i prostorno regulirati. Kao što je gore naznačeno, PTM su također ključni za regulaciju funkcije proteina tijekom imunološke signalizacije. Na primjer, tijekom infekcije HSV-1, virusna tegument kinaza US3 hiperfosforilira IRF3 na atipičnom mjestu, čime se inhibira dimerizacija IRF3 i blokira njegova funkcija (Wang, Wang, Lin, & Zheng, 2013). Drugi primjer je acetilacija na NLS -u IFI16 acetiltransferazom p300, koja modulira lokalizaciju IFI16, a time i njegovu interakciju s virusnom DNA i drugim obrambenim proteinima (Li i sur., 2012.).

Ovdje, osim protokola za imunoafinitetno pročišćavanje proteinskih kompleksa, pružamo i protokol analize proteoma, čime se osigurava tijek rada za sustavno proučavanje proteinskih interakcija u kontekstu vremenskih izmjena proteoma. Protokoli su dati redoslijedom kojim bi ih korisnici izveli u laboratoriju, počevši od prekida stanica radi otapanja mamca, nakon čega slijedi upotreba dobivenog staničnog lizata za proteomske analize i IP-MS studije.


Metode

Vektori biljne ekspresije za konstitutivnu ekspresiju gena fluorescentnih proteina

DNA kodirajuće sekvence za 20 gena fluorescentnih proteina (FP) navedenih u tablici 1 mobilizirane su u Invitrogen pENTR/D-TOPO vektore za kloniranje (Invitrogen, Carlsbad, CA). Nakon PCR-a kolonije i validacije sekvenciranjem, kodirajuće sekvence FP-a su svaka rekombinirane u pMDC32-udvostručeni 35S ekspresijski vektor (Curtis i Grossniklaus, 2003.) putem LR klonazne reakcije (Invitrogen, Carlsbad, CA). FP-ovi su naknadno verificirani slijedom prije transformacije u Agrobacterium tumefaciens soj LBA4404.

Modularno kloniranje korišteno je za izgradnju biljnog binarnog vektora za mEmerald prekomjernu ekspresiju u krumpiru. Ekspresivna kaseta koja sadrži dvostruki CaMV 35S, mEmerald CDS cijele dužine, zajedno s terminatorom 35S sastavljena je modularnim kloniranjem i integrirana u odredišni vektor pAGM4723 koji sadrži kasetu s higromicinom za odabir (Engler et al., 2014. Occhialini et al., 2019 Weber et al., 2011 ).

Generiranje transgenih linija

Stabilno transformirani krumpir (Solanum tuberosum) linije koje su prekomjerno izrazile an mEmerald GFP gen pod kontrolom dvostrukog CaMV 35S promotora generiran je pomoću Agrobacterium-posredovana transformacija i regenerirana u selektivnim medijima kako je prethodno opisano (Chronis et al., 2014. Weigel i Glazebrook, 2006.). Eksplantati među čvorova (

1 cm duljine) uzeti su od jednomjesečnog djeteta in vitro-uzgojene biljke krumpira bile su meta transformacije. Putativne linije su procijenjene na prisutnost i ekspresiju transgena PCR-om u realnom vremenu i fluorografijom. Uzgojene su transgene linije in vitro u kutijama Magenta GA7 koje sadrže selektivne medije za razmnožavanje (4,33 g/L mješavina soli Murashige i Skoog 170 mg/L monobazični monohidrat natrijevog fosfata 100 mg/L inozitol 400 µg/L tiamin HCl 30 g/L saharoza 100 mg/L timntin 20 mg/ L higromicina i 3 g/L fitagela pH 5,6) kako je prethodno opisano (Chronis et al., 2014. Jung et al, 2005.). Biljke su se aklimatizirale, a zatim prenijele u posude. Transgeni i netransgenični krumpir uzgajan je u kontroliranom okolišu na temperaturi od 22-24 ° C i ciklusu svjetlo/mrak od 16 odnosno 8 sati.

Ekstrakcija ukupne RNA, sinteza cDNA i PCR u stvarnom vremenu

50 mg zdravog lisnog tkiva upotrijebljeno je za ekstrakciju ukupne RNA metodom Tri-Reagent (Molecular Research Center, Inc, Cincinnati, OH) prema protokolu proizvođača. Pripravci RNA su zatim podvrgnuti tretmanu DNazom i koraku čišćenja korištenjem RNA Clean & Concentrator Kit (Zymogen, Irvine, CA). Za svaki uzorak, 1 µg čiste ukupne RNA upotrijebljeno je za sintezu cDNA pomoću reverzne transkriptaze Super Script III (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) prema uputama proizvođača. Zatim je za mjerenje koncentracije cDNA upotrijebljen NanoDrop spektrofotometar (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

razrjeđenja cDNA (1: 3 v/v u H bez nukleaze2O) korišteni su u PCR-ovima u stvarnom vremenu. Reakcija je sastavljena u ukupnom volumenu od 15 µL u 1X PowerUp ™ SYBR ™ Green Master Mixu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), koristeći 1 µL razrijeđene cDNA i 0,5 µm svakog primera. Softverski primer Primer3 input v. 0.4.0 (Medicinski institut Howard Hughes i Nacionalni institut za zdravlje Untergasser et al., 2012.) korišteni su za projektiranje kompatibilnih parova temeljnih premaza s temperaturom žarenja od

57 ° C i može pojačati fragment

100 bp. Parovi primera 1Fw/1Rv korišteni su za pojačavanje mEmerald, dok je par početnih premaza 2Fw/2Rv i 3Fw/3Rv upotrijebljen za pojačavanje dviju unutarnjih kontrola ef1 (Solanum tuberosum faktor produljenja 1-alfa XM_006343390.2) i L8 (Solanum tuberosum 60S ribosomalni protein L8: XM_006362853.2). U tablici S2 prikazane su sekvence primera korištene za qRT-PCR.

QuantStudio ™ 6 Flex PCR sustav u stvarnom vremenu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) korišten je za izvođenje PCR-a u stvarnom vremenu pomoću ploča sa 96 jažica (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), dok su podaci o pojačanju prikupljeni pomoću QuantStudio ™ Real-Time PCR softver v1.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Metoda 2 ΔCT korištena je za predstavljanje podataka o ekspresiji gena u transgenim linijama zajedno s kontrolama divljeg tipa. L8 je korišten kao referentni gen za određivanje razina ekspresije obaju mEmerald i unutarnju kontrolu ef1 gen. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (sd) 3 biološke replikacije i 3 tehničke replike po biološkoj replici po svakoj transgenoj liniji i kontroli divljeg tipa. ANOVA post hoc Tukey statistička analiza (P & lt 0,05) izvedeno je pomoću IBM SPSS softvera za utvrđivanje statistički značajne razlike među srednjim vrijednostima.

Vakuumska agroinfiltracija N. benthamiana

Agrobacterium je infiltriran prema Rigoulotu et al. (2019) s izmjenom. Agrobacterium tumefaciens soj LBA4404 korišten je za infiltraciju svih fluorescentnih proteina i BiFC konstrukata. PCR kolonije je korišten za određivanje transformacije Agrobacterium. Agrobacterium zatim je uzgojen iz kolonija preko noći u 10 mL YEP mediju [10 g/L ekstrakta kvasca, 10 g/L bacto peptona, 5 g/L NaCl, ph 7,0] s rifampicinom (50 mg/L) i kanamicinom (50 mg/L) ) odabirom pri 28 ° C uz tresanje (225 o / min). Ta se kultura koristila kao kultura sjemena za kulturu od 125 ml koja se također uzgajala preko noći pod istim uvjetima. Agrobacterium Resuspendiran je u injekcijskom mediju (10 m m MES, 10 m m MgCl2 i 100 μm acetosiringona) do vrijednosti OD600 od 0,8, i to Agrobacterium otopina je inkubirana 3 sata na sobnoj temperaturi prije infiltracije. Četiri tjedna N. benthamiana biljke koje su uzgajane u danim uvjetima na 23 ° C korištene su za pokuse infiltracije. Vakuumska infiltracija N. benthamiana Biljke su izvedene korištenjem modificiranog vakuumskog eksikatora Nalgene (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL). Bočna ruka na podnožju blokirana je PTFE zatvaračem (isporučuje se uz kupnju) i učvršćena parafilmom. Zaporna slavina na poklopcu eksikatora je uklonjena, a PVC cijevi su naknadno opremljene vrhom pipete od 1-5 ml za povezivanje vakuumskog priključka na stolu s vakuumskim eksikatorom. N. benthamiana biljke su preokrenute i sva nadzemna tkiva uronjena su u kutije Magenta ™ GA-7 (Fisher Scientific, kataloški br. 50-255-176) ispunjene Agrobacterium suspenzija. Magenta kutija bila je smještena unutar potpornog prstena od stiropora izrezanog na veličinu velike staklene posude kako bi se spriječilo pomicanje posude tijekom nanošenja i otpuštanje vakuuma. S modificiranim vrhom pipete crijeva koji je sigurno umetnut u poklopac vakuumskog eksikatora, vakuum je primijenjen u intervalima od 1 minute. To se ponovilo 3 puta kako bi se postigla temeljita infiltracija lisnog tkiva naznačena vidljivom zasićenošću lista Agrobacterium riješenje. Vakuum koji osigurava priključak za stolni vakuum izmjeren je na -84 kpa ili -12 psi. Nakon infiltracije, biljke su isprane u posudi s deioniziranom vodom, a zatim ostavljene da se osuše na sobnoj temperaturi. Cijeli postupak vakuumske infiltracije prikazan je u filmu S1. Biljke su zatim vraćene u sobu za uzgoj dok se 72 sata nakon infiltracije ne odčitaju fluorološka očitanja, FILP i konfokalno snimanje.

Za koinfiltrirane biljke, Agrobacterium otopina je prilagođena za oba konstrukta FP gena na OD600 od 1.6, zatim su FP konstrukti pomiješani 1: 1 i provedena je vakuumska infiltracija kao što je prethodno opisano. Infiltracija štrcaljke N. benthamiana lišće provedeno je kako je opisano u Rigoulotu et al. (2019.) s Agrobacterium otopine pri OD600 od 0,8.

Fluorescentna spektroskopija lišća

Prije mjerenja FILP-om, spektralne karakteristike najmlađeg, potpuno proširenog lista svake biljke kvantificirane su pomoću skenirajuće fluorescentne spektroskopije (Fluorolog®-3, Jobin Yvon i Glen Spectra, Edison, NJ) pomoću spektralnog prikupljanja emisije pomoću softvera FluorEssence (HORIBA Znanstvena, verzija 3.8.0.60). Fluorescencija na listu mjerena je pomoću optičke sonde kako je prethodno opisano (Millwood et al, 2003.). Valne duljine uzbude podudaraju se s valnim duljinama Necsel laserske diode na 400 nm, 465 nm i 523 nm sa širinom proreza od 5 nm. Emisijske valne duljine skenirane su od 415–615 nm, 480–615 nm i 540–615 nm za odgovarajuće valne duljine pobude u koracima od 1 nm. Listovi iste razvojne dobi infiltrirani su puferom kao negativna kontrola i mjereni za pozadinsku fluorescenciju.

Podaci fluorescentne spektroskopije obrađeni su pomoću prilagođenog softvera: aplikacije Fluorologger Shiny, kodirane u R (Chang et al., 2019. R core tim, 2013.). Grafičko korisničko sučelje omogućuje vizualizaciju i normalizaciju fluoroloških podataka, a aplikacija je trenutno dostupna na githubu na github.com/jaredbrabazon/Fluorologger. Izlazne datoteke iz Fluorologa (.dat format) unesene su u aplikaciju, a korisničkim unosom podaci su normalizirani prema metodama opisanima u Millwoodu et al. (2003.). Detaljan korisnički vodič dostupan je na navedenoj poveznici.

Toplinska karta u tablici S1 nastala je snimanjem razlike u promjeni nabora između vršne emisije pojedinačnih fluorescentnih proteina kako je opisano na FPBase.org i pozadinske emisije u istoj točki koju je uzeo instrument Fluorolog (signal prema šumu).

Konfokalna mikroskopija

Isto tkivo lista analizirano fluorescentnom spektroskopijom (Fluorolog) snimljeno je pomoću konfokalnog mikroskopa Olympus FV1200 (Olympus, Center Valley, PA). Diodni laseri (405 nm, 440 nm, 473 nm, 559 nm i 635-nm) zajedno s konvencionalnim Argon i HeNe (R) laserima korišteni su za snimanje biljnih tkiva koja sintetiziraju fluorescentne proteine ​​s odgovarajućim spektrom pobude i emisije (Tablica 1). Proizvođački softver Olympus FV10-ASW Viewer Ver.4.2a (Olympus, Center Valley, PA) i ImageJ (Schneider et al., 2012.) za prikupljanje i obradu konfokalnih slika korišteni su softver za analizu (verzija 1.41o).

Sustav fenotipizacije laserskih projektora koji inducira fluorescenciju

Laserski projektor koji inducira fluorescenciju (FILP) prilagođen je instrument prvenstveno sastavljen od komponenti kupljenih od Necsel IP, Inc. (Milpitas, CA). Necsel komponente uključuju prilagođeni NovaLum modul s tri neovisno modulirane laserske diode koje emitiraju pri 400,3 nm, 464,9 nm i 523,5 nm, komplet za razvoj Thermal Platform Developer Kit, inteligentni komplet kontrolera i homogenizirano vlakno s četvrtastom jezgrom (400 µm, 0,22 NA) za izravnavanje Gaussove slike koju su laseri proizveli u prostorno jednolično ravno polje, iako s zaostalim pjegama iz laserske koherentnosti. Ova mrlja je smanjena propuštanjem vlakana kroz komercijalno dostupnu akvarijsku pumpu za vibriranje vlakana brže od vremena ekspozicije fotoaparata, čime se zaglađuje i uklanja pege dobivena slika. Pojedinačni filtri sa pojačanom spontanom emisijom (ASE) ručno su izrezani i montirani na svaku lasersku diodu kako bi se ograničila odašiljana valna duljina. Kao takav, filter od 405 ± 20 nm (ZET405/20X, Chroma Technology Corp., Bellow Falls, VT) montiran je na 400 nm diodu, a filter od 460 ± 36 nm (ET465/36 nm, Chroma Technology Corp.) bio je montiran na 465 nm diodu, a 524 ± 24 nm (FF01-524/24, IDEX Health & Science, LLC., Rochester, NY) montiran je na 523 nm diodu. Nakon montaže, maksimalna izlazna snaga kompletnog Necsel sustava bila je 1,14 W @ 400 nm, 1,36 W @ 465 nm i 1,45 W @ 523 nm. Nadalje, kontrola struje (iz inteligentnog regulatora) omogućila je linearnu kontrolu nad snagom lasera s vrijednostima R 2 & gt0,99. Kako bi se oblikovao snop za snimanje cijelih biljaka, leća projektora (63-714, Edmund Optics, Barrington, NJ) postavljena je 6 mm ispred homogenizirajućeg vlakna kako bi se formirao kvadrat za snimanje od 400 cm 2 na udaljenosti od 3 m.

Slike biljaka na ≥3 m postignute su pomoću Andor Zyla 5.5 sCMOS kamere opremljene objektivom žarišne duljine 50 mm (86-574, Edmund Optika). Kamera je montirana na istu ploču s laserskim sustavom, osiguravajući da su udaljenosti uzbude i emisije iste. Kontrola razlučivosti kamere, vremena ekspozicije i snimanja slike postignuta je pomoću besplatnog softvera otvorenog koda µManager. Između objektiva kamere i uzorka postavljen je motorni filtarski kotač s pet položaja s USB kontrolom (84-889, Edmund Optics) kako bi se omogućilo prikupljanje slika za određene valne duljine koje se odnose na ciljani fluorescentni protein koji sintetiziraju biljke. U trenutnoj verziji FILP -a, na emisioni kotač učitana su tri emisijska filtra od 50 mm: 460 ± 50 nm (ET460/50 nm), 525 ± 50 nm (ET525/50 nm) i 575 ± 40 nm (ET575/40 nm) ) (Chroma Technology Corp.).

Kako bi se osigurala sigurnost korisnika u sustavu i pružila potpuna tama za uzorkovanje, prilagođeni laserski raspon, 0,61 m × 0,91 m × 3,7 m, sastavljen je oko cijelog sustava pomoću 25 mm građevinskih tračnica i crne lesonita (XE25 & TB4, ThorLabs, Newton , NJ). Biljke su postavljene unutar kućišta kroz vrata izrađena na stražnjoj strani kućišta od istih materijala. Konačno, magnetska blokada korištena je kako bi se osiguralo da se laseri klase IV mogu koristiti kao sustav klase I gdje su se laseri odmah i automatski isključili ako se vrata otvore.

Pomoću 3D ispisa izrađen je prilagođeni stalak za biljke ("FILP -ov dvorac") za osiguravanje lončanica snimljenih u laserskom rasponu. Stalak naginje uzorke biljaka u saksijama za 75 stupnjeva prema naprijed kako bi se omogućila maksimalna folijarna izloženost tijekom korištenja laserskog sustava. U stalak se mogu smjestiti tri četvrtaste (7,6 cm) saksije koje se uzgajaju u stanu od 18 ćelija (59-3080, Griffin Greenhouse Supplies, Inc., Tewksbury, MA). Dizajni za 3D ispis dostupni su na zahtjev.

Obrada slike

Sastavljanje slika FILP -a i konfokalnog mikroskopa izvedeno je pomoću ImageJ (Schneider et al., 2012) softver za analizu (verzija 1.41o). Određivanje boje za svaki fluorescentni protein provedeno je pomoću Wolfram Demonstration Project (https://demonstrations.wolfram.com/), Colors of the Visible Spectrum dodatka. Koristeći opciju Adobe prostora boja, vršne emisione valne duljine emisije korištene su za traženje RGB vrijednosti. Ove vrijednosti, koje predstavljaju postotak, pomnožene su s najvećom vrijednošću za decimalni kod R, G ili B (255). Dobivene vrijednosti su zatim korištene za uspostavljanje tražilica (LUT) za softver ImageJ. Slike se neovisno unose u softver ImageJ. Prilagodbe svjetline i kontrasta primjenjivale su se jednoliko na slike ako je potrebno. Korištenjem slika za slaganje slika, preklapale su se slike FILP ili konfokalne fluorescentne slike i svjetla polja (BF). Nakon korištenja funkcije složene slike i odabira opcije boje alata za kanale, pseudo bojanje se primjenjuje na odabranu sliku. Unaprijed postavljene postavke uključuju sivu boju koja se može koristiti za sliku svijetlog polja, kao i plavu, zelenu, crvenu itd. Za specifičnije palete boja generiran je jedinstveni LUT. Prema zadanim postavkama, ImageJ primjenjuje različite boje na različite kanale (slike), a one su promijenjene pomoću opcije boje alata za kanale. Slike su izvezene kao.tiff datoteke za izradu figura. Donosimo primjer Wolframovog određivanja vrijednosti R, G, B, pretvaranje tih vrijednosti u generiranje pojedinačnih LUT -ova, tablicu RGB decimalnih vrijednosti za sve FP -ove i vizualni pregled pseudobojanja (slika S3).

Za eksperiment kontinuirane laserske ekspozicije vrhunskih FP infiltriranih biljaka s punom snagom lasera, 16-bitne crno-bijele laserske slike dobivene su svake minute za 60-minutnu vremensku seriju koristeći multidimenzionalnu akvizicijsku značajku µManagera. Ove su slike izrezane pomoću automatizirane radnje u programu Adobe Photoshop CC 2019 v.20.0.5 (Adobe Systems, Inc. San Jose, CA). Budući da prvih 30 minuta pokazuje da se biljke prilagođavaju orijentaciji sastojine i alternativnog svjetlosnog okruženja, mjerenja su poduzeta počevši od 30 -minutne vremenske točke (T0) i nastavljena do kraja sata (T30). Obrezane slike grupno su izmjerene u ImageJ -u kako bi se zabilježio srednji intenzitet piksela za istu biljku tijekom vremena. Srednji intenzitet piksela za svaku sliku ucrtan je u odnosu na vrijeme i prikazan na slici S1.

Suspenzija stanica krumpira koja se koristi za proizvodnju protoplasta

Priprema suspenzije stanica krumpira koja se koristi za probiranje protoplasta sintetičkim promotorom modificirana je prethodno opisanom metodom od strane Sajid i Aftab (2016). Solanum tuberosum cv. 'Desireé' je razmnožen nodalnim eksplantima u medij za razmnožavanje [4,33 g/L MS soli (Phytotech M524, PhytoTech Labs, Lenexa, KS), 25 g/L saharoze, 100 mg/L mio-inozitola, 0,17 g/L natrijevog fosfata monobazni, 0,44 g/L kalcijevog klorid dihidrata, 0,4 mg/L tiamin HCL, 5 ml/L 'potpune zalihe vitamina' (za 100 ml 40 mg glicina, 10 mg nikotinske kiseline, 10 mg piridoksin HCL, 10 mg tiamin HCL), 3 g/L phytagel, pH 5,8, 1 mL/L vitamini MS (Phytotech M557)) u posudama magenta GA7 pod 16-dnevnim, 8-satnim noćnim fluorescentnim svjetlosnim uvjetima na sobnoj temperaturi (23 ° C). Eksplantati sterilnih listova, izrezani na kvadrate 1-2 cm, uzeti su iz razmnožavanja i kalus je induciran na mediju za indukciju kalusa (CI) [4,33 g/L MS soli, 20 g/L saharoze, 2 g/L gelzan (čvrsti medij) , pH 5,8, 1 mL/L vitamini MS, 4 mg/L 2,4-D (2,4-diklorfenoksioctena kiselina)]. Žulj je prebačen na svježe CI ploče svaka 2-3 tjedna. Nakon 4–5 tjedana na CI podlozi, otprilike 2 g zelenog, trošnog kalusa upotrijebljeno je za inokulaciju 20 ml tekućeg CI medija i uzgojeno na tresilici za platformu pri 120–140 o / min tijekom 7 dana. Suspenzija je zatim filtrirana kroz sito od 425 µm i prenesena u novu tikvicu od 125 mL. Nakon što su se filtrirane stanice taložile, uklonjeno je 15 mL tekućeg CI medija, nadopunjeno svježim CI medijem, te je suspenzija ponovno uzgojena na tresilici za platformu pri 120-140 o / min. Nakon 7 dana, u tikvicu je dodano dodatnih 30 ml svježeg tekućeg CI medija i ostavljeno da raste još tjedan dana. Suspenzija stanica održavana je svakih 5-7 dana subkulturiranjem približno 15 ml filtrirane suspenzijske kulture u 30 ml svježeg medija. Stanice su povremeno filtrirane kroz sito od 425 µm radi održavanja konzistencije.

Transplakcija protoplasta

Protoplasti krumpira izolirani su iz kulture suspenzije stanica 3 dana nakon subkulture. Pet mililitara volumena zapakirane stanice probavljeno je otopinom enzima za probavu stanične stijenke [0,4 m manitola, 20 m m MES (pH 5,7), 20 m m KCl, 10 m m CaCl2, 1% goveđeg serumskog albumina (BSA), 5 mm β-merkaptoetanola, 4,4% (v/v) Rohament CL, 4% (v/v) Rohapect, 0,6% (v/v) Rohapect UF] u mraku na sobnoj temperaturi 2 sata uz lagano mućkanje (88 o / min). Nakon dva ispiranja puferom za ispiranje [0,45 m manitola, 10 m m CaCl2] protoplasti su filtrirani kroz cjediljku od najlon mreže od 40 µm (Fisher Scientific, Hampton, NH) i netaknute stanice su pročišćene na gradijentu od 23% saharoze. Protoplasti su zatim resuspendirani u otopini MMg [0,4 m manitola, 15 m m MgCl2, 4 m m MES] do koncentracije 2 × 105 protoplasta/mL.

Za test transplakcije protoplastom, prema Yoo-u je provedena PEG-posredovana transfekcija et al. (2007) s izmjenom. Deset mikrolitara plazmida (1 µg/µL) dodano je u 100 µL suspenzije protoplasta. Nakon dodavanja 110 µL 40% otopine PEG [40% (w/v) PEG-4000 (Sigma), 0,2 m manitola, 0,1 m CaCl2], smjesa je inkubirana 15 min na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 440 µL otopine W5 [2 m m MES, 154 m m NaCl, 125 m m CaCl 2, 5 m m KCl], a protoplasti su centrifugirani na 100 ° Cg 1 min, a zatim ponovno suspendira u 200 µL otopine WI [0,5 M manitola, 4 m m MES, 20 m m KCl] za inkubaciju u mraku 48 h. Zbog osmolalnosti otopina MMg (449 mOsm), W5 (695 mOsm) i WI (544 mOsm) korištenih u ovom radu, protoplasti su tijekom prijelaza između ovih otopina dobili osmotski stres.

Transformirani protoplasti promatrani su za ekspresiju GFP -a pomoću EVOS M7000 sustava za snimanje (Thermo Fisher Scientific) opremljenog GFP filterom (pobuda 470/22 nm, emisija 510/42 nm).

Sintetički promotor probira

Za identifikaciju kandidata za promotore biljaka induciranih osmotskim stresom, biblioteka sintetskih promotora,

2000 konstrukata (Stewart i sur., Neobjavljeni podaci), pregledano je ispitivanjem protoplasta krumpira. Transformirani protoplasti inkubirani u gore opisanim hipertoničnim uvjetima promatrani su za ekspresiju GFP -a nakon 48 sati korištenjem EVOS M7000 sustava za snimanje (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) opremljenog GFP filterom (pobuda: 470/22 nm, emisija: 510/42 nm ), a protoplasti su ocijenjeni kao pozitivni ili negativni za indukciju na temelju zelene fluorescencije. Promotori identificirani na ekranu protoplasta tada su okarakterizirani u lišću pomoću agroinfiltracijskih testova u N. benthamiana. Od 8 navodnih pogodaka, ovdje smo okarakterizirali jedan od obećavajućih: JL1 (slike S4 i S5).

Za N. benthamiana U eksperimentu s nadstrešnicom primijenjen je tretman osmotskog stresa zalijevanjem svakog lonca sa 100 ml otopine NaCl (250 m m) 48 sati nakon agroinfiltracije, nakon čega je voda zadržana 5 dana do faze djelomičnog uvenuća. Lažni tretman sastojao se od 100 ml vode iz slavine koja se nanosi svaka dva dana na svaku biljku. Korištene su tri biološke replike, a pokusi su ponovljeni tri puta. Mjerenja fluorescentne spektroskopije izvršena su neposredno prije tretmana NaCl, a zatim su se ponavljala svaki dan tijekom 5 dana. FILP slike snimljene su posljednjeg dana eksperimenta. Uklonjeno je lišće koje prethodno nije izmjereno fluorescentnim spektrometrom, uključujući staro lišće i novo lišće nastalo nakon agroinfiltracije. Biljke su snimljene pomoću laserske diode od 400 nm i promatrane pomoću filtra 525/50 nm. Laserska snaga iznosila je 0,8 W, a vrijeme ekspozicije 150 ms.

Kvasac dvo-hibridni

DNA kodirajuće sekvence za AtRAD51 (AT5G20850) i AtODB1 (AT1G71310) klonirane su iz cDNA lista Arabidopsis i uključene u vektore za kloniranje InVitrogen pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Nakon PCR kolonije i validacije sekvenciranjem, kodirajuće sekvence su svaka rekombinirane u Gateway-kompatibilne ekspresijske plazmide kvasca reakcijom LR klonaze ​​(Invitrogen, Carlsbad, CA). Ovi plazmidi, pGBKCg i pGADCg, sadrže c-terminalne fuzije za domenu koja veže GAL4 DNA i domenu aktivacije GAL4 (Stellberger et al., 2010 ).

I AtRAD51 i AtODB1 konstrukti, uključujući prazne vektorske negativne kontrole, transformirani su u kompatibilne za parenje S. cerevisiae sojevi AH109 i Y187. Pokusi transformacije kvasca i parenja provedeni su kako je prethodno opisano (Rigoulot et al., 2019.). Mediji s nedostatkom triptofana i leucina odabrani za kvasac koji sadrže konstrukte pGBKCg i pGADCg, dok su mediji s nedostatkom histidina i adenina odabrani za pozitivnu interakciju.

Konstrukcija vektora komplementacije bi-molekularne fluorescencije

Nakon pozitivnih rezultata Y2H za interakciju s AtRAD51, AtRAD51 je pripitomljen radi uklanjanja BsaI/BbsI mjesta i ponovno je kloniran u vektor akceptora 0 stupnja 0 bez zaustavljanja (pAGM1287) za upotrebu u strategijama kloniranja Golden Gate (Engler et al., 2014. Occhialini et al., 2019 Weber et al., 2011.). Slično, AtODB1 je kloniran kao CDS1 bez zaustavljanja razine 0 za upotrebu u negativnim kontrolama. C-terminalni BiFC fuzijski komadi dizajnirani su na temelju Gookin i Assmann (2014) konstrukta pDOE-01 CD3 1901 dostupnog iz spremišta Centra za biološke resurse Arabidopsis. Kao i kod proizvodnje CDS1 bez zaustavljanja lvl 0 komada, N-terminal (NVen210) i C-terminalni komadi (CVen210) su pripitomljeni i potom klonirani u vektor prihvata lvl 0 C-terminala (pAGM1301) za generiranje modula za koristiti s drugim komponentama kompatibilnim s Golden Gate -om. Preostali dijelovi dobiveni su iz Engler Golden Gate modularnog alata za kloniranje biljaka (Engler et al., 2014.). Svi konstrukti konačne ekspresije sastavljeni su u vektoru razine 2 pAGM4723. Fuzijske kazete CVen210 zauzimaju poziciju 1, NVen210 fuzijske kasete zauzimaju poziciju 2, a ako je prisutna, pomoćna kaseta P19 zauzima položaj 3. Sve kasete proizvedene su u obrnutoj orijentaciji. Fuzijske kazete AtRAD51 i AtODB1 eksprimirane su pomoću 2 × 35s_5U-TMV promotora (pICH51288) i uključivale su A. tumefaciens nos terminator (pICH41421). Pomoćni plazmidi za vektorske kasete +P19 emulirali su gore spomenuti vektor pDOE-01 (Gookin i Assmann, 2014.), koristeći A. tumefaciens mas promotor (pICH85281) i terminator (pICH77901) za reguliranje prigušivača Tomato Bushy Stunt Virus P19 (pICH44022). Vektori na stupnjevima 0, razina 1 i razina 2 potvrđeni su pomoću PCR -a kolonije, restrikcijskog sažetka i sekvenciranja prije provođenja daljnjih eksperimenata.


Vrednovanje proteinskih i#8211proteinskih interakcija pomoću tehnike varenja na membrani

Ovdje predstavljamo protokol za tehniku ​​digestije na membrani za pripremu uzoraka za masenu spektrometriju. Ova tehnika omogućuje prikladnu analizu interakcija proteina i proteina.

Sažetak

Brojni unutarstanični proteini fizički međusobno djeluju u skladu s njihovim unutarstaničnim i izvanstaničnim okolnostima. Doista, stanične funkcije uvelike ovise o međustaničnim interakcijama proteina i#8211proteina. Stoga su istraživanja u vezi s tim interakcijama neophodna za olakšavanje razumijevanja fizioloških procesa. Ko-taloženje pridruženih proteina, nakon čega slijedi analiza masene spektrometrije (MS), omogućuje identifikaciju novih interakcija proteina. U ovoj smo studiji dali detalje nove tehnike imunoprecipitacijske-tekućinske kromatografije (LC) -MS/MS analize u kombinaciji s digestijom na membrani za analizu interakcija proteina i#8211 proteina. Ova je tehnika prikladna za sirove imunoprecipitante i može poboljšati protok proteomskih analiza. Označeni rekombinantni proteini su zatim istaloženi korištenjem specifičnih antitijela, imunoprecipitanti koji su izbrisani na dijelove membrane polivinilden difluorida podvrgnuti su redukcijskom alkiliranju. Nakon tripsinizacije, digestirani proteinski ostaci analizirani su pomoću LC-MS/MS. Pomoću ove tehnike uspjeli smo identificirati nekoliko proteina povezanih s kandidatima. Stoga je ova metoda prikladna i korisna za karakterizaciju novih interakcija proteina i proteina.

Uvod

Iako proteini imaju konstitutivnu ulogu u živim organizmima, oni se kontinuirano sintetiziraju, obrađuju i razgrađuju u unutarstaničnom okruženju. Nadalje, unutarstanični proteini često fizički i biokemijski međusobno djeluju, što utječe na funkciju jednog ili oba 1, 2, 3. Na primjer, izravno vezanje homologa proteina povezanog s spliceosomom CWC22 s faktorom inicijacije eukariotske translacije 4A3 (eIF4A3) potrebno je za sastavljanje kompleksa egzonskog spoja 4. Sukladno ovome, eIF4A3 mutant koji nema afinitet za CWC22 ne uspijeva spojiti mRNA složenom spojkom egzonskog spoja 4. Stoga je proučavanje proteinskih interakcija ključno za precizno razumijevanje fiziološke regulacije, kao i staničnih funkcija.

Nedavni napredak u masenoj spektrometriji (MS) primijenjen je na opsežnu analizu interakcija protein-protein. Na primjer, istodobno taloženje endogenih proteina ili egzogeno uvedenih obilježenih proteina s njihovim povezanim proteinima, nakon čega slijedi MS analiza, omogućuje identifikaciju novih interakcija proteina 5. Međutim, jedno od najvećih uskih grla MS/MS analize je loš oporavak od probavnih probava uzoraka proteina. Za provođenje proteomskih analiza na staničnim lizatima, za pripremu uzoraka MS/MS općenito se koriste tehnike probave u gelu i na membrani. Prethodno smo usporedili postupak probave u gelu s tehnikom digestije na membrani 6 i pokazali da je potonji povezan s boljom pokrivenošću sekvenci. Membrana od poliviniliden difluorida (PVDF) može biti prikladna za tu svrhu jer je mehanički robusna i otporna na visoke koncentracije organskih otapala 7, 8, dopuštajući enzimsku probavu imobiliziranih proteina u prisutnosti 80% acetonitrila 9. Nadalje, imobilizacija na membrani može izazvati konformacijske promjene ciljnih proteina, što dovodi do poboljšanja učinkovitosti probavne probave 10. Sukladno tome, u ovom smo članku opisali uporabu imunoprecipitacijske-LC/MS/MS analize proteinskih interakcija primjenom tehnike digestije na membrani. Ova jednostavna metoda omogućuje prikladnu analizu interakcija protein-protein čak i u nespecijaliziranim laboratorijima.

Potrebna je pretplata. Preporučite JoVE svom knjižničaru.

Protokol

NAPOMENA: Koristili smo pufer za lizu bez natrijevog dodecil sulfata (SDS) i eluciju citrata, kako je opisano u sljedećim odjeljcima. Međutim, upotreba alternativne interne tehnike imunoprecipitacije također može biti primjenjiva za pripremu LC-MS/MS uzoraka.

  1. Transfektirajte uzgojene stanice s vektorima koji kodiraju epitopsku oznaku ili fuzijski protein. Za dobivanje reprezentativnih podataka, prenesite stanice J774 (1 x 106) s vektorima koji kodiraju sam zeleni fluorescentni protein (GFP) ili GFP-stopljeni Capn6 (gen kalpain-6) pomoću kationskih liposoma.
  2. Konjugirajte antitijela na magnetske kuglice.
    1. U tu svrhu pomiješajte protutijelo protiv GFP-a (2 μL/reakcija) s magnetskim zrncima (25 μL/reakcija) u 500 µL citrat-fosfatnog pufera (24,5 mM limunske kiseline, 51,7 mM dvobaznog natrijevog fosfata pH 5,0 ) u epruveti od 1,5 ml.
    2. Rotirajte smjesu pri 50 o / min 1 h na sobnoj temperaturi. Zatim isperite zrnca konjugirana s IgG tri puta s citrat fosfatnim puferom koji sadrži 0,1% polioksietilen (20) sorbitan monolaurata.

    2. Digestija proteina na membrani

    NAPOMENA: Korištenje materijala i opreme bez proteina potrebno je kako bi se izbjegla kontaminacija egzogenim proteinima. Osim toga, preporučuje se da operater nosi kiruršku masku i rukavice kako bi izbjegao kontaminaciju ljudskim proteinima.

    1. Izrežite PVDF membrane na komade 3 mm x 3 mm pomoću kirurških škara koji su obrisani metanolom i osušeni neposredno prije uporabe.
    2. Dodajte 2 𔃃 µL etanola na komade PVDF membrane na čistu aluminijsku foliju.
    3. Prije nego što se potpuno osuše, dodajte eluant (2 𔃃 µL svaki, 4 𔃄 komada po uzorku) na hidrofilne PVDF membrane, a zatim membrane osušite na zraku dok površina membrane ne postane mat. Osušene membrane mogu se čuvati na 4 °C.
    4. Prenesite sve membrane u plastične epruvete od 1,5 ml, dodajte 20 󈞊 µL etanola kako bi membrane postale hidrofilne, a zatim uklonite etanol pomoću pipete.
    5. Prije nego se membrana potpuno osuši, dodajte 200 µL reakcijske otopine na bazi ditiotreitola (DTT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT i 20% acetonitrila) i inkubirati 1 sat pri 56 ° C i 176 ° C.
    6. Zamijenite reakcijsku otopinu s 300 µL otopine jodoacetamida (80 mM NH4HCO3, 55 mM jodoacetamida i 20% acetonitrila), te inkubirati 45 minuta na sobnoj temperaturi u mraku.
    7. Membrane se ispiru dva puta s 1 ml destilirane vode i jednom s 1 ml 2% acetonitrila miješanjem u vrtlogu tijekom ᡂ s.
    8. Otopiti liofilizirani tripsin razreda MS (Tablica materijala) izravno u reakcijskoj otopini (30 mM NH4HCO3 koji sadrži 70% acetonitrila). Dodajte 100 µL reakcijske otopine koja sadrži 1 μg tripsina (Tablica materijala) (30 mM NH4HCO3 koji sadrži 70% acetonitrila) i inkubirati preko noći pri 37 ° ° C.
    9. Reakcijsku otopinu koja sadrži probavne probave prenesite u čistu epruvetu od 1,5 ml pomoću pipete.
    10. Dodajte 100 µL otopine za ispiranje (70% acetonitrila/1% trifluorooctene kiseline) u membranu i inkubirajte je na 60 ° ° C 2 sata. Prikupiti otopinu za ispiranje i pomiješati je s reakcijskom otopinom. Dodajte još 100 μL otopine za ispiranje u membranu i ultrazvučno djelujte 10 minuta. Zatim sakupite otopinu za ispiranje i pomiješajte s reakcijskom otopinom.
    11. Pokrijte epruvetu komadom laboratorijskog filma i iglom napravite nekoliko malih rupica. Osušite otopinu vakuumskim koncentratorom.
    12. Ostatak se otopi u 10 µL 0,2% mravlje kiseline. Nakon centrifugiranja (12.000 × g, 3 min na sobnoj temperaturi), prenijeti supernatant u epruvetu za uzorak.
      NAPOMENA: Pranje su kritični koraci ovog odjeljka. Tijekom probave proteina na membrani, pranje membrana koje sadrže imobilizirane proteine ​​nakon redukcije i alkiliranja destiliranom vodom, nakon čega slijedi 2% acetonitrila, svaka dulje od 10 sekundi, kritično je za uklanjanje reagensa.

    3. LC –elektronizijska raspršivačka ionizacija (ESI) -MS/MS analiza

    1. Aktivirajte instrument ESI-MS/MS (Tablica materijala) zajedno s nano-LC HPLC sustavom (Tablica materijala). Povežite prethodni stupac (Tablica materijala) i analitički stupac (Tablica materijala).
    2. Prije analize, kalibrirajte maseni spektrometar koristeći triptološke digestije goveđeg serumskog albumina otopljenog u 0,2% mravlje kiseline, što daje standardne peptide.
    3. Analizirajte uzorke koristeći mod pozitivnih iona i raspon masa od 400 𔂿,250 m/z, a zatim prikupite do 10 MS/MS spektra (po 100 ms svaki) s rasponom masa od 100 𔂿,600 m/z i linearnom gradijent od 2% 󈞼% acetonitrila i 0,2% mravlje kiseline 80 minuta pri protoku od 300 nL/min.
    4. Analizirajte izlazne podatke pomoću softvera za identifikaciju proteina (Tablica materijala) za identifikaciju proteina povezanih s kandidatom. Za pozitivnu identifikaciju proteina kandidata potrebna je detekcija barem jednog fragmenta peptida visoke vjernosti (> 95% vjernosti).
    5. Izostavite proteine ​​koji se na sličan način talože u lizatima koji eksprimiraju GFP (transfekcija vektora koji eksprimira samo oznaku GFP) sa popisa proteina kandidata.
      NAPOMENA: Ako je u analizi baze podataka identificirano nekoliko proteina, izmjena uvjeta akvizicije MS/MS (npr. Promjena vremena sa 100 ms svaki na 50 ms svaki) može povećati broj identificiranih proteina.

    Potrebna je pretplata. Preporučite JoVE svom knjižničaru.

    Reprezentativni rezultati

    Pomoću gore opisanog postupka, imunoprecipitanti su analizirani pomoću LC-MS/MS (Slika 1). Nakon isključivanja egzogeno izvedenih proteina (proteini drugih vrsta i IgG), 17 proteina je identificirano u imunoprecipitantima povezanim s kalpainom-6 (stol 1) i 15 proteina identificirano je u imunoprecipitantima povezanim s GFP-om (Tablica 2). Od proteina povezanih s kalpainom-6 i GFP-om, 11 je identificirano u oba imunoprecipitanata (Slika 2). Nakon što su ti i sam kalpain-6 isključeni, preostalo je pet proteina povezanih s kalpainom-6: komplement C1q podkomponentna podjedinica C, keratin tip II citoskelet 8, protein koji veže IgE, ADP/ATP translokada 1 i ubikvitin.


    Slika 1. Shema tehnike varenja na membrani
    Stanični lizati su taloženi pomoću magnetskih zrnaca konjugiranih sa specifičnim antitijelima. Eluant iz imunoprecipitacije je upijan na komade PVDF membrane. Nakon toga su membrane obrađene reagensima za redukcijsku alkilaciju, a zatim inkubirane sa tripsinom. Reakcijska otopina je zatim analizirana pomoću LC-MS/MS. Molimo kliknite ovdje za prikaz veće verzije ove slike.


    Slika 2. Pregled reprezentativnih podataka
    U imunoprecipitantu povezanom s kalpainom-6 identificirano je sedamnaest proteina, a u imunoprecipitantu povezanom s GFP-om otkriveno je 15 proteina. Od toga je 11 proteina identificirano u oba imunoprecipitanta. Molimo kliknite ovdje za prikaz veće verzije ove brojke.

    Ime Pristupanje Peptidi (95%) %Cov
    Aktin, citoplazmatski 2 sp | P63260 | ACTG 5 18.4
    Aktin, glatki mišić aorte sp | P62737 | ACTA 5 18.57
    Actin, citoplazmatski 1 sp | P60710 | ACTB 5 18.41
    Aktin, alfa skeletni mišić sp | P68134 | DJELA 5 13.53
    Aktin, alfa srčani mišić 1 sp | P68033 | ACTC 5 13.53
    Aktin, gama-enterički glatki mišić sp | P63268 | ACTH 5 13.56
    Faktor produljenja 1-alfa 1 sp | P10126 | EF1A1 3 33.33
    Faktor produljenja 1-alfa 2 sp | P62631 | EF1A2 3 16.2
    Keratin, citoskeletni tip II 8 sp | P11679 | K2C8 3 22.65
    Dopuni podkomponentu C1q podjedinicu C sp | Q02105 | C1QC 2 8.94
    Protein koji veže IgE sp | P03975 | IGEB 2 21.72
    Kalpain-6 sp | O35646 | CAN6 1 15.91
    ADP/ATP translokaza 2 sp | P51881 | ADT2 1 27.52
    ADP/ATP translokaza 1 sp | P48962 | ADT1 1 19.13
    Ubiquitin sp | P62991 | UBIQ 1 40.79
    Transkripcijski faktor povezan s runtom 3 sp | Q64131 | RUNX3 1 15.89
    Izoform 2 transkripcijskog faktora 3 povezanog s Runtom sp | Q64131-2 | RUNX3 1 13
    “Peptidi (95%) ” označava broj peptida identificiranih s ocjenom vjernosti > 95% u MS/MS podacima. “% Cov ” odnosi se na postotak aminokiselinskih ostataka identificiranih u svim peptidima (s > 95% vjernosti) u odnosu na ukupan broj aminokiselinskih ostataka koji čine odgovarajući protein. Radi bolje jasnoće nisu prikazani egzogeni proteini (proteini drugih vrsta i IgG), ribosomski proteini i histoni.

    Tablica 1. Proteini povezani s kalpainom-6

    Ime Pristupanje Peptidi (95%) %Cov
    Faktor produljenja 1-alfa 1 sp | P10126 | EF1A1 3 24.24
    Faktor produljenja 1-alfa 2 sp | P62631 | EF1A2 3 24.41
    Aktin, alfa skeletni mišić sp | P68134 | DJELA 3 13.53
    Aktin, alfa srčani mišić 1 sp | P68033 | ACTC 3 13.53
    Aktin, gama-enterički glatki mišić sp | P63268 | ACTH 3 13.56
    Aktin, citoplazmatski 2 sp | P63260 | ACTG 3 13.6
    Aktin, glatki mišić aorte sp | P62737 | ACTA 3 13.53
    Actin, citoplazmatski 1 sp | P60710 | ACTB 3 13.6
    ADP/ATP translokaza 2 sp | P51881 | ADT2 2 25.5
    rRNA 2 '-O-metiltransferaza fibrilarin sp | P35550 | FBRL 2 14.37
    Prohibitin sp | P67778 | PHB 1 9.19
    Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein U sp | Q8VEK3 | HNRPU 1 10.63
    Transkripcijski faktor povezan s runtom 3 sp | Q64131 | RUNX3 1 39.12
    Izoform 2 transkripcijskog faktora 3 povezanog s Runtom sp | Q64131-2 | RUNX3 1 26
    Faktor produljenja 1-gama sp | Q9D8N0 | EF1G 1 12.36
    “Peptidi (95%) ” označava broj peptida identificiranih s ocjenom vjernosti > 95% u MS/MS podacima. “% Cov ” odnosi se na postotak aminokiselinskih ostataka identificiranih u svim peptidima (s > 95% vjernosti) u odnosu na ukupan broj aminokiselinskih ostataka koji čine odgovarajući protein. Radi bolje jasnoće nisu prikazani egzogeni proteini (proteini drugih vrsta i IgG), ribosomski proteini i histoni.

    Tablica 2. Proteini povezani s GFP-om

    Potrebna je pretplata. Preporučite JoVE svom knjižničaru.

    Rasprava

    Prethodno smo opisali analizu oksidativnih modifikacija apolipoproteina B-100 u oksidiranom lipoproteinu niske gustoće pomoću LC-MS/MS kojoj je prethodila tehnika digestije na membrani 6. U ovom smo istraživanju kombinirali ovu tehniku ​​s imunoprecipitacijom i identificirali nekoliko proteina povezanih s kalpainom-6. Ova nova tehnika predstavlja prikladnu metodu provjere proteina povezanih s kandidatima.Kalpain-6 je ne-proteolitički član proteolitičke obitelji kalpaina 11 koji je navodno izmijenio stanične funkcije svojim interakcijama protein-protein 12, 13. Koristeći metodu probave na membrani, prethodno smo identificirali druge proteine ​​povezane s kalpainom-6 koji koriste drugačiji MS-postav 12. Stoga preporučujemo testiranje nekoliko uvjeta MS -a za povećanje broja identificiranih kandidata. Iz istog razloga, procjena uvjeta imunoprecipitacije, kao što su vrste oznaka epitopa, deterdženta i otopine za eluciju, važna je za dobivanje optimalnih rezultata.

    U ovom istraživanju identificirali smo 11 proteina u imunoprecipitantima povezanim s kalpain-6- i GFP-om. Većina proteina koji se preklapaju bili su izotipi aktina, a kontaminacija citoskeletnim proteinima aktinom uobičajena je u analizama stanične interakcije proteina i proteina jer su razine ekspresije ovih proteina vrlo visoke. Stoga bi te kandidate trebalo izostaviti iz daljnje analize. Osim toga, u oba imunoprecipitanta otkriveni su čimbenici produljenja. Oni reguliraju brzinu i vjernost sinteze proteina i utječu na savijanje proteina 14, pa stoga ne čudi suimunoprecipitacija faktora produljenja. Ove proteine ​​također treba izostaviti iz daljnje procjene.

    Imunoprecipitanti se mogu podvrgnuti reduktivnoj alkilaciji i enzimskoj digestiji izravno u otopini za eluciju 15, a ova metoda digestije u otopini može se primijeniti i za pripremu uzoraka za MS/MS. Međutim, smatramo da upotreba varenja na membrani ima značajne prednosti u odnosu na probavu u otopini. PVDF membrana služi kao skela za naknadnu redukcijsku alkilaciju i enzimsku probavu, što znači da se otapala potrebna za ove procese mogu lako zamijeniti. Slijedom toga, moguće je koristiti različite elucijske otopine za imunoprecipitaciju. Obrnuto, za probavu u otopini, može biti izazov koristiti otopine za eluciju na bazi SDS-a ili niske pH vrijednosti jer se aktivnost proteaze može ograničiti u takvim uvjetima. Nadalje, imobilizacija ciljnih proteina može olakšati naknadni postupak ispiranja. Stoga je probava na membrani vrlo prikladna za pripremu imunoprecipitanata za MS/MS analizu. Ograničeni broj proteaza može biti prikladan za ovaj protokol. Zasad je navodno aktivan samo lizil-C, osim tripsina, u prisutnosti do 80% acetonitrila 6, 9, 10, 15.

    Naša tehnika varenja na membrani prikladna je za identifikaciju proteina u maloj količini imunoprecipitanata s visoko osjetljivom granicom detekcije. Međutim, treba imati na umu da učinkovitost detekcije ciljnog proteina ovisi o prisutnoj količini. Proteini koji su prisutni u većim količinama preferirano se detektiraju i mogu spriječiti MS da otkrije druge proteine ​​prisutne u manjim količinama. Ipak, u normalnim okolnostima, brojni proteini se otkrivaju pomoću LC-MS/MS analize, a moraju se koristiti i druga ispitivanja kako bi se razjasnilo koji od proteina kandidata imaju odgovarajuću biološku važnost.

    U ovom smo istraživanju ocijenili tehniku ​​digestije na membrani za analizu imunoprecipitanata. Takva prikladna i sveobuhvatna metoda za analizu interakcija protein-protein trebala bi biti široko primjenjiva za poboljšanje protoka budućih proteomskih analiza.

    Potrebna je pretplata. Preporučite JoVE svom knjižničaru.

    Otkrivanja

    Autori nemaju što otkriti.

    Zahvalnice

    Ovo istraživanje djelomično je podržalo Japansko društvo za promicanje znanosti KAKENHI Grant broj 17K09869 (do AM), Japansko društvo za promicanje znanosti KAKENHI Grant broj 15K09418 (za TM), potpora za istraživanje od Zaklade za medicinsku znanost Kanehara Ichiro stipendija za istraživanje od Suzuken Memorial Foundation (sve za TM).


    ZAHVALNOST

    Zahvalni smo laboratorijskom osoblju u Ključnom laboratoriju za biološko ponašanje tumora u provinciji Hubei i Prvoj bolnici Sveučilišta Lanzhou na pomoći. Zahvaljujemo Shanghai Cutseq Bio-medical Technology Co. Ltd. na smjernicama DIA-MS. Ovaj projekt djelomično je podržan bespovratnim sredstvima Nacionalne zaklade za prirodne znanosti Kine (br. 81072152 i br. 81770283), Zaklade za prirodne znanosti provincije Hubei (br. 2015CFA027), Istraživačke zaklade Komisije za zdravlje i planiranje obitelji provincije Hubei (N0 WJ2015MA010 i br. WJ2017M249), Centar za kliničko medicinsko istraživanje peritonealnog karcinoma u Wuhanu (br. 2015060911020462), Projekt Fonda za inovacije u sveučilištima Gansu (2019B-009 i 2020B-009), Projekt subvencioniranja Prve bolnice Sveučilišta Lanzhou (ldyyyn2018-13, ldyyyn2018-43, ldyyyn2018-66) i bespovratna sredstva iz Projekta upravljanja planom zdravstvenih istraživanja u provinciji Gansu (BR. GWGL2010-20). Donatori nisu imali nikakvu ulogu u izradi studije, prikupljanju i analizi podataka, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.


    Rezultati i rasprava

    Pet otopina konzervansa primijenjeno je za skladištenje ponovljenih filtera za more Synechococcus soj WH8102 kako je opisano u tablici ​ tablici1. 1. Opstanak proteina nakon 1  mjeseca na sobnoj temperaturi u mraku uvelike je ovisio o vrsti konzervansa koji se koristi. Četiri tehnike korištene su za ispitivanje oporavka proteina nakon ekstrakcije: ukupna koncentracija proteina, kvalitativno ispitivanje integriteta trake na 1-D-SDS-PAGE gelu, ukupan broj proteina identificiranih pomoću LC –MS, te omjeri relativne količine svakog pojedinog proteina između svakog konzervansa i kontrole kako je određeno spektralnim brojenjem.

    Ukupni oporavak proteina

    Ukupni oporavak proteina bio je prilično varijabilan među pristupima očuvanja (slika ​ (slika 1), 1), pri čemu je najveći oporavak primijećen u odmah zamrznutoj kontroli, nakon čega slijedi uzorak ekstrakcije SDS-om, etanol, RNAkasnije, TCA, B-PER. Međutim, ukupni oporavak proteina vjerojatno nije najkorisniji pokazatelj očuvanja proteina jer su gubici vjerojatno posljedica oporavka obrade uzorka, a ne stvarne razgradnje tijekom skladištenja. Konkretno, svaki konzervans imao je različitu kompatibilnost s protokolima ekstrakcije nizvodno, a dodatni koraci rukovanja mogli bi rezultirati dodatnim gubicima ukupnog proteina. Iako bi ti gubici u obradi bili važni pri pokušaju mjerenja apsolutne količine proteina, vjerojatno se lako mogu objasniti dodavanjem internih standarda, kao što su izotopski obilježeni ili egzogeni proteini. U budućnosti bi se protokoli ekstrakcije također mogli optimizirati kako bi se smanjili gubici i povećala propusnost.

    Ukupni oporavak proteina izmjeren DC-testom na ekstrahiranim filterima. Kontrola se odnosi na odmah zamrznutu kontrolu, a detalji o konzervansu navedeni su u tablici ​ tablici1. 1. Trake pogrešaka odgovaraju četverostrukim tehničkim replikama.

    Integritet proteina pomoću SDS-PAGE

    1-D-SDS-PAGE gel pružio je kvalitativne podatke o integritetu uzorka (slika ​ (slika2). 2). Unatoč opterećenju ekvivalentnim ukupnim proteinima u svakoj gel traci, postojala je varijabilnost u intenzitetu proteinskih traka po trakama. Na kvalitativnoj razini, svi uzorci, osim uzorka TCA, imali su različite proteinske trake koje sugeriraju dobar ukupni integritet proteina ovim testom. Uzorak TCA pokazao je širok razmaz po cijeloj traci, što ukazuje na značajnu hidrolizu i razgradnju proteina. S obzirom da je mjerenje ukupne koncentracije proteina relativno precizno (vidi trake pogrešaka na slici ​, slika 1), 1), vjerojatno objašnjenje razlike u intenzitetu trake između traka je razgradnja proteina. To je očito u traci B-PER, gdje je uočeno da ovaj konzervans ima najmanji broj identifikacija proteina (slika ​ (slika3, 3, vidi Identifikacije proteina prema LC –MS), a ovaj konzervans je također pokazao veliko obogaćivanje u nekim od najobilnijih bjelančevina (fikoeritrin, swmA i porin vidi tablicu ​ tablicu2 2 i vidi Relativno obilje proteina prema LC –MS), oba su u skladu s gubitkom manjih proteina u odnosu na glavni protein trake na gel slici.

    Tablica 2

    Promjene u relativnom obilju 50 najzastupljenijih proteina tijekom konzerviranja (linearna skala).

    Pristupni brojOznaka proteinaOmjer u odnosu na kontrolu (SpC: SpC)
    RNAlaterEtanolB-PERSDS -a
    NP_89S099C-fikoeritrin klase II beta lanac0.970.911.451.06
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898100", "term_id": "33866541", "term_text": "NP_898100" >> NP_898100C-fikoeritrin alfa lanac klase II1.190.721.780.75
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898315", "term_id": "33866756", "term_text": "NP_898315" >> NP_898315Mogući porin1.261.762.251.46
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898316", "term_id": "33866757", "term_text": "NP_898316" >> NP_898316Mogući porin1.041.381.630.56
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_897111", "term_id": "33865552", "term_text": "NP_897111" >> NP_897111ABC transporter, protein koji veže supstrat, fosfat1.241211.741.59
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896180", "term_id": "33864621", "term_text": "NP_896180" >> NP_896180Površinski protein SwmA-stanica potreban za plivačku pokretljivost0.533.182.862.45
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898113", "term_id": "33866554", "term_text": "NP_898113" >> NP_898113R-fikocijanin II beta lanac1.231180.881.07
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896609", "term_id": "33865050", "term_text": "NP_896609" >> NP_896609Chaperonin GroEL1.230.880.051.67
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898480", "term_id": "33866921", "term_text": "NP_898480" >> NP_898480Putativna alkalna fosfataza0.371.390.391.41
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898219", "term_id": "33866660", "term_text": "NP_898219" >> NP_898219Mogući porin1.101.241.660.18
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896579", "term_id": "33865020", "term_text": "NP_896579" >> NP_896579Alofikocijanin beta lanac1.030.850.270.87
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898108", "term_id": "33866549", "term_text": "NP_898108" >> NP_898108C-fikoeritrin klase 1 beta lanac0.920.830.823.06
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898107", "term_id": "33866548", "term_text": "NP_898107" >> NP_898107C-fikoeritrin alfa lanac klase 11.290.671.262.26
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898531", "term_id": "33866972", "term_text": "NP_898531" >> NP_898531Putativni transporter uree1.242.161.440.92
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898229", "term_id": "33866670", "term_text": "NP_898229" >> NP_898229Faktor produljenja Tu0.860.570.051.24
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898091", "term_id": "33866532", "term_text": "NP_898091" >> NP_898091Vezni polipeptid fikobilisoma0.890.550.211.84
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898114", "term_id": "33866555", "term_text": "NP_898114" >> NP_898114R-fikocijanin II alfa lanac1.151.210.673.52
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896501", "term_id": "33864942", "term_text": "NP_896501" >> NP_896501Hipotetički protein SYNW04060.371.943.242.91
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898228", "term_id": "33866669", "term_text": "NP_898228" >> NP_898228Faktor produljenja EF-20.910.400.010.50
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_897166", "term_id": "33865607", "term_text": "NP_897166" >> NP_897166Glutamin sintetaza, glutamat – amonijačna ligaza1.031522.081.43
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896607", "term_id": "33865048", "term_text": "NP_896607" >> NP_896607Podjedinica ATP sintaze B1.000.800.390.55
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_897888", "term_id": "33866329", "term_text": "NP_897888" >> NP_897888Puctivni željezni ABC transporter, vezivanje podloge1.261540.581.07
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896581", "term_id": "33865022", "term_text": "NP_896581" >> NP_896581Sidreni polipeptid LCM0.930.290.010.56
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_897988", "term_id": "33866429", "term_text": "NP_897988" >> NP_897988Poliribonukleotid nukleotidiltransferaza0.930.360.030.64
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_897945", "term_id": "33866386", "term_text": "NP_897945" >> NP_89794560  kDa chaperonin 2, GroEL homolog 21.070.810.020.88
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896589", "term_id": "33865030", "term_text": "NP_896589" >> NP_896589Podjedinica ATP sintaze A1.000.710.150.97
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_897809", "term_id": "33866250", "term_text": "NP_897809" >> NP_897809Metionin sulfoksid reduktaza A1.010 180.000.83
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896125", "term_id": "33864566", "term_text": "NP_896125" >> NP_896125Gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (NADP+)1.100.970.002.75
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898418", "term_id": "33866859", "term_text": "NP_898418" >> NP_898418Fosfoglicerat kinaza0.840 550.161.03
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896766", "term_id": "33865207", "term_text": "NP_896766" >> NP_896766O-acetilserin (tiol) -liaza A0.850.570.140.97
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898597", "term_id": "33867038", "term_text": "NP_898597" >> NP_898597Molekularni nadzornik DnaK0.930.600.170.74
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896708", "term_id": "33865149", "term_text": "NP_896708" >> NP_896708Podjedinica beta ′ DNA usmjerene RNA polimeraze1.030440.080.32
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896236", "term_id": "33864677", "term_text": "NP_896236" >> NP_896236Transketolaza0.800 510.351.36
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896580", "term_id": "33865021", "term_text": "NP_896580" >> NP_896580Allofikocianin alfa lanac1.221141.141.45
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_897306", "term_id": "33865747", "term_text": "NP_897306" >> NP_897306Tioredoksin peroksidaza0.820.902.430.96
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898101", "term_id": "33866542", "term_text": "NP_898101" >> NP_898101C-fikoeritrin gama lanac klase II, povezni polipeptid1.100.490.092.71
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898458", "term_id": "33866899", "term_text": "NP_898458" >> NP_898458Rubrerythrin1.041.151.212.80
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896706", "term_id": "33865147", "term_text": "NP_896706" >> NP_896706Beta podjedinica DNA usmjerene RNA polimeraze0.640.480.090.37
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898080", "term_id": "33866521", "term_text": "NP_898080" >> NP_898080Mogući vezni polipeptid fikobilisoma1.080.791.402.28
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_897611", "term_id": "33866052", "term_text": "NP_897611" >> NP_897611Hipotetički protein SYNW15182.151010.371.39
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896409", "term_id": "33864850", "term_text": "NP_896409" >> NP_896409Polipeptid za povezivanje fikobilisom jezgre-jezgre cpcG1.081.390.000.81
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898278", "term_id": "33866719", "term_text": "NP_898278" >> NP_898278Protein izlučivanja vanjske membrane iz obitelji punda RND0.941482.100.91
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898090", "term_id": "33866531", "term_text": "NP_898090" >> NP_898090Vezni polipeptid fikobilisoma1.071.010.031.43
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898209", "term_id": "33866650", "term_text": "NP_898209" >> NP_898209Podjedinica reakcijskog centra putativnog fotosustava 1 XI0.780.300.000.40
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896844", "term_id": "33865285", "term_text": "NP_896844" >> NP_896844Ferredoksin-NADP reduktaza (FNR)1.070.922.521.53
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896398", "term_id": "33864839", "term_text": "NP_896398" >> NP_896398Polipeptid za stabilizaciju mangana u fotosustavu II0.971.220.201.47
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896769", "term_id": "33865210", "term_text": "NP_896769" >> NP_896769Protein CP43 fotosistema II koji veže klorofil0.790.290.030.55
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898073", "term_id": "33866514", "term_text": "NP_898073" >> NP_898073Protein CP47 koji veže klorofil fotosistema II0.680.350.000.13
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_898214", "term_id": "33866655", "term_text": "NP_898214" >> NP_898214Fotosustav 1 P700 klorofil apoproteinska podjedinica1.150.523.600.59
    <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "NP_896251", "term_id": "33864692", "term_text": "NP_896251" >> NP_896251Fosforilaza1.330.191.510.29
    Prosječno1.010.930.871.27
    SD0.270.560.970.81

    1-D SDS-PAGE gel kontrolnih i konzervacijskih uzoraka. Gel je bio gradijent od 4 �% s 60   μg proteina unesenog u svaku traku za uzorak. Standardi se odnose na proteinske ljestve od 10 �  kDa, s intenzivnim trakama od 50 i 30  kDa.

    Usporedba broja identifikacija proteina dobivenih kontrolom i četiri tehnike očuvanja. Svaki uzorak je dva puta analiziran pomoću LC –MS, a vrijednosti odražavaju prosjek i SD, normalizirane na kontrolni tretman (504   ± 𠂔 identifikacije proteina u svakoj tehničkoj replici kontrolnog uzorka, kontrolna   = � %).

    Identifikacije proteina prema LC –MS

    Proteomske analize temeljene na masenoj spektrometriji dale su najrealniju procjenu uspjeha očuvanja uzorka (slike ​ (slike3 3 – 5), budući da su replicirale željenu proteomsku analizu iz uzoraka na terenu.Tehnički ponovljene injekcije LC –MS provedene su za kontrolu i svaki uzorak za konzerviranje, s izuzetkom razgrađenog uzorka TCA. Zanimljivo je da je najveći broj identificiranih proteina bio iz RNKkasnije konzervirani uzorak, koji daje približno 103% proteina u odnosu na one identificirane u kontroli (slika ​ (slika3, 3, odmah zamrznuta bez pufera/konzervansa 520   ± � u RNAkasnije naspram 504   ± 𠂔 u kontroli). Ovaj iznenađujući rezultat implicira da je ovaj konzervans jednako dobar ili možda i uspješniji od sušenja u zamrzivaču, unatoč skladištenju na sobnoj temperaturi. Ovaj pristup korištenja konzervansa soli/metala kelatora uspješno je primijenjen za zamrzavanje morske cijanobakterije za transkriptomsku analizu (Zinser i sur., 2009). Naši nalazi ukazuju na to da se zamrzavanje nakon konzerviranja s RNAkasnije bila bi optimalna tehnika laboratorijskog očuvanja i u pokusima s kulturom morske cijanobakterije, iako povećani potrebni napori za desalinizaciju čine ovaj konzervans radno intenzivnijim za rad. Ostali konzervansi dali su manje identifikacija: s etanolom koji je dao 369 identifikaciju proteina (73   ± 𠂘% kontrole) i B-PER i pufer za ekstrakciju SDS-om koji su dali 201 jedinstvenu identifikaciju proteina (40   ± 𠂓% i 40   ± 𠂐.3%), što upućuje na to da se unatoč jasnim trakama koje se vide u 1-D gelu (slika ​ (slika1), 1), u tim uzorcima ipak vjerojatno događa razgradnja među manje obilje proteina.

    Dnevnik2 omjeri pojedinačnih relativnih količina proteina (prosjek tehničkih duplikata) identificirani u svakom od četiri konzervansa (RNAkasnije, etanol, B-PER i pufer za ekstrakciju SDS-om) u odnosu na kontrolni tretman (prosjek tehničkih duplikata). Proteini su poredani na vodoravnoj osi od onih s najvećim brojem normaliziranih spektralnih brojeva (SpC). Dnevnik2 omjeri blizu nule (vodoravne crte) odražavaju slične normalizirane rezultate spektralnog broja za svaki protein između tog konzervansa i kontrole, dok odstupanje ispod crte ukazuje na manju brojnost u očuvanom uzorku od kontrole zbog razgradnje. Normalizacija i ponderiranje rezultata spektralnog broja uključuje normalizaciju na ukupni broj spektara unutar svakog uzorka i ponderiranje u uzorcima (uključujući replike). RNKkasnije liječenje (A) pokazao je najmanju degradaciju u odnosu na kontrolu, a možda čak pokazuje i veću relativnu količinu rjeđih proteina u RNAkasnije uzorak (krajnje desno). Etanol (B) i SDS-ekstrakcijski pufer (D) pokazao je dobar oporavak najzastupljenijih proteina, ali razgradnju mnogih manje bogatih. Tretman B-PER (C) pokazala razgradnju, uključujući i najzastupljenije proteine. Linija podataka nagnuta prema gore na dnu (B 𠄽) uzrokovane su kombinacijom redoslijeda brojnosti na vodoravnim osama i niskog spektralnog broja razgrađenih proteina u očuvanoj obradi.

    Relativno obilje proteina prema LC –MS

    Usporedba relativne količine specifičnih proteina omogućuje procjenu stupnja razgradnje proteina na specifičnim obilnim i umjereno obilnim proteinima. Za ovaj pristup upotrijebili smo spektralno brojanje koje uključuje normalizirano brojanje svih masenih spektara povezanih s peptidima koji odgovaraju svakom proteinu. Za ovu studiju prikupljeni su podaci iz 1-D LC –MS/MS globalnog proteoma korištenog za gore opisane identifikacije proteina. Ovaj 1-D pristup ima prednost smanjenja varijabilnosti i maksimalne preciznosti ponovljenih analiza kako bi se omogućile kvantitativne usporedbe između tretmana konzerviranja. Kako bi se pokazala preciznost ovog pristupa, slika ​ Slika 4A 4 A prikazuje tehnički ponovljene injekcije za svih pet uzoraka, s replikama na suprotnim osi. Koherentnost linije 1: 1 za svaki protein primjenom pristupa normaliziranog spektralnog brojanja pokazuje ponovljivost u ovom mjerenju. Iako su spektralni brojevi ponderirani unutar svake injekcije i u svim uzorcima, ako ukupni broj spektara povezanih s peptidima varira zbog razgradnje, može se primijetiti neki ukupni sustavni pomak u broju proteina. Također kako bi se pokazala ponovljivost ovog pristupa, SD -i tehnički dupliciranih spektralnih brojeva prikazani su sa odgovarajućim srednjim spektralnim brojevima za svaki od 200 najzastupljenijih proteina (slika ​ (slika4B), 4 B), gdje je relativni SD manji od 26% za prvih 100 bjelančevina.

    (A) Usporedba tehnički ponovljenih injekcija svakog od četiri uzorka konzervansa i kontrola. Preciznost obilnijih proteina korištenjem ovog 1-D LC/MS spektralnog brojanja relativnog kvantitativnog pristupa bila je evidentna u koherentnosti s linijom 1: 1. Ova ponovljivost rezultata spektralnog broja proteina omogućila je usporedbu relativnih količina pojedinačnih proteina s različitim tehnikama očuvanja koje se koriste na slici ​ Slika5. 5. (B) Prosjek i SD tehnički dupliciranih normaliziranih spektralnih brojeva iz kontrolnog uzorka. Relativni SD iznosi 26% ili manje za 100 proteina s najvećom zastupljenošću, kako je određeno spektralnim brojenjem. Ova je pogreška manja od višestruke varijacije uočene u studijama razgradnje prikazanim na slici ​ Slika5 5.

    Uočili smo značajnu degradaciju pojedinih proteina, mjerenu gubicima u normaliziranim spektralnim brojevima, u uzorcima etanola, B-PER-a i pufera za ekstrakciju SDS-a u odnosu na kontrolu. Nasuprot tome, RNKkasnije konzervans uglavnom pokazuje malo ili nema znakova razgradnje u odnosu na kontrolu. Ovi rezultati su prikazani na slici ​ slika5 5 kao dnevnik2 omjeri relativne količine proteina (gdje svaka točka predstavlja prosjek tehničkih duplikata za specifične proteinske spektralne brojeve) u svakom od četiri konzervansa (RNAkasnije, etanol, B-PER i pufer za ekstrakciju SDS-om) normalizirani u odnosu na kontrolni tretman (također prosjek tehničkih duplikata). Proteini su prikazani po najvećem broju normaliziranih spektralnih brojeva u kontrolnom tretmanu (npr. S lijeve strane x-os), koja bi se općenito trebala podudarati s najzastupljenijim proteinima, uz upozorenje da spektralno brojanje teži stisnuti dinamički raspon proteina. Dnevnik2 omjeri blizu nule (prazne vodoravne linije) odražavaju slične normalizirane rezultate spektralnog broja za svaki protein između tog konzervansa i kontrole, dok odstupanje ispod crte ukazuje na manju brojnost u očuvanom uzorku od kontrole vjerojatno zbog razgradnje. RNKkasnije obrada (A) pokazala je najmanje raspršenje oko nulte linije promjene što ukazuje na malu degradaciju u odnosu na kontrolu. Većina konzervansa također je pokazala veću relativnu zastupljenost rjeđih proteina u odnosu na kontrolu (krajnje desno), iako je ovo tumačenje privremeno jer je relativna pogreška veća pri niskim spektralnim brojevima (slika ​ (slika4B). 4 B). Međutim, za RNKkasnije uzorka ovo tumačenje je u skladu s nešto većim brojem identifikacija proteina s RNAkasnije na slici ​ Slika3. 3. Konzervansi u etanolu (B) i puferu za ekstrakciju SDS-om (D) pokazali su dobar oporavak najzastupljenijih proteina, ali značajnu degradaciju preostalih proteina, kao i veliku raspršenost oko nulte linije promjene. Tretman B-PER (C) pokazao je degradaciju, uključujući i najzastupljenije proteine, ali je također imao najveći raspršivanje oko nulte linije od svih tretmana.

    Utjecaj razgradnje na 50 najzastupljenijih proteina (kako je određeno ukupnim normaliziranim rezultatima spektralnog broja) kvantitativno je uspoređen u tablici ​ tablici2. 2. Prosječna vrijednost spektralnog broja za RNKkasnije konzervans u odnosu na kontrolu bio je 1,01  +𠂐.27 (pogreška odražava SD), dok su druga tri prosjeka tretmana konzervansa ’ prosjeci bili dalje od jedinstva i imali su veći SD. Enzim alkalne fosfataze, protein biogeokemijske važnosti, bio je jedan od rijetkih visoko zastupljenih proteina koji je pokazao značajnu varijabilnost između RNAlatera i metoda kontrole. Ovaj enzim imao je slab oporavak u obje RNKkasnije i B-PER u odnosu na kontrolni tretman (Tablica ​ (Tablica2). 2). Studije na E coli alkalne fosfataze otkrile su da se ovaj enzim nalazi u periplazmi i da se može osloboditi iz neočišćenih stanica tretmanom s visokim koncentracijama EDTA (Malamy i Horecker, 1961.). Čini se vjerojatno da se slična lokalizacija alkalne fosfataze događa i u Synechococcus WH8102. Ovaj rezultat sugerira da treba biti oprezan pri izboru metoda očuvanja koje se koriste za stanice namijenjene kvantitativnim analizama periplazme i membrane.

    Boja ekstrahiranog materijala

    Uzorci su pokazivali izrazitu obojenost prije taloženja acetona/metanola, što ukazuje na diferencijalnu ekstrakciju klorofila i molekula za sakupljanje fikoerirtrina i#x02013phycoeryrthrina (Ong i Glazer, 1991. Blot i sur., 2009.). Uzorak TCA bio je blago plavo/zelen, etanol je bio žuto/zelen, uzorak B-PER je bio ružičast, pufer za ekstrakciju SDS-a je bio žuto/zelen, RNAkasnije bila žuto/smeđa, a kontrola najintenzivnija žuto/zelena. Ružičasta boja uzorka B-PER ukazuje na to da su kompleksi fikoburobilina i#x02013fikoeritrina posebno dobro ekstrahirani tijekom mjesečne inkubacije u njegovoj mješavini deterdženata. To je u skladu s visokim rezultatima spektralnog broja nekih proteina fikoeritrina, posebice, proteini alfa i beta klase II dva su najzastupljenija proteina otkrivena u svim uzorcima i najviše su obogaćena u tretmanu B-PER (slika ​ ( Slika4 4 Tablica ​ Tablica2 2).

    Razlike između ukupnog oporavka proteina i sastava proteoma

    Za svaki konzervans korišten je samo jedan uzorak, zbog troškova i napora u provođenju ove anketne studije o konzervansu s replikacijom na šest tretmana. Dok smo promatrali varijabilnost povezanu s pojedinačnim ekstrakcijama proteina koje su uzrokovale potpuni oporavak proteina rezultati se razlikuju, nemamo razloga misliti da su ekstrakcije proteina korištene ovdje promijenile proteom sastav pa otuda i ovdje uočeni rezultati očuvanja. Drugim riječima, svaka ekstrakcija može imati različite količine ukupne oporabe proteina zbog učinaka rukovanja, ali ti utjecaji ne bi trebali promijeniti sastav proteoma koji je metodologija masene spektrometrije sposobna karakterizirati. Glavni razlog za to je što su sve metode ekstrakcije proteina u ovoj studiji koristile ekstrakciju na bazi deterdženta (SDS ili B-PER) koja učinkovito otapa proteine. Na primjer, etanol, TCA, SDS i RNAkasnije sačuvani uzorci su koristili protokol ekstrakcije SDS-om za otapanje i ekstrahiranje proteina, ali RNAkasnije tretman je bio daleko učinkovitiji u broju identifikacija proteina (slika ​ (slika 3) 3) i relativnoj količini pojedinačnih proteina u usporedbi s neposredno smrznutom kontrolom (slika ​ (slika 5 5 tablica ​ tablica 2). 2) . Ranije smo također primijetili da ekstrakcije proteina proizvode konzistentan sastav proteoma s biološkim duplikatima i tijekom ciklusa diel na morskoj cijanobakteriji (u relativnoj i apsolutnoj brojnosti pojedinačnih proteina), unatoč utjecaju varijabilnosti ekstrakcije na ukupne prinose proteina (Saito et al. ., 2011.). Podaci u ovoj studiji također naglašavaju ovu razliku, gdje je varijabilnost u ukupnom oporavku proteina (slika ​ (slika1) 1) pokazala malu povezanost s onom u globalnom sastavu proteoma (slike ​ (slike3 3 i ​ i5). 5). Ova razlika odražava činjenicu da se postupci rukovanja koji uzrokuju gubitke ukupnih proteina vjerojatno razlikuju od svih procesa koji bi mogli obogatiti ili iscrpiti pojedine proteine ​​iz smjese. Iako su potrebne buduće studije kako bi se ispitalo potencijalno frakcioniranje proteina u protokolima ekstrakcije i optimizirala njihova učinkovitost, ti se ciljevi razlikuju od našeg fokusiranja na učinkovitost konzervansa ovdje.

    Implikacije i mehanizmi degradacije

    Zajedno, ovi rezultati pokazuju da je RNKkasnije vrlo je učinkovit u sprječavanju propadanja Synechococcus WH8102 biomase kulture na � ଌ tijekom trajanja i temperaturnog raspona koji su usporedivi sa stvarnim raspoređivanjem polja. Drugi pristupi konzervaciji rezultirali su većom razgradnjom proteina. Moguća upotreba RNKkasnije istodobno očuvanje DNA, RNA i proteina posebno obećava, dopuštajući da se sva tri analita potencijalno ekstrahiraju iz jednog sačuvanog uzorka (Ottesen i sur., 2011.). Jedno ograničenje ove studije je da je samo jedna vrsta korištena za ispitivanje očuvanja uzoraka, a ostaje utvrditi da li se ostale bakterijske i eukariotske vrste algi, uključujući prirodne sklopove, očuvaju sa usporedivim uspjehom. Osim toga, ova je studija istraživala samo razgradnju tijekom 1  mjeseca skladištenja s obzirom na uspjeh RNKkasnije u očuvanju bjelančevina čini se vrlo vjerojatnim da bi dulja primjena bila uspješna i da ju treba istražiti. Jedan faktor koji može biti važan je brojnost, lokalizacija i vrste proteaza u svakom organizmu. RNKkasnije sadrži organsku molekulu za keliranje metala za koju je poznato da deaktivira metaloproteaze sekvestriranjem njihovog cinka ili kobalta (Huston i sur., 2004.), a prisutnost ovog sastojka vjerojatno je pridonijela sposobnosti očuvanja. Obrada etanolom također je sadržavala kelator organskog metala EDTA (1  mM, tablica ​ tablica1), 1), ali ovaj tretman nije pokazao slična svojstva konzervansa, možda zbog poteškoća kelacije metala unutar ovog otapala. Marine Synechococcus sadrži značajan komplement enzima s proteolitičkom aktivnošću: genom WH8102 ima 19 proteaza i 26 peptidaza (vidi tekstualnu bilješku 4), a izvanstanična proteolitička aktivnost mjerena je u moru Synechococcus soj WH7803 (Martinez i Azam, 1993.). Iako su ti enzimi vjerojatno uključeni u brojne stanične procese, poput prikupljanja organskog dušika i lokalizacije proteina, mogli bi pridonijeti razgradnji proteina tijekom skladištenja i prerade. Visok sadržaj soli u RNKkasnije vjerojatno doprinosi i mogućnostima konzervansa za očuvanje proteina. Otopine s visokim udjelom soli obično se koriste za taloženje bjelančevina i također dehidriraju stanice, vjerojatno također inhibirajući proteolitičku aktivnost. Dodatni eksperimenti s inhibitorima proteaze također bi mogli poboljšati oporavak.


    Osnove sekvenciranja

    Automatsko fluorescentno sekvenciranje koristi varijaciju Sangerovog protokola o prekidu lanca razvijenog prije više od 20 godina. U ovoj metodi, DNA koju treba sekvencirati djeluje kao molekula šablona na koju će se kratki, komplementarni oligonukleotid (primer) žariti kako bi započeo enzimsko proširenje i amplifikaciju određene regije dvolančane DNA. Novostvoreni fragmenti bit će komplementarni s uzorkom DNK. Taj se proces odvija tijekom reakcije sekvenciranja ciklusa, procesa koji svaki uzorak koji primimo mora proći kako bi se pojačao i fluorescentno označio za detekciju na našim sekvencijalima.

    U ovoj reakciji sekvenciranja ciklusa, predložak i temeljni premaz se kombiniraju zajedno s reakcijskom smjesom sastavljenom od dNTP -a, fluorescentno označenih ddNTP -ova, enzima Amplitaq FS polimeraze i pufera. Reakcija sekvenciranja ciklusa sastoji se od tri koraka - denaturacije, žarenja i produženja - i odvija se u termičkom ciklusu, instrumentu koji omogućuje kontrolirano zagrijavanje i hlađenje naših reakcija. Ovi se koraci ponavljaju tijekom 35 ciklusa kako bi se osigurala dovoljna amplifikacija obilježene DNA, a potrebno je oko 3 1/2 sata da se završi.

    Tijekom koraka denaturacije, koji se događa na 96ºC, dvolančana DNA šablona najprije se odvaja u jednolančane molekule. U fazi žarenja, temperatura se snižava na 50ºC, tako da male molekule prajmera mogu pronaći svoje komplementarne regije na sada jednolančanoj šablonskoj DNK i pravilno hibridizirati ili žariti. Temperatura se zatim povisuje na 60ºC (korak produženja) kako bi enzim Taq polimeraze započeo ugradnju nukleotida u rastuće lance novostvorenih fragmenata koji su komplementarni jednolančanoj šablonskoj DNK. Ovi produžni produkti započinju na kraju temeljnog premaza i protežu se u smjeru 3 ’. Tijekom ovog koraka proširenja dolazi do prekida lanca. Naša reakcijska smjesa sadrži smjesu deoksinukleotida (dNTP) i dideoksinukleotida (ddNTP), u koncentracijama koje stvaraju statističku vjerojatnost da će dideoksinukleotid biti ugrađen umjesto deoksinukleotida na svakom položaju nukleotida u novonastalim fragmentima. Kad se dNTP uključi, novi će fragment nastaviti rasti. DdNTP sadrži atom vodika umjesto hidroksilne skupine na svom 3 'kraju i ne može sudjelovati u daljnjem proširenju. Stoga, kada je ddNTP ugrađen, daljnje produljenje lanca je blokirano, a to rezultira populacijom krnjih proizvoda različitih duljina.

    Kad se razdvoje elektroforezom, nastat će "ljestve" ovih krnjih produkata, od kojih se svaki razlikuje po veličini za jedan nukleotid, a najmanji završeni fragmenti najbrže teku na gelu. Postoje četiri različita ddNTP -a koja odgovaraju svakom od četiri DNA nukleotida, a svaki ddNTP ima različitu boju. Tako će svaki krnji fragment na svom 3 ’kraju sadržavati fluorescentno označen ddNTP, a ljestve za sekvenciranje bit će sastavljene od obojenih traka. Slijed se tada može odrediti korelacijom boje trake na gelu s njegovim specifičnim ddNTP -om i redoslijedom kojim su se kretale na gelu. Dakle, prvi i najmanji vizualizirani pojas odgovarat će prvom označenom nukleotidu ugrađenom neposredno uz temeljni premaz. Drugi pojas bit će fragmenti koji se sastoje od 1 neoznačenog dNTP -a i 1 označenog ddNTP -a koji su prekinuli te određene rastuće lance. Treći pojas će se sastojati od 2 neoznačena dNTPS -a, nakon čega slijedi 1 označeni ddNTP, i tako dalje do gela.

    Nakon što se uzorak pojača i označi, mora se elektroforezirati za odvajanje označenih fragmenata i njihovu vizualizaciju. Kao što je već spomenuto, ddNTP su fluorescentno označeni. Priložene boje su boje za prijenos energije i sastoje se od boje donatora energije fluoresceina povezane s bojom za dihlororhodamin koja prihvaća energiju.Ovaj sustav prijenosa energije mnogo je osjetljiviji od jednog sustava za bojenje i omogućuje nam korištenje manje DNK za detekciju, a osim toga, omogućuje nam sada sekvenciranje vrlo velikih molekula DNA, poput BAC -ova, PAC -ova, pa čak i neke bakterijske genomske DNA, što ranije manje osjetljive metode nisu mogle upravljati.

    Ovi fragmenti označeni bojom stavljaju se na sekvence i tijekom elektroforeze migriraju ili kroz poliakrilamidni gel ili tekući polimer i odvajaju se na temelju njihove veličine. Pred kraj gela ili kapilare, oni prolaze kroz područje koje sadrži prozor za čitanje, iza kojeg laserska zraka prolazi naprijed -nazad iza uzoraka koji migriraju. Ovaj laser pobuđuje fluorescentne boje pričvršćene na fragmente, a zatim emitiraju svjetlost na valnoj duljini specifičnoj za svaku boju. Ova emitirana svjetlost se, prema valnoj duljini, odvaja spektrografom na rashlađeni uređaj s punjenjem ili CCD kameru, tako da se sve četiri fluorescentne emisije mogu detektirati jednim laserskim propuštanjem. Softver za prikupljanje podataka prikuplja ove intenzitete svjetlosti iz CCD kamere u određenim rasponima valnih duljina ili virtualnih filtara i pohranjuje ih na računalo sekvencera kao digitalne signale za obradu. Softver za analizu zatim tumači fluorescentni intenzitet u svakoj podatkovnoj točki i dodjeljuje svoje osnovne interpretacije poziva.

    Instrumenti u našem laboratoriju

    Laboratorij za DNK sekvenciranje u Roswell Parku trenutno koristi dva genetska analizatora ABI PRISM 3130XL. Oni su automatizirani sekvenceri kapilarne DNA koje proizvodi Applied Biosystems. Svaki 3130 koristi niz od 16 kapilara, koji može pokrenuti 176 uzoraka u 24 sata koristeći našu trenutnu konfiguraciju ili do 384 uzorka u 24 sata s protokolom koji daje kraće duljine čitanja, ali omogućuje maksimalnu propusnost.

    Kod modela 3130, punjenje uzorka temelji se na elektrokinetičkom ubrizgavanju. Kad se ploča s uzorcima postavi na utovarnu palubu instrumenta, 16-kapilarni niz uranja u prvih šesnaest jažica za uzorke, primjenjuje se napon i negativno nabijeni ioni, koji su prvenstveno produžni produkti DNA, ali koji također mogu uključivati ​​tvari koje ometaju soli, ubrizgavaju se u kapilarni niz. Ovo je jedan od razloga zašto DNK mora biti posebno čista za izvođenja na 3130 jer se manji negativno nabijeni ioni, poput soli, prvenstveno ubrizgavaju i mogu ometati migraciju fragmenata DNA.

    Polimer koji teče tekućinom prolazi kroz 16 kapilara u nizu da djeluje kao matrica za odvajanje. Svježi alikvot polimera gura se u kapilare prije svakog ciklusa, ispirući polimer iz prethodnog ciklusa. Prije je naš laboratorij koristio najduži kapilarni niz predviđen za 3100, duljine 80 cm, te polimer Applied Biosystems POP-4 za medij za odvajanje. Ova kombinacija dala je oko 900 baza korisnog slijeda, a podaci za šesnaest uzoraka mogli su se dobiti za 3 sata, 40 minuta s ovim nizom i polimerom. Međutim, od tada smo razvili modificirane protokole rada koji koriste najnoviji polimer Applied Biosystems, POP-7 i niz od 50 cm. Ovaj polimer razvijen je posebno za ABI-jev visokopropusni sekvencer (model 3730) i pokazalo se da pruža duže duljine čitanja zajedno s kraćim radnim vremenom, ali nije podržan za upotrebu na modelu 3100. Prije nadogradnje na modele 3130, uspjeli su dobiti, u prosjeku, više od 900-950 Phred Q20 baza s našim "long-read" protokolom i 850-900 Q20 baza s našim "standard-read" protokolom koristeći naše modificirane protokole. Protokol "dugo čitanje" ima vrijeme izvođenja 2 sata, 45 minuta. Naš protokol "standardnog čitanja" dovršen je za 2 sata, 5 minuta. Neki od ovih radova predstavljeni su u Biotehnici. (2004. lipnja 36 (6): 932-3). S nadogradnjama 3130, možemo postići slične duljine čitanja i ocjene kvalitete u nešto kraćem vremenskom razdoblju.

    Elektroforezu olakšava visokonaponski električni krug u 3130. Punjenje se provodi kroz krug pomoću DNA i iona u polimeru, iona u puferu koji se koristi u instrumentu te putem električnih žica i elektroda. 3130 može ravnomjerno i učinkovito odvoditi toplinu iz ovog napona zbog velike površine spojenih kapilara silicija. Upravo taj atribut omogućuje primjenu visokog napona tijekom elektroforeze, a kao rezultat toga, značajno doprinosi smanjenju vremena rada bez gubitka razlučivosti. Stariji sekvenceri, poput Applied Biosystems 377, koji su koristili pločasti gel za odvajanje fragmenata DNA, također nisu mogli odvoditi toplinu i morali su se raditi znatno sporije i dulje kako bi se postigle dužine očitanja slične onima na 3130.

    Fragmenti za sekvenciranje prolaze kroz ćeliju za otkrivanje na kraju niza. Kraći fragmenti migriraju brže od dužih i prolaze kroz ćeliju za otkrivanje ovim redoslijedom. Argonsko-ionska laserska zraka uzrokuje uzbudu elektrona na bojama vezanim uz fragmente DNA u stanje veće energije. Kad se vrate u osnovno stanje, fluoresciraju. Emitirana fluorescencija bilježi se kamerom uređaja (CCD). Ova kamera sastoji se od silika dioksida s tisućama piksela koji pohranjuju električni naboj proporcionalan intenzitetu fluorescencije koji do njega doseže. CCD kamera zatim pretvara informacije o fluorescenciji u elektroničke podatke koji se prenose na računalo radi obrade. Softver obrađuje te podatke kako bi stvorio elektroferogram gdje svaki vrh predstavlja jedan fragment proizvoda za sekvenciranje DNA.

    Koje vrste DNK možemo sekvencirati i koliko nam je potrebno?

    Laboratorij za sekvenciranje DNA može sekvencirati različite uzorke DNK, uključujući plazmide, kozmide, PCR proizvode, jednolančanu DNK faga i BAC ili PAC klonove. Prilikom podnošenja DNK na sekvenciranje i ako osiguravate vlastite početne sekvence, koncentracije za različite vrste DNK trebaju se prilagoditi na sljedeći način:

    DNK tip Potrebna koncentracija Ukupno korišteno u reakciji
    Plazmid 200-250 ng/ul 500-700 ng
    Cosmid 200-250 ng/ul 500-700 ng
    PCR proizvod 10-20 ng/ul 10 ng/100 bp
    Jednolančani fag 100-150 ng/ul 300 ng
    BAC/PAC 300-400 ng/ul 700-900 ng
    Vaš prilagođeni primer 1 uM = 1 pmol/uL =

    * Molimo prilagodite svoje koncentracije DNK i prajmera u skladu s našim zahtjevima koncentracije.

    Pri gore navedenim koncentracijama koristit ćemo otprilike 3-4 ul po reakciji. Također, ta mjerenja ne moraju biti točno 200 ng/ul ili 10 ng/ul ili ovisno o tome što je primjenjivo - to su približne vrijednosti koliko bismo htjeli i ako ste za malo - recimo, dajte ili uzmite 30 ng/ ul za plazmide, 2-3 ng/ul za PCR proizvode- vjerojatno će i dalje biti u redu jer postoji niz koncentracija koje možemo koristiti i prikupiti dobre podatke o slijedu. A ako su vaši prinosi mnogo manji od naših zahtjeva, imate nekoliko mogućnosti. Prvo, ako imate pristup vakuumskoj centrifugi, alikvotirajte volumen koji sadrži UKUPNU količinu koju bismo upotrijebili, osušite je i zatim ponovno suspendirajte u vodi do željene koncentracije. Na primjer, ako je vaša početna koncentracija DNA plazmida samo 50 ng/ul, izvadite 10-15 ul, osušite je i zatim dodajte 3 ul vode. Ako nemate pristup vakuumskoj centrifugi, onda zabilježite u polju za komentare vašeg obrasca zahtjeva i mi ćemo upotrijebiti veći volumen vašeg uzorka u našoj reakciji sekvenciranja ciklusa.

    Međutim, imajte na umu da je maksimalni volumen DNA koji možemo dodati reakciji sekvenciranja 10 ul, pa da bismo postigli našu minimalnu ukupnu količinu DNK, vaša koncentracija ne može biti mnogo manja od 50 ng/ul za plazmide ili kozmide, 70 -90 ng/ul za uzorke BAC i PAC. Ako je vaša koncentracija uzorka niža od te, a nemate pristup vakuumskoj centrifugi, javite nam se i možemo je osušiti u našoj centrifugi ili ćemo vam pokazati kako to učiniti. Alternativno, možete obaviti taloženje etanola i resuspendirati u manjem volumenu kako biste koncentrirali svoje uzorke, ali ne zaboravite ukloniti sve tragove etanola.

    Općenito, za PCR proizvode, prinos proizvoda nije problem ako su vaši PCR uvjeti optimizirani i robusni. Međutim, ako imate veliki PCR proizvod koji treba sekvencionirati, to će zahtijevati više DNK (na primjer, za PCR proizvod od 2 kb potrebno je 100-150 ng DNK), pa ćete možda htjeti povećati svoju reakciju ili skupinu više reakcija zajedno. Osim toga, prilikom pružanja vlastitih prilagođenih premaza, prilagodite njihovu koncentraciju na 1 uM ili 10 uM za BAC/PAC uzorke. Pri tim koncentracijama koristit ćemo 4 ul temeljnog premaza po reakciji. Pružamo brojne uobičajene vektorske početnike, besplatno, za sekvenciranje. Potpuni popis provjerite na linku Primers koji vam nudimo. Kad god je moguće, navedite dovoljno DNK i temeljnog premaza za dvije reakcije u slučaju da iz bilo kojeg razloga moramo ponoviti reakciju.

    Odabir soja domaćina

    Odabir soja domaćina za pripremu vašeg predloška važan je faktor jer će neki sojevi dati značajno kvalitetniju DNK za automatizirano sekvenciranje. Određeni sojevi E.Coli mogu tijekom svoje lize osloboditi određene čimbenike, poput endonukleaza i velikih količina ugljikohidrata, koji mogu biti inhibitorni za pripremu i sekvenciranje DNA. Osim toga, određene stanične komponente, poput pozitivno nabijenih polisaharida, mogu se natjecati s DNA za vezanje u metodama pripreme DNA na bazi silicija, koje se obično koriste u mnogim komercijalnim setovima. Uvijek se preporučuje da provjerite s proizvođačima određenih sojeva kako biste utvrdili postoje li poznate poteškoće koje bi mogle nastati pri upotrebi njihovih sojeva u vašim aplikacijama. Sojevi domaćina koji općenito daju pouzdane podatke uključuju DH5alpha, DH10B, DH1, C600, XL1-Blue, XL10-Gold, TOP-10 i NM294. XL1 Plava raste sporije od većine sojeva i može dovesti do smanjenja prinosa DNA, ali obično i dalje dobro funkcionira. Sojevi poput JM101, JM83, HB101, TB1 i TG1 se NE preporučuju jer mogu osloboditi veliku količinu inhibitornih čimbenika tijekom lize što može dovesti do loše kvalitete DNA koja će zahtijevati dodatne korake pročišćavanja.

    Drugi čimbenici koje treba uzeti u obzir pri pripremi uzgoja kultura su izbor medija i odabir antibiotika. Treba izbjegavati prekomjerni rast stanica jer se stanice počinju prilično brzo lizirati nakon dostizanja stacionarne faze, oslobađajući velike količine razgrađene kromosomske i plazmidne DNA, kao i polisaharide koje je teško odvojiti od plazmidne DNA. Obično se preporučuju standardni LB mediji ili puferirani bogatiji mediji, jer će kultura preko noći od 10-12 sati općenito dati odgovarajuću gustoću stanica za učitavanje na kolone ili membrane, a osim toga imat će znatno manji udio razgrađenih staničnih materijala i zagađujuću DNK . Najbolje je izbjegavati medije poput TB -a ili 2xYT -a jer će oni prije doseći stacionarnu fazu, pa će stoga kultura preko noći dati neprikladno visoku gustoću stanica, kao i veći postotak inhibitornih tvari. Ako biste trebali koristiti takve medije, preporučljivo je pratiti vrijeme uzgoja i broj stanica kako biste izbjegli kontaminaciju DNA i preopterećenje stupca. Jedan trik koji možete isprobati je ispiranje vaših peletiranih stanica s 0,5M NaCl neposredno prije liziranja kako biste uklonili polisaharide i medijske materijale koji mogu koeluirati s vašom DNK. Resuspendirajte pelet u otopini 0,5 NaCl, dobro vrtložite i ponovno centrifugirajte, uklanjajući supernatant po završetku.

    Odabir antibiotika treba održavati cijelo vrijeme kako bi se izbjegao rast stanica koje ne sadrže plazmid. U nedostatku učinkovite selekcije, stanice koje ne sadrže plazmid prerast će stanice koje to čine, što će dovesti do slabog prinosa željene DNA. Osim toga, neki će plazmidi metabolizirati određene antibiotike, poput ampicilina, tijekom rasta stanica, pa je važno osigurati odgovarajuće koncentracije antibiotika kako bi se smanjilo iscrpljivanje. Antibiotike je potrebno alikvotirati i zamrznuti kako bi se održala optimalna učinkovitost.

    Priprema i pročišćavanje predloška

    Čistoća i koncentracija predloška dva su najvažnija čimbenika u dobivanju podataka o sekvenci dobre kvalitete. Čistoća i koncentracija predloška dva su najvažnija čimbenika u dobivanju podataka o sekvenci dobre kvalitete. Ne, ovo nije pravopisna pogreška, samo ne možemo dovoljno naglasiti ovo načelo kada je u pitanju automatizirano fluorescentno sekvenciranje, posebno na našim modelima 3130 koji zahtijevaju još strože metode čišćenja. Fluorescentno sekvenciranje vrlo je osjetljivo na određene zagađivače u uzorku DNK i DNK koji se smatra dovoljno čistim za mnoge druge molekularne biološke postupke poput PCR -a, kloniranja ili čak ručnog radioaktivnog sekvenciranja, NIJE nužno dovoljno čist za fluorescentno sekvenciranje i može dovesti do lošeg kvalitetni podaci ili ponekad uopće nema podataka. U ovom odjeljku navodimo naše preporuke o najboljim načinima čišćenja i kvantifikacije vaše DNK, ovisno o vrsti DNK koju pokušavate sekvencirati.

    Qiagen setovi jedna su od općeprihvaćenih metoda za davanje dosljedno visokokvalitetne DNA za automatizirano sekvenciranje. To ne znači da ne postoje druge metode koje ne djeluju - naveli smo nekoliko drugih preporučenih protokola - ali prema našem iskustvu, metode čišćenja Qiagena imaju najbolje rezultate u pouzdanosti i dosljednosti u konačnom proizvodu.

    Druga mogućnost koja je dostupna za pročišćavanje DNA koja daje predložak visoke kvalitete za automatizirano sekvenciranje DNA je Mini-Plasmid DNA Isolation kit dostupan u Centru za biomedicinska istraživanja (BRSC) u SUNY Buffalo. Ovaj komplet je "modificirana i pojednostavljena metoda mini pripreme alkalne lize od Sambrook i sur. (Molekularno kloniranje, CSH, NY) koja eliminira potrebu za dodatnom obradom RNaze i ekstrakcijom fenola-kloroforma. Plazmidna DNA može se lako i brzo očistiti iz kultura E. coli preko noći u 15 minuta s tipičnim prinosom od 1 - 5 mg DNA po ml kulture. DNA je pogodna za restrikcijsku probavu, pripremu sonde i PCR analizu. DNA koja će se koristiti za analizu sekvenciranja podvrgava se dodatni 5-minutni korak taloženja PEG-a (PS-4) kako bi se uklonila bilo koja količina RNA u tragovima. Lako se mogu dobiti visokokvalitetni rezultati sekvenciranja DNA (gotovo 1.000 baza razriješeno po sekvenciranju) ako se plazmidna DNA izolira iz prikladnog E . coli soj domaćina. Komplet (dovoljan za 300 mini priprema) stabilan je najmanje godinu dana ako se njime rukuje i pravilno skladišti. " (preuzeto sa web stranice BRSC -a). Po cijeni od 95 USD za 300 mini plazma preparata, ovaj komplet je znatno jeftiniji od Qiagen kompleta (oko jedne četvrtine cijene), brz je i vrlo jednostavan za upotrebu. Iz prve smo ruke vidjeli da je kvaliteta DNK dobivena iz ovog kompleta izvrsna za sekvenciranje i preporučili bismo upotrebu ovog kompleta za pročišćavanje DNA. BSRC je lokalni SUNY resurs koji promiče kolaborativna translacijska istraživanja, razvija i komercijalizira inovativne proizvode i proizvodi kvalitetne istraživačke reagense za široku znanstvenu zajednicu. Za više informacija o BSRC -u i njegovim proizvodima možete provjeriti njihovu web stranicu na: http://www.acsu.buffalo.edu/

    Vezu na protokol kompleta za izolaciju mini-plazmidne DNA možete pronaći na: Protokol pripreme mini-plazmida.

    Predlošci plazmida

    Razmatranja pri čišćenju preparata za plazmide

    Loša kvaliteta predloška jedan je od najčešćih razloga loših podataka o sekvenci, kao što je gore spomenuto, i glavni je faktor pri odabiru metode čišćenja plazmida kako bi se DNK dala optimalna čistoća za automatizirano sekvenciranje. Na kvalitetu šablona plazmida mogu utjecati različiti čimbenici i zagađivači, uključujući sljedeće:

    • Soli ili organske tvari preostale iz pripreme predloška
    • Prisutnost staničnih komponenti kao što su RNA, proteini, polisaharidi ili kromosomska DNA
    • DNK koji se razgradio tijekom skladištenja
    • Silikatne finoće koje se prenose iz kompleta za pripremu predložaka koji koriste rastresitu smolu ili otopine silicijevog dioksida

    Evo tablice dopuštenih zagađivača i njihovih prihvatljivih raspona koncentracija koji će i dalje omogućiti dobre podatke o sekvenciranju:

    Zagađivač Dopušteni iznos u reakciji sekvencioniranja
    RNK 1 ug
    KLIN 0.3%
    NaOAc 5-10 mm
    Etanol 1.25%
    Fenol 0%
    CsCl 5 mm
    EDTA 0,25 mm

    Neki komentari na učinke nekih od ovih zagađivača navedeni su u nastavku:

    RNK - Kao što možete vidjeti iz vrijednosti na gornjoj tablici, značajna količina RNA se zapravo može tolerirati u reakciji sekvenciranja. Uobičajen je zagađivač u plazmidnim miniprepima, osobito kada su kolone preopterećene i kad je kapacitet pufera za lizu prekoračen - preopterećenje može biti problem s miniprepregama Qiagen. Jedan od načina na koji RNA može potencijalno ometati je kada kvantifikujete svoje DNK pripreme spektrofotometrom- RNA se također apsorbira na 260, a kada je prisutna velika količina, to zaista može odbaciti točnost vaše koncentracije. Najbolje je, dakle, vaše predloške pripremiti s RNazom ili oborinom velike količine soli, a također i kvantificirati uzorke gelom, ali i spektroskopski.

    KLIN- prisutnost zaostalog polietilen glikola u pripremi predloška može imati inhibitorni učinak na ciklus sekvenciranja enzima Taq polimeraze i dovesti do slabog signala.

    Soli- procesnost Taq polimeraze koja se koristi u reakciji sekvenciranja ciklusa opada u prisutnosti velikih količina soli. Kontaminacija soli u pripremama DNA može biti posljedica koprecipitacije soli u talozima alkohola, nedovoljnog uklanjanja supernatanta nakon taloženja ili nepotpunog ispiranja peleta sa 70% etanola. Prilikom taloženja s alkoholom treba koristiti opreznu tehniku. Također je pokazano da su acetatni ioni, za razliku od natrijevih, kalijevih ili kloridnih iona, najsporiji u reakcijama sekvenciranja. Pri uporabi kalijevog acetata ili natrijevog acetata, koncentracije preko 20 mM dovele su do potpunog neuspjeha reakcija sekvenciranja, dok su koncentracije 60 mM natrijevog klorida bile potrebne prije potpune inhibicije. Soli mogu biti inhibitorne pri sekvenciranju uzoraka na našem 377 na bazi gela, ali su još problematičnije pri izvođenju uzoraka na našem 3100 kapilarnom sustavu jer se te manje, nabijene soli preferirano ubrizgavaju i ometaju migraciju uzoraka DNA.

    Etanol- do kontaminacije etanolom može doći kada se uzorak nakon taloženja nedovoljno osuši ili kada se prenese u pufer za ispiranje koji sadrži etanol, a koji se koristi u nekim postupcima izolacije DNA. Kontaminacija s 10% ili većom koncentracijom etanola obično dovodi do neuspjeha reakcije sekvenciranja DNA. Za uklanjanje ovih tragova etanola potrebno je potpuno sušenje uzoraka DNA.

    Fenol- fenol se može prenijeti iz metoda alkalne lize DNA koje koriste fenol i kloroform za uklanjanje proteina i drugih staničnih zagađivača iz staničnih lizata. Fenol se ne može tolerirati u reakciji sekvenciranja ciklusa jer denaturira proteine ​​i tako će razgraditi enzim Taq polimeraze koji se koristi u reakciji sekvenciranja ciklusa. Kloroform nema jaka denaturirajuća svojstva fenola i čini se da ne utječe negativno na reakciju sekvenciranja.

    Cezijev klorid - Kada se koristi protokol gradijenta gustoće gustoće ultracentrifugiranja cezijevog klorida, može se dobiti DNA vrlo visoke kvalitete pogodna za automatizirano sekvenciranje. U svakom slučaju, snažno se preporučuje da provedete dijalizu praćenu taloženjem etanola (najbolja metoda) ili obavite taloženje izopropanola minimalne sobne temperature kako biste uklonili sve tragove zaostalog cezijevog klorida jer cezij može inhibirati Taq polimerazu koja se koristi u reakciji sekvenciranja ciklusa.

    EDTA - EDTA može kelirati magnezij potreban Taq polimerazi u reakciji sekvenciranja ciklusa, pa je prilikom podnošenja uzoraka najbolje uvijek ih razrijediti ili resuspendirati u sterilnom puferu ddH20 ili 1X Tris. Suspenzija u TE međuspremniku se ne preporučuje, iako su to ljudi učinili i mnogo puta nema problema. Međutim, davanje šablona DNK u vodi je jednostavna stvar, a ako postoji problem s kvalitetom vašeg slijeda, činjenica da u vašem uzorku nema EDTA -e jedan je potencijalni problem koji možemo odmah ukloniti.

    Principi Qiagen kompleta

    Kao što je gore spomenuto, Qiagen proizvodi setove za ekstrakciju i pročišćavanje svih vrsta DNK, uključujući plazmidnu DNA. Kompleti miniprepa Qiagen plazmida sadrže smolu za izmjenu aniona koja se sastoji od pozitivno nabijenih DEAE skupina koje prvenstveno vežu negativno nabijenu kralježnicu DNA. Nakon što se DNA veže za smolu, drugi zagađivači poput soli, proteina, RNA i ugljikohidrata ispiru se u puferu s malo soli. DNA se eluira u drugom koraku, koristeći pufer s visokom količinom soli kako bi se odvojio od smole. Ovaj komplet je dizajniran za davanje DNK najveće čistoće i nešto je skuplji. Još jedan komplet koji nudi Qiagen je komplet Qiaprep koji koristi membranu na bazi silika gela za vezanje DNA u prisutnosti visokih koncentracija haotropnih soli. Soli se uklanjaju ispiranjem etanolom, a zatim se DNA eluira s Tris puferom niske ionske jakosti. Ova metoda dolazi u obliku spin stupca koji se može koristiti ili u centrifugi ili na vakuumskom razdjelniku. Ovaj komplet daje DNK čistoće pogodne za sekvenciranje, a također je i jeftiniji. Međutim, postoje neki čimbenici koje treba imati na umu pri korištenju kompleta Qiagen ili bilo kojih drugih kompleta miniprepa na bazi stupaca. Prvo, nemojte preopterećivati ​​stupce - RNA i polisaharidi mogu se natjecati s DNA za vezanje na smolu kolone i dovesti do niskih prinosa željene plazmidne DNA. Slijedite upute za rast stanica i koristite LB medije prema preporuci. Drugo, ne zaboravite isprati DNA sa 70% etanola nakon taloženja izopropanola kako biste uklonili višak soli. Pranje dva do četiri puta etanolom može poboljšati kvalitetu DNK, a osim toga, dodatna ispiranja s otopinom za vezanje mogu pomoći u uklanjanju drugih zagađivača. Treće, zagrijavanje pufera za ispiranje može pomoći u poboljšanju prinosa. I na kraju, uklonite sve tragove etanola prije ponovne suspenzije konačnog proizvoda u vodi.

    Metode alkalne lize/PEG

    Bakterije se mogu lizirati radi oslobađanja plazmidne DNA brojnim metodama, uključujući tretiranje deterdžentima, organskim otapalima, toplinom ili lužinama. Prilikom pokušaja izoliranja velikih plazmida (& gt15kb) koji su osjetljiviji na oštećenja tijekom postupka lize, trebala bi se koristiti nježnija metoda, poput ravnotežnog centrifugiranja ili liziranja s deterdžentom poput SDS -a. Prilikom liziranja stanica radi sakupljanja manjih plazmida, mogu se koristiti jače metode, poput alkalnog tretmana. Ovi tretmani uzrokuju denaturaciju i degradaciju linearne kromosomske DNA domaćina. Zatvoreni kružni plazmidni DNK lanci se ne odvajaju u potpunosti jer su topološki isprepleteni i kada se uvjeti vrate u normalu, lanci se ponovno stvaraju u nativnoj konformaciji kao superhelikale molekule.

    Standardni protokoli alkalne lize, zajedno s PEG taloženjem, mogu dovesti do male plazmidne DNA dovoljne čistoće za upotrebu u automatiziranom fluorescentnom sekvenciranju. Slijedi detaljan protokol za liječenje alkalne lize/PEG tretmana koji preporučuju Applied Biosystems, proizvođači naših DNK sekvencera.

    Napomena: Kako biste smanjili smicanje kontaminirajuće kromosomske DNA, nemojte koristiti vrtlog tijekom ovog postupka.

    1. Pelet 1,5 -4,5 ml alikvota kulture 1 minutu u mikrocentrifugi pri najvećoj brzini.
    2. Uklonite supernatant aspiracijom.
    3. Resuspendirajte bakterijski pelet u 200 ul GET pufera pipetiranjem gore -dolje.
    4. Dodajte 300 ul svježe pripremljenog 0,2N NaOH/1% SDS -a. Promiješajte sadržaj epruvete inverzijom. Inkubirajte na ledu 5 minuta.
    5. Neutralizirajte otopinu dodavanjem 300 ul 3,0 M kalijevog acetata, pH 4,8. Pomiješajte okretanjem epruvete. Inkubirajte na ledu 5 minuta.
    6. Uklonite stanične nečistoće vrtnjom u mikrocentrifugi maksimalnom brzinom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Prenesite supernatant u čistu epruvetu.
    7. Dodajte RNazu A (bez DNaze) do konačne koncentracije od 20 ug/ml. Inkubirajte epruvetu na 37 ° C 20 minuta.
    8. Supernatant se ekstrahira dva puta kloroformom:
      1. dodati 400 ul kloroforma
      2. miješajte slojeve inverzijom 30 sekundi
      3. centrifugirajte epruvetu 1 minutu kako biste odvojili faze
      4. gornju vodenu fazu prenijeti u čistu epruvetu.

      Pročišćavanje cezijevog klorida

      Pročišćavanje plazmidne DNA metodom gradijenta gustoće, poput ravnotežnog centrifugiranja u gradijentima CsCl-etidij bromida, može dati ultračistu DNA, a osobito je korisno za pročišćavanje velikih plazmida ili malih plazmida koji se trebaju koristiti u rigoroznijim pokusima, poput biofizičkih mjerenja. Ovaj protokol koristi činjenicu da će se etidij bromid interkalirati u različitim količinama kada naiđe na linearne ili zatvorene kružne molekule DNA. Zbog različitog vezanja ove boje, plutajuća gustoća linearne i zatvorene kružne DNA koja se formira nakon centrifugiranja bit će različita u gradijentima CsCl koji sadrže zasićene količine etidij bromida, čime se omogućuje učinkovito odvajanje plazmidne DNA od onečišćujuće kromosomske DNA, zarezane kružna plazmidna DNA, RNA i proteini. Ova je metoda dugo bila zlatni standard za dobivanje vrlo čiste DNA, ali je prilično dugotrajna i skupa. Komercijalni kompleti ili modificirane metode alkalne lize osiguravaju DNK odgovarajuće kvalitete za automatizirano sekvenciranje, pa uklanjaju potrebu za tako strogom metodom. Međutim, ako je pročišćavanje cezijevog klorida vaša metoda izbora, protokoli se mogu pronaći u priručnicima Maniatis Molecular Cloning.

      Nekoliko posljednjih napomena o pročišćavanju plazmida

      Metode vrenja DNK ekstrakcije nisu prihvatljive za automatizirano sekvenciranje, osim ako se ekstrahiraju fenol/kloroform radi uklanjanja svih proteina. Endonukleaze nisu uvijek potpuno inaktivirane tijekom postupka vrenja, a plazmidna DNA može se razgraditi u prisutnosti Mg ++ u sljedećim inkubacijskim postupcima.

      A ako, na kraju, vaša priprema plazmida još uvijek nije optimalne čistoće za dobre podatke o slijedovima iz naših sekvencera, evo nekoliko preporuka za daljnje korake čišćenja koji bi mogli pomoći:

      • Očistite svoju DNK ultrafiltracijom pomoću stupaca Centricon-100 Micro-koncentrator. Vidi protokol u stupcima Ultrafiltracija/odsjecanje molekularne težine.
      • Pročistite daljnjom ekstrakcijom:
        1. Dvaput ekstrahirajte DNA s 1 volumenom kloroforma ili kloroformom: izoamil alkoholom (24: 1 v/v)
        2. Dodati 0,16 volumena 5M NaCl i 1 ukupni volumen 13% PEG.
        3. Inkubirajte na ledu 20 minuta, zatim centrifugirajte maksimalnom brzinom u mikrocentrifugi na 2-6 ° C tijekom 20 minuta.
        4. Isprati pelet dva puta sa 70% etanola.
        5. Osušite pelet u vakuumskoj centrifugi 3-5 minuta ili do suhog.
      • Pročistiti uz minimalne količine taloga izopropanola:
        1. Dodajte 0,5 volumena 7,5 M amonijevog acetata ili 0,1 volumena 3M natrijevog acetata u razrijeđenu otopinu DNA (<100 ng/ul) i dobro promiješajte.
        2. Ovom ukupnom volumenu dodajte 0,6 volumena izopropanola sobne temperature i dobro promiješajte.
        3. Inkubirajte 5 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirajte maksimalnom brzinom kako biste DNK granulirali.
        4. Napunite epruvetu 70% etanolom i potpuno operite pelet.
        5. Osušite pelet u vakuumskoj centrifugi 3-5 minuta ili do suhog.

      PCR proizvodi

      Razmatranja pri čišćenju PCR proizvoda

      Prilikom podnošenja PCR proizvoda za izravno sekvenciranje, bitno je odvojiti PCR proizvod od potencijalno ometajućih tvari koje mogu ostati u otopini nakon PCR reakcije. Ti zagađivači ponekad mogu sudjelovati, pa se tako miješati, u reakciju sekvenciranja ciklusa i dovesti do podataka loše kvalitete ili ih uopće nema. Ono što je najvažnije, temeljne premaze i dNTPS treba ukloniti. Ako i prednji i obrnuti PCR početnici ostanu u otopini, oboje će djelovati kao početni premazi za sekvenciranje, što će rezultirati višestrukim vršcima od početka do kraja jer svaki primer može žariti komplementarne niti s različitim sastavom nukleotida, i na taj način dovesti do preklapanja fragmenata i nečitljivih podataka. Višak dNTP -ova također treba ukloniti jer će poremetiti specifične omjere dNTP -a/ddNTP -a potrebne za optimalno produženje i prekid u reakciji sekvenciranja ciklusa.

      Još jedno pitanje pri odabiru vaše metode čišćenja PCR -om je utvrđivanje prisutnosti jedne ili više traka koje mogu nastati kao rezultat vaše PCR reakcije. Nakon što je PCR reakcija završena, trebali biste provesti mali alikvot na agaroznom gelu kako biste procijenili njegovu kvalitetu. Ako imate jedan specifični pojas, bit će dovoljno ukloniti višak PCR reaktanata pomoću jedne od dolje navedenih metoda. Ako vaša PCR reakcija generira više traka, prekomjernu količinu primera-dimera ili razmazivanje niskog intenziteta, tada će biti potrebno izbaciti vaš PCR proizvod na gel, izrezati traku od interesa i očistiti je od gela . Alternativno, možda ćete htjeti provesti neko vrijeme optimizirajući svoju PCR reakciju kako biste eliminirali prisutnost ovih dodatnih traka ili artefakata i tako uštedjeli neko vrijeme nizvodno u gelu za pročišćavanje vaših PCR proizvoda za sekvenciranje.

      Bez obzira koju metodu pročišćavanja odabrali, uvijek biste trebali pročišćavati svoj PCR proizvod nakon pročišćavanja jer niti jedna metoda čišćenja neće dati 100% oporavak. Sve kvantitativne procjene koje napravite prilikom početnog izbacivanja vašeg PCR proizvoda na analitički gel bit će netočne jer ćete neizbježno izgubiti dio proizvoda tijekom pročišćavanja, posebno pri pročišćavanju gela.

      Jedna PCR traka

      Qiaquick PCR komplet za pročišćavanje

      Qiagen proizvodi setove za pročišćavanje PCR -a koji dolaze u formatu mikrocentrifuge ili vakuumskog razdjelnika, a mogu se obraditi bilo gdje od jednog PCR proizvoda pomoću spin kolona do 96 uzoraka u ploči sa 96 jažica. Ulomci veličine od 100 bp do 10 kb mogu se pročistiti dalje od prajmera, dNTP -a i soli koji mogu ometati reakciju sekvenciranja. Protokol je jednostavan i uključuje vezivanje DNA za kolonu ili membranu jažice, ispiranje zagađivača i ispiranje DNA iz membrane. Jedna lijepa stvar u vezi s ovim kompletom je to što nema dodatnih koraka za uklanjanje bilo kojeg mineralnog ulja koje bi moglo biti prisutno u PCR otopini.

      Eksonukleaza I/alkalna fosfataza škampa

      ExoSAP-IT je proizvod koji proizvodi USB Corporation i izvrsna je metoda za pročišćavanje PCR reakcija koje proizvode jednu specifičnu traku. Komponenta Exonuclease I funkcionira tako da hidrolizira sve zaostale jednolančane prajmere i sve jednolančane DNA fragmente nastale u PCR reakciji. Alkalna fosfataza škampa razgrađuje višak dNTPS -a koji ostane u reakciji. Smjesa ExoSAP dodana je izravno u PCR reakciju, inkubirana na 37ºC 15 minuta za hidrolizu jednolančane DNA i dNTPS, a zatim inkubirana na 80ºC 15 minuta radi inaktivacije enzima.

      Stupovi s ultrafiltracijom/odsjecanjem molekularne težine

      Uređaji Amicon Microcon i Centricon, koji se mogu kupiti u tvrtki Millipore, dostupni su s membranama za odsjecanje [MWCO] molekularne mase 30 000 i 100 000 i mogu odvojiti početne premaze od sintetiziranog PCR proizvoda. Prilikom pročišćavanja manjih PCR proizvoda (170 bp ili manje), odaberite Centricon 30. Za veće PCR proizvode, Centricon 100 dobro radi. Oni će istodobno koncentrirati i desalinizirati DNA, tipično uklanjajući preko 90% inkorporiranih primera i dNTP-a. Kad koristite bilo koji uređaj, mala čašica za uzorke ili spremnik ugrađena je u sabirnu cijev. Spremnik sadrži membranu za isključivanje veličine na donjoj površini. PCR proizvod se ubacuje u spremnik za uzorak zajedno s odgovarajućim volumenom destilirane vode (400 ul pri upotrebi filtra Microcon, 2 ml za Centricon), a zatim se centrifugira. Soli, dNTP -i i prajmeri se ubacuju u sabirnu cijev. Za oporavak pročišćene DNK, uklonite spremnik za uzorak iz bočice, preokrenite u novu epruvetu i još jednom centrifugirajte. Čisti PCR proizvod tada će biti uhvaćen u drugu bočicu za prikupljanje. Zbog povećanog volumena pranja i faktora koncentracije, jednim centrifugiranjem u Centricon uređaju uklanja se> 95% temeljnog premaza od 25 bp. Drugo okretanje uklanja do 4%više. Filter Microcon će imati koristi od dodatnih pranja-jedno pranje uklanja približno 87% temeljnih premaza, dok će tri pranja filtrirati između 95% -99% standardnih temeljnih premaza veličine PCR-a.

      Taloženje etanola

      Ako se pažljivo izvede, taloženje etanola će dati PCR produkte odgovarajuće čistoće za izravno sekvenciranje. Međutim, ako se ne učini kako treba, zaostali temeljni premazi i dNTPS, kao i preostali etanol, dat će loše podatke o sekvenci, stoga pažljivo i potpuno uklonite supernatant i pazite na pelet.

      Oba dolje navedena protokola odnose se na 50 ul PCR reakcije, koje nakon pročišćavanja daju bolje prinose, posebno za veće proizvode. Za PCR reakcije veće od 50 ul, proporcionalno povećajte navedene reagense. Za reakcije manje od 50 ul, dodajte vodu kako bi se volumen doveo do 50 ul. Ako je u reakciji PCR prisutno mineralno ulje, dodajte 100 ul kloroforma (ne miješajte s otopinom PCR), centrifugirajte pri 10 000 okretaja u minuti 30 sekundi, a zatim usisajte supernatant u čistu epruvetu. Komponenta kloroform/mineralno ulje slegnut će na dno.

      • Protokol 1
        Temeljito pomiješajte 25 ul 7,5 M amonijevog acetata sa 190 ul 95% etanola. Ovoj smjesi dodajte pročišćeni supernatant (ako je prethodno korišteno mineralno ulje) ili svoju PCR otopinu. Vrtložite i stavite na led, ili na -20ºC, 30 minuta da se talože PCR proizvodi. Centrifugirajte 10.000 okretaja u minuti 10 minuta na 4 ° C. Potpuno uklonite supernatant i osušite pelet, bilo sušenjem na zraku ili u vakuumskoj centrifugi (ne sušite previše, nekoliko minuta u vakuumskoj centrifugi će biti u redu). Resuspendirati u 20 ul vode.
      • Protokol 2
        Temeljito pomiješajte 5 uL 3M natrijevog acetata, pH 4,6, sa 100 uL 95% -tnog etanola. Ovoj smjesi dodajte pročišćeni supernatant ili svoju PCR otopinu. Vrtložite i stavite na led, ili na -20ºC, 30 minuta da se talože PCR proizvodi. Cijevi centrifugirajte u mikrocentrifugi maksimalnom brzinom 20 minuta. Potpuno uklonite supernatant i odbacite. Dodajte 300 ul 70% -tnog etanola da isperete pelet, kratko vrtložite i vrtite dodatnih 5 minuta maksimalnom brzinom. Potpuno uklonite supernatant i bacite, pazeći da ne izgubite pelet. Osušite pelet i ponovo suspendirajte u 50 ul vode.

      Više PCR traka

      Pročišćavanje gela

      Prilikom pročišćavanja PCR proizvoda gel filtracijom, može se upotrijebiti standardna ili nisko talište agaroze s TBE ili TAE puferom. Međutim, važno je upotrijebiti visokokvalitetnu agarozu kao što je FMC SeaPlaque ili SeaPrep kako bi se minimiziralo prenošenje neželjenih zagađivača koji mogu inhibirati reakciju sekvenciranja. Prilikom pročišćavanja PCR trake, gel koji sadrži PCR proizvod od interesa najprije se vizualizira pod izvorom UV svjetla, a traka se zatim izreže iz agaroznog gela čistom, oštrom britvicom - minimizirajte količinu agaroze koja se izreže pomoću bend, čak i ako to znači gubitak malo DNK. Sitni komadići agaroze mogu negativno utjecati na reakciju sekvenciranja. Osim toga, važno je zapamtiti da UV svjetlo šteti vašoj DNK - do oštećenja može doći u vremenu koje vam treba za izrezivanje trake, a njegov učinak može postati očit pri sekvenciranju vaše DNK, jer možete vidjeti dramatično skraćene duljine čitanja. Stoga, kad god je to moguće, smanjite intenzitet izvora UV svjetla, smanjite vrijeme izlaganja ili upotrijebite 366 nm UV izvor ako je dostupan. Stavljanje staklene ploče između izvora svjetlosti i vašeg gela također može pomoći u smanjenju degradirajućeg učinka UV svjetla na vašu DNK. Nakon što se vaš interesni pojas izolira iz gela, mogu se koristiti brojne metode za odvajanje PCR proizvoda od kriške agaroze, uključujući komplet za pročišćavanje gela Qiaquick (NAJVIŠE preporučeno), Millipore Ultrafree komplet s modificiranim TAE puferom, Promega PCR Pripreme čarobnjaka i kompleti Bio101 Geneclean. Pažljivo slijedite upute proizvođača.

      PCR produkte također treba ispitati i kvantificirati na agaroznom gelu NAKON pročišćavanja gela, jer nećete postići 100% oporavak i vaša pretpostavljena koncentracija PCR -a za sekvenciranje neće biti točna.

      BAC/PAC DNA

      Razmatranja pri čišćenju BAC/PAC DNA

      Prilikom pokušaja sekvenciranja velikih DNK predložaka, poput umjetnih bakterijskih kromosoma (BAC) ili umjetnih kromosoma izvedenih iz P1 (PAC), kvaliteta DNK predloška postaje još važnija. Kao i kod pročišćavanja plazmidne DNA, Qiagen setovi daju izvrsne rezultate za pročišćavanje BAC DNA za sekvenciranje i pružaju nekoliko različitih metoda za čišćenje predloške DNA, uključujući Qiafilter patrone i komplet za veliku konstrukciju, pri čemu je potonji nešto uključeniji. Jedan izmijenjeni protokol Qiafilter Plasmid Midi kompleta, koji je dosljedno davao dobru kvalitetu BAC DNA za sekvenciranje, ljubazno nam je dostavljen od Wenjie Wua i njegove ćemo izmjene objaviti ovdje.

      • upotrijebite 100 ml BAC kulture
      • P1 pufer: dodajte 10 ml
      • P2 pufer: dodati 10 ml
      • P3 pufer: dodajte 10 ml
      • nakon dodavanja P3 pufera, inkubirajte uzorak na ledu 15 minuta, zatim centrifugirajte pri 4000 o / min 30 minuta na 4 ° C (bez inkubacije na sobnoj temperaturi).
      • dodati supernatant iz centrifugiranog uzorka u uložak i filtrirati uzorke u čistu epruvetu
      • nanesite filtrirani supernatant na vrh Qiagena radi daljnjeg pročišćavanja i slijedite preostali protokol Qiagena.
      • pri eluiranju DNK, otopinu QF -a najprije zagrijte na 65 ° C i eluirajte 5 x 1 ml kako biste povećali iskorištenje.

      Mogu se koristiti i druge metode pročišćavanja BAC -a, uključujući pročišćavanje CsCl, a neki drugi protokoli dostupni su na sljedećim web stranicama:

      Napredni centar za genomsku tehnologiju Sveučilišta Oklahoma:
      http://www.genome.ou.edu/DblAcetateProcV3.html

      Napomena: BAC DNA pripremljena na instrumentu Autogen općenito ne funkcionira dobro za sekvenciranje

      Metode kvantifikacije

      Postoje tri metode koje se uobičajeno koriste za kvantifikaciju DNK - spektrofotometrija, analiza agaroznog gela i fluorometrija. Ove metode također vam mogu dati osjećaj koliko je vaša DNK čista, iako niti jedna od ovih metoda neće sve otkriti. Kada koristite spektrofotometar, obično ćete mjeriti i na A260 i na A280, jer će se DNK apsorbirati na A260, dok se protein apsorbira na A280. Ova očitanja daju vam omjer A260/A280.Dobar omjer DNK A260/A280 trebao bi biti između 1,7-1,9. Ako ustanovite da je vaš omjer manji, to može ukazivati ​​na kontaminaciju vašeg uzorka proteinima ili organskim kemikalijama. Ako je moguće, upotrijebite spektrofotometar koji može izvesti skeniranje valne duljine od 220 nm do 330 nm jer bi skeniranje moglo biti korisno u otkrivanju drugih zagađivača, poput fenola, koji se može otkriti na 230 nm, i čestica u otopini koje se mogu apsorbirati pri 325 nm. Prilikom izračunavanja koncentracije DNK spektrofotometrom morat ćete znati da jedan A260 O.D. jedinica (apsorbancija) dvolančane DNA sadrži 50 ng/ul. Jedan O.D. jedinica je količina tvari otopljene u 1 ml koja daje očitanje apsorbancije 1,0 u spektrofotometru s duljinom puta 1 cm. Dakle, da biste izračunali koncentraciju DNK koju imate, pomnožit ćete vrijednost apsorbancije s faktorom konverzije od 50ng/ul puta bilo kojeg faktora razrjeđenja koji ste možda koristili, a to će vam dati koncentraciju vašeg uzorka u ng/ul ili mg/ml. Međutim, kvantifikacija vaše DNK prema specifikacijama vjerojatno je najmanje točna od tri metode jer će i RNA i kontaminirajuća DNA također apsorbirati na 260 nm i potencijalno mogu dovesti do netočnih vrijednosti. Također, očitanja veća od 1,0 OD ili manja od 0,05 vjerojatno nisu vrlo točna, ograničavajući osjetljivost i raspon ove metode.

      Kvantifikacija elektroforezom u agaroznom gelu teži biti točnija jer možete vizualizirati svaku kontaminirajuću DNK ili RNK. Pročišćena DNA trebala bi se odvijati kao jedna traka na agaroznom gelu, dok će neizrezana plazmidna DNA pokazivati ​​tri vrpce: super namotanu, usječenu i linearnu. Ova metoda je također korisna pri kvantifikaciji malih količina DNA, poput PCR proizvoda. Uzorak DNA se pokreće na gelu pored ljestvice mase sastavljene od fragmenata poznatih i različitih koncentracija, a intenzitet vaše DNK trake vizualno se uspoređuje s intenzitetom traka s ljestvice mase kako bi se procijenila koncentracija DNA. Kada koristite gel od agaroze, ne možete otkriti prisutnost proteina ili kemikalija. Da biste dobili što više informacija o količini i kvaliteti vaše željene DNK, potrebno je zajedno koristiti i spektroskopske i gel metode kvantitacije.

      Možda najtočnija metoda mjerenja ova tri je uporaba fluorometra. U DNK se mogu dodati boje, kao što je Hoechst 33258 Dye ili Picogreen, koje se interkaliraju u AT -bogate regije dvolančane DNK i stoga su vrlo specifične za dvolančanu DNK, izbjegavajući probleme kontaminacije RNA koji se vide pri upotrebi spektrofotometra. Uobičajeni zagađivači prisutni u pripravcima DNA kao što su soli, urea, etanol, kloroform, deterdženti, proteini i agaroza nemaju značajan utjecaj na ove testove pa stoga dovode do mnogo osjetljivije i preciznije metode za određivanje količine. Fluorometrijskim mjerenjima mogu se otkriti razine DNA do 5 ng/ul.

      Dizajn temeljnog premaza

      Na internetu postoji mnogo programa koji vam mogu pomoći pri odabiru temeljnih premaza, određivanju potencijalnog stvaranja dimera primerka ili strukture ukosnica te izračunavanju Tm. Ovi programi mogu biti osobito korisni kada trebate dizajnirati više skupova primera kako biste osigurali pokrivanje velike regije DNK. Pogledajte naš odjeljak Korisne veze za neke programe za oblikovanje temeljnih premaza koji su nam bili od pomoći. S obzirom na to, evo nekih uobičajenih pravila za sekvenciranje dizajna temeljnog premaza:

      • temeljni premaz trebao bi biti dugačak 18-24 nukleotida - to pomaže u osiguravanju dobre i specifične hibridizacije s DNA uzorka. Dugi temeljni premazi (& gt35-40bp) imaju tendenciju da ne djeluju jednako dobro u sekvenciranju zbog povećanih šansi za stvaranje sekundarne strukture
      • Sadržaj G/C trebao bi biti približno 50%, ali raspon može biti 30-80%
      • Tm bi trebao biti između 50º -60ºC - ako je vaš Tm znatno ispod toga, možda se neće pravilno hibridizirati, jer je temperatura žarenja u našoj reakciji sekvenciranja ciklusa 50ºC. Ako je potrebno, dodajte još nekoliko baza svom temeljnom premazu kako biste povećali njegov Tm. Za izračun Tm vašeg premaza upotrijebite sljedeću formulu:
        • Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) º C

        Kao posljednju napomenu o naručivanju temeljnih premaza - iako je čistoća temeljnog premaza važna, općenito nije potrebno imati ultračiste temeljne premaze, poput onih pročišćenih HPLC ili OPC uloškom, iako je to, naravno, optimalno. Sve dok je učinkovitost sinteze oligoa visoka i većina vaše otopine temeljnih premaza sadrži temeljne premaze cijele dužine, tada bi trebalo biti jednostavno i desalinizirati vaše temeljne premaze. Premazi loše kvalitete sinteze neće dobro funkcionirati za sekvenciranje jer će, zajedno s vašim proizvodom cijele dužine, postojati veći udio "neuspješnih" temeljnih premaza (tj. Skraćeni temeljni premazi manje od pune duljine, u različitim veličinama) koji također mogu djelovati kao početni slojevi za sekvenciranje. Podaci o nizovima iz ovih početnica bit će loši, u rasponu od neupotrebljivih do manjih vrhova "sjena" ispod odgovarajućih vrhova. Pogledajte više u odjeljku Rješavanje problema kako biste saznali kako prepoznati ovaj problem. Prilikom podnošenja prilagođenih temeljnih premaza za sekvenciranje, razrijedite ih u vodi do odgovarajuće koncentracije.

        Za majstore "uradi sam"

        Za one koji odabiru ekonomičan izbor postavljanja vlastitih reakcija sekvenciranja, moraju se uzeti u obzir određene stvari. Prvo ćete morati kupiti komplet za izvođenje reakcija sekvenciranja ciklusa. Sekvenciranje ciklusa je metoda potrebna za amplifikaciju i fluorescentno označavanje vaše DNK kako bi se mogla otkriti na našim automatiziranim sekvencijalima. Sekvenciranje ciklusa vrlo je slično PCR -u, ali s dvije velike razlike. U ciklusu sekvenciranja koristi se jedan primer umjesto dva, čime se daje linearno pojačanje jednog označenog lanca. Osim toga, mješavina označenih i neoznačenih dNTP -a koristi se u reakcijskoj smjesi kako bi se omogućilo fluorescentno označavanje DNK i završetak lanca fragmenata. Pročitajte odjeljak Principi automatiziranog fluorescentnog sekvenciranja DNA za detaljnije informacije o osnovama ciklusa sekvenciranja. Nakon što su reakcije postavljene, morat ćete ih pokrenuti u termičkom ciklusu kako biste izvršili ugradnju fluorescentno označenih ddNTP -ova i amplifikaciju željene DNA. Nakon što je završena reakcija sekvenciranja ciklusa, morat ćete pročistiti reakciju kako biste uklonili soli, neiskorištene reaktante i, što je najvažnije, nepovezanu molekulu terminatora boje. Ako se ovaj korak ne izvrši pažljivo, ove višak molekula bojila će migrirati zajedno s vašom DNK i uzrokovati takozvane "mrlje boje" koje mogu ometati pravilno pozivanje vaše DNA. Pogledajte odjeljak Rješavanje problema za primjer mrlje boje.

        S obzirom na to, ispod smo dali naše preporuke i protokole, kao i popis nekih zaliha i brojeva dijelova koji će vam trebati za početak.

        Reagensi

        Reakcijske smjese za sekvenciranje ciklusa moraju se kupiti od Applied Biosystems, proizvođača naših sekvencera. Za najbolju kvalitetu slijeda i duljinu čitanja, preporučujemo uporabu kemikalija Big Dye Terminator, što koristimo u svojim reakcijama sekvenciranja. Dostupne su dvije standardne kemije za rutinsko sekvenciranje predložaka, Big Dye Terminator v3.1 i 1.1. Brojevi dijelova navedeni su u nastavku:

        BigDye ® Terminator v3.1 komplet za sekvenciranje ciklusa
        (protokol posebno naručen p/n 4337035)


        Sadržaj

        Riječ "emulzija" dolazi od latinskog emulgere "izmuzati", iz ex "van" + mulgere "mlijeku", jer je mlijeko emulzija masti i vode, zajedno s ostalim komponentama, uključujući koloidne micele kazeina (vrsta izlučenog biomolekularnog kondenzata). [2]

        Napomena 1: Definicija se temelji na definiciji u ref. [3]

        Napomena 2: Kapljice mogu biti amorfne, tekuće-kristalne ili bilo koje
        njihova smjesa.

        Napomena 3: Promjeri kapljica koje čine disperzna faza
        obično se kreću od približno 10 nm do 100 μm, tj. kapljica
        mogu premašiti uobičajene granice veličine za koloidne čestice.

        Napomena 4: Emulzija se naziva emulzija ulje/voda (o/w) ako je
        dispergirana faza je organski materijal i kontinuirana faza je
        vode ili vodene otopine i naziva se voda/ulje (bez vode) ako je dispergirano
        faza je voda ili vodena otopina, a kontinuirana faza je an
        organska tekućina ("ulje").

        Napomena 5: Emulzija bez vode ponekad se naziva i inverzna emulzija.
        Izraz "inverzna emulzija" je pogrešan, što pogrešno sugerira da
        emulzija ima svojstva koja su suprotna svojstvima emulzije.
        Stoga se njegova uporaba ne preporučuje. [4]

        Emulzije sadrže i dispergiranu i kontinuiranu fazu, s granicom između faza koja se naziva "sučelje". [5] Emulzije imaju zamućen izgled jer mnoga fazna sučelja raspršuju svjetlost pri prolasku kroz emulziju. Emulzije izgledaju bijele kada se sva svjetlost jednako rasprši. Ako je emulzija dovoljno razrijeđena, svjetlo veće frekvencije (niske valne duljine) će se više raspršiti, a emulzija će izgledati plavije-to se naziva "Tyndallov efekt". [6] Ako je emulzija dovoljno koncentrirana, boja će se iskriviti prema razmjerno većim valnim duljinama, te će izgledati više žuto. Taj se fenomen može lako uočiti ako se usporedi obrano mlijeko, koje sadrži malo masti, sa vrhnjem koje sadrži mnogo veću koncentraciju mliječne masti. Jedan primjer bi bila mješavina vode i ulja. [ potreban je citat ]

        Dvije posebne klase emulzija - mikroemulzije i nanoemulzije, s veličinom kapljica ispod 100 nm - izgledaju prozirne. [7] Ovo svojstvo posljedica je činjenice da se svjetlosni valovi raspršuju po kapljicama samo ako njihove veličine prelaze oko jedne četvrtine valne duljine upadne svjetlosti. Budući da je vidljivi spektar svjetlosti sastavljen od valnih duljina između 390 i 750 nanometara (nm), ako su veličine kapljica u emulziji ispod oko 100 nm, svjetlost može prodrijeti kroz emulziju, a da se ne rasprši. [8] Zbog sličnosti u izgledu, prozirne nanoemulzije i mikroemulzije često se miješaju. Za razliku od prozirnih nanoemulzija, za koje je potrebna proizvodnja posebne opreme, mikroemulzije se spontano stvaraju "otapanjem" molekula ulja mješavinom tenzida, ko-tenzida i kootapala. [7] Potrebna koncentracija tenzida u mikroemulziji je, međutim, nekoliko puta veća od one u prozirnoj nanoemulziji i značajno premašuje koncentraciju disperzirane faze. Zbog mnogih neželjenih nuspojava uzrokovanih tenzidima, njihova prisutnost je nepovoljna ili zabranjena u mnogim primjenama. Osim toga, stabilnost mikroemulzije često se lako narušava razrjeđivanjem, zagrijavanjem ili promjenom razine pH. [ potreban je citat ]

        Uobičajene emulzije inherentno su nestabilne i stoga nemaju tendenciju spontanog stvaranja. Unos energije - tresenjem, miješanjem, homogeniziranjem ili izlaganjem ultrazvuku [9] - potreban je za stvaranje emulzije. S vremenom se emulzije nastoje vratiti u stabilno stanje faza koje sadrže emulziju. Primjer toga vidi se u odvajanju ulja i octa od sastava vinaigrette, nestabilne emulzije koja će se brzo odvojiti, osim ako se gotovo stalno ne mućka. Postoje važne iznimke od ovog pravila - mikroemulzije su termodinamički stabilne, dok su prozirne nanoemulzije kinetički stabilne. [7]

        Hoće li se emulzija ulja i vode pretvoriti u emulziju "voda u ulju" ili emulziju "ulje u vodi" ovisi o volumenskom udjelu obje faze i vrsti emulgatora (surfaktant) (vidi Emulgator, dolje) prisutan. [ potreban je citat ]

        Nestabilnost Uređivanje

        Stabilnost emulzije odnosi se na sposobnost emulzije da se odupre promjeni svojih svojstava tijekom vremena. [10] [11] Postoje četiri vrste nestabilnosti u emulzijama: flokulacija, kremiranje/taloženje, koalescencija i Ostwaldovo sazrijevanje. Flokulacija se događa kada postoji privlačna sila između kapljica, pa tvore flokule, poput grozdova grožđa. Ovaj se proces može poželjeti, ako se kontrolira u opsegu, za podešavanje fizičkih svojstava emulzija, kao što je ponašanje protoka. [12] Koalescencija se događa kada se kapljice sudaraju jedna o drugu i kombiniraju se u veću kapljicu, pa se prosječna veličina kapljica povećava s vremenom. Emulzije se također mogu podvrgnuti kremiranju, gdje se kapljice uzdižu do vrha emulzije pod utjecajem uzgona, ili pod utjecajem centripetalne sile inducirane pri upotrebi centrifuge. [10] Krema je uobičajena pojava u mliječnim i mliječnim napicima (npr. Mlijeko, mlijeko od kave, bademovo mlijeko, sojino mlijeko) i obično ne mijenja veličinu kapljica. [13] Taloženje je suprotan fenomen kremiranja i normalno se opaža u emulzijama voda u ulju. [5] Taloženje se događa kada je disperzirana faza gušća od kontinuirane faze i gravitacijske sile povlače gušće kugle prema dnu emulzije. Slično kremiranju, sedimentacija slijedi Stokeov zakon.

        Odgovarajuće "površinski aktivno sredstvo" (ili "tenzid") može povećati kinetičku stabilnost emulzije tako da se veličina kapljica ne mijenja značajno s vremenom. Stabilnost emulzije, poput suspenzije, može se proučavati u smislu zeta potencijala, što ukazuje na odbojnost između kapljica ili čestica. Ako se veličina i disperzija kapljica ne promijene tijekom vremena, kaže se da je stabilna. [14] Na primjer, emulzije ulje u vodi koje sadrže mono- i digliceride te mliječni protein kao tenzid pokazale su da je stabilna veličina kapljica ulja tijekom 28 dana skladištenja na 25 ° C. [13]

        Praćenje fizičke stabilnosti Uredi

        Stabilnost emulzija može se okarakterizirati tehnikama kao što su raspršenje svjetlosti, mjerenje refleksije fokusiranog snopa, centrifugiranje i reologija. Svaka metoda ima prednosti i nedostatke. [15]

        Ubrzavajuće metode za predviđanje roka trajanja Uredi

        Kinetički proces destabilizacije može biti prilično dug - do nekoliko mjeseci, pa čak i godina za neke proizvode. [16] Često formulator mora ubrzati ovaj proces kako bi testirao proizvode u razumnom vremenu tijekom projektiranja proizvoda. Najčešće se koriste toplinske metode - one se sastoje od povećanja temperature emulzije kako bi se ubrzala destabilizacija (ako su ispod kritičnih temperatura za inverziju faza ili kemijsku razgradnju). [17] Temperatura ne utječe samo na viskoznost, već i na međufaznu napetost u slučaju neionskih tenzida ili, u širem opsegu, na interakcije između kapljica unutar sustava. Pohranjivanje emulzije na visokim temperaturama omogućuje simulaciju realnih uvjeta za proizvod (npr. Cijev emulzije kreme za sunčanje u automobilu po ljetnim vrućinama), ali i ubrzava procese destabilizacije do 200 puta. [ potreban je citat ]

        Također se mogu koristiti mehaničke metode ubrzanja, uključujući vibracije, centrifugiranje i miješanje. [ potreban je citat ]

        Ove su metode gotovo uvijek empirijske, bez zdrave znanstvene osnove. [ potreban je citat ]

        An emulgator (također poznat i kao "emulgent") je tvar koja stabilizira emulziju povećavajući njezinu kinetičku stabilnost. Emulgatori su dio šire skupine spojeva poznatih kao površinski aktivne tvari ili "površinski aktivne tvari". [18] Površinski aktivne tvari (emulgatori) su spojevi koji su tipično amfifilni, što znači da imaju polarni ili hidrofilni (tj. Topiv u vodi) dio i nepolarni (tj. Hidrofobni ili lipofilni) dio. Zbog toga emulgatori imaju tendenciju imati više ili manje topljivosti bilo u vodi ili u ulju. [ potreban je citat ] Emulgatori koji su topljiviji u vodi (i obrnuto, manje topljivi u ulju) općenito će stvarati emulzije ulje u vodi, dok će emulgatori koji su topljiviji u ulju stvarati emulzije voda u ulju. [19]

        Primjeri emulgatora hrane su:

          - u kojem je glavno emulgator i zgušnjivač lecitin. Zapravo, lecithos je grčka riječ za žumanjak. [20] - gdje razne kemikalije u sluzi koja okružuje ljusku sjemena djeluju kao emulgatori drugi emulgator i zgušnjivač - koriste čestice pod određenim okolnostima - ne izravno emulgator, [21] ali mijenjaju ponašanje drugih molekula, npr. kazein- uobičajeni emulgator koji se nalazi u mnogim prehrambenim proizvodima (krema za kavu, sladoledi, namazi, kruh, kolači) (esteri mono- i diglicerida diacetil vinske kiseline)- emulgator koji se prvenstveno koristi u pečenju
      • Jednostavna celuloza - emulgator čestica dobiven iz biljnog materijala koji koristi samo vodu - oni s hidrofilnim i hidrofobnim područjima, na pr. natrij kazeinat, kao u topljivom proizvodu od sira
      • Deterdženti su druga klasa tenzida, te će fizički djelovati i s uljem i s vodom, čime se stabilizira sučelje između ulja i kapljica vode u suspenziji. Ovo se načelo koristi u sapunu za uklanjanje masti u svrhu čišćenja. Mnogo različitih emulgatora koristi se u ljekarni za pripremu emulzija poput krema i losiona. Uobičajeni primjeri uključuju emulgirajući vosak, polisorbat 20 i ceteareth 20. [22]

        Ponekad sama unutarnja faza može djelovati kao emulgator, a rezultat je nanoemulzija, gdje se unutarnje stanje raspršuje u kapljice "nano-veličine" unutar vanjske faze. Poznati primjer ovog fenomena, "ouzo efekt", događa se kada se voda ulije u jako alkoholno piće na bazi anisa, poput ouza, pastisa, apsinta, araka ili rakije. Anizolični spojevi, koji su topljivi u etanolu, tada tvore kapljice nano veličine i emulgiraju se u vodi. Dobivena boja pića je neprozirna i mliječno bijela.

        U proces emulgiranja može biti uključeno više različitih kemijskih i fizičkih procesa i mehanizama: [5]

        • Teorija površinske napetosti - prema ovoj teoriji, emulgiranje se događa smanjenjem međufazne napetosti između dvije faze
        • Teorija odbijanja - emulgator stvara film u jednoj fazi koji tvori kugle, koje se međusobno odbijaju. Ova odbojna sila uzrokuje njihovo zadržavanje u disperzijskom mediju
        • Modifikacija viskoznosti - emulgenti poput bagrema i tragakanta, koji su hidrokoloidi, kao i PEG (ili polietilen glikol), glicerin i drugi polimeri poput CMC (karboksimetil celuloza), svi povećavaju viskoznost medija, što pomaže pri stvaranju i održavanju suspenzije kuglica disperzirane faze

        U hrani Edit

        Emulzije ulja u vodi uobičajene su u prehrambenim proizvodima:

        • Krema (pjena) u espressu-ulje kave u vodi (kuhana kava), nestabilni koloidni i umaci Hollandaise-to su emulzije ulja u vodi stabilizirane lecitinom žumanjka ili drugim vrstama dodataka hrani, poput natrijevog stearoil laktilata- emulzija mliječne masti u vodi, s mliječnim proteinima kao emulgatorom - emulzija biljnog ulja u octu, ako se priprema samo s uljem i octom (tj. bez emulgatora), rezultat je nestabilna emulzija

        Emulzije voda u ulju rjeđe su u hrani, ali ipak postoje:

        Drugu hranu možete pretvoriti u proizvode slične emulzijama, na primjer emulzija mesa je suspenzija mesa u tekućini koja je slična pravim emulzijama.

        Zdravstvena njega Edit

        U farmaciji, frizuri, osobnoj higijeni i kozmetici često se koriste emulzije. Obično su to emulzije ulja i vode, ali dispergirane, a koje su kontinuirane, u mnogim slučajevima ovise o farmaceutskoj formulaciji. Ove emulzije mogu se nazvati kreme, masti, linimenti (balzami), paste, filmovi ili tekućine, ovisno uglavnom o omjeru ulja i vode, drugim dodacima i njihovom namjeravanom načinu primjene. [23] [24] Prvih 5 su lokalni oblici doziranja i mogu se koristiti na površini kože, transdermalno, oftalmički, rektalno ili vaginalno. Vrlo tekuća emulzija također se može koristiti oralno ili se može ubrizgati u nekim slučajevima. [23]

        Mikroemulzije se koriste za isporuku cjepiva i ubijanje mikroba. [25] Tipične emulzije korištene u ovim tehnikama su nanoemulzije sojinog ulja, s česticama promjera 400–600 nm. [26] Postupak nije kemijski, kao kod drugih vrsta antimikrobnih tretmana, već mehanički. Što je kapljica manja, veća je površinska napetost, a time i veća sila potrebna za spajanje s drugim lipidima. Ulje se emulgira s deterdžentima pomoću miješalice s visokim smicanjem za stabilizaciju emulzije pa, kad naiđu na lipide u staničnoj membrani ili ovojnici bakterija ili virusa, prisiljavaju lipide da se spoje sami sa sobom. Masovno, zapravo, raspada membranu i ubija patogen. Emulzija sojinog ulja ne šteti normalnim ljudskim stanicama ili stanicama većine drugih viših organizama, s iznimkom stanica spermija i krvnih stanica, koje su osjetljive na nanoemulzije zbog osobitosti njihove membranske strukture. Iz tog se razloga ove nanoemulzije trenutno ne koriste intravenozno (IV). Najučinkovitija primjena ove vrste nanoemulzije je za dezinfekciju površina. Pokazalo se da neke vrste nanoemulzija učinkovito uništavaju uzročnike HIV-1 i tuberkuloze na neporoznim površinama.

        U gašenju požara Edit

        Emulgatori su učinkoviti u gašenju požara na malim, tankoslojnim izlijevanjima zapaljivih tekućina (požari klase B). Takva sredstva inkapsuliraju gorivo u emulziju gorivo-voda, zadržavajući tako zapaljive pare u vodenoj fazi. Ova emulzija postiže se primjenom vodene otopine surfaktanta na gorivo kroz mlaznicu pod visokim tlakom. Emulgatori nisu učinkoviti u gašenju velikih požara koji uključuju rasuta/duboka tekuća goriva, jer količina emulgatora potrebna za gašenje ovisi o volumenu goriva, dok druga sredstva, poput vodene pjene koja tvori film, trebaju pokriti samo površinu gorivo za ublažavanje para. [27]

        Kemijska sinteza Uredi

        Emulzije se koriste za proizvodnju polimernih disperzija - proizvodnja polimera u "fazi" emulzije ima niz prednosti procesa, uključujući sprječavanje koagulacije proizvoda. Proizvodi proizvedeni takvim polimerizacijama mogu se koristiti kao emulzije - proizvodi koji uključuju primarne komponente za ljepila i boje. Tim se postupkom proizvode i sintetički lateksi (guma).


        Gledaj video: Arnold weight gainer u0026 protein. कय weight gainer ह परटन ह pewdiepie (Lipanj 2022).


Komentari:

  1. Ordland

    Razumljiv odgovor

  2. Alden

    Ispričavam se, ali ne odgovaraju dovoljno. Možda postoje mogućnosti?

  3. Mezirg

    Ne bih rekao da koristite ovaj pristup i logiku, možete doći do takav delirij. Dakle, to ne vrijedi, ne vrijedi to ... ali, općenito, hvala, zaista je zanimljivo i ima o čemu razmišljati. Svi sretni praznici i svijetle ideje u Ng !!!!! Osvijetlimo 31.!

  4. Henbeddestr

    Ova poruka je neusporediva,))), sviđa mi se :)

  5. Mac A'bhaird

    Vrlo vrijedna ideja

  6. Stille

    To je izvanredan, prilično koristan komad

  7. Rosselin

    I can't help but believe you :)



Napišite poruku